פעילות אדג'ובנטית של Mycobacterium paratuberculosis בשיפור האימונוגניות של אוטואנטיגנים במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג’ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis שהומת בחום.
Abstract
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הנגרמת על ידי גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) דורשת חיסון על ידי פפטיד MOG המתחלב באדג’ובנט מלא של פרוינד (CFA) המכיל Mycobacterium tuberculosis בלתי פעיל. המרכיבים האנטיגניים של המיקובקטריום מפעילים תאים דנדריטיים כדי לעורר תאי T לייצר ציטוקינים המקדמים את תגובת Th1 באמצעות קולטנים דמויי אגרה. לכן, כמות ומינים של מיקובקטריה נוכחים במהלך האתגר האנטיגני קשורים ישירות להתפתחות EAE. מאמר שיטות זה מציג פרוטוקול חלופי להשראת EAE בעכברי C57BL/6 באמצעות אדג’ובנט לא שלם של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis זן K-10 שהומת בחום.
M. paratuberculosis, חבר בקומפלקס Mycobacterium avium, הוא הגורם הסיבתי למחלת ג’ון במעלי גירה וזוהה כגורם סיכון למספר הפרעות בתיווך תאי T אנושיים, כולל טרשת נפוצה. באופן כללי, עכברים שחוסנו בחיידק Mycobacterium paratuberculosis הראו התפרצות מוקדמת יותר וחומרת מחלה גבוהה יותר מאשר עכברים שחוסנו ב-CFA המכיל את הזן של M. tuberculosis H37Ra באותם מינונים של 4 מ”ג/מ”ל. הדטרמיננטים האנטיגניים של תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) זן K-10 הצליחו לגרום לתגובה תאית חזקה של Th1 במהלך שלב האפקטורים, המאופיינת במספר גבוה משמעותית של לימפוציטים מסוג T (CD4+ CD27+), תאים דנדריטיים (CD11c+ I-A/I-E+) ומונוציטים (CD11b+ CD115+) בטחול בהשוואה לעכברים שחוסנו ב-CFA. יתר על כן, נראה כי תגובת תאי T למפפטיד MOG הייתה הגבוהה ביותר בעכברים שחוסנו נגד M. paratuberculosis. השימוש באנצפליטוגן (למשל, MOG35-55) המתחלב באדג’ובנט המכיל M. paratuberculosis בניסוח עשוי להיות שיטה חלופית ומתוקפת להפעלת תאים דנדריטיים לפרימינג של תאי T ספציפיים לאפיטופ מיאלין CD4+ במהלך שלב האינדוקציה של EAE.
Introduction
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל נפוץ לחקר הפרעות דה-מיאלינציה בבני אדם1. ישנם מספר מודלים של EAE: חיסון פעיל באמצעות פפטידים שונים של מיאלין בשילוב עם אדג’ובנטים חזקים, חיסון פסיבי על ידי העברה חוץ גופית של לימפוציטים ספציפיים CD4+ למיאלין, ומודלים טרנסגניים של EAE2 ספונטני. לכל אחד מהמודלים הללו יש תכונות ספציפיות המאפשרות ללמוד היבטים שונים של EAE, כגון שלב ההתפרצות, שלב האפקט או השלב הכרוני. מודל הגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים של המיאלין (MOG) של EAE הוא מודל טוב לחקר המנגנונים בתיווך מערכת החיסון של דלקת עצבית כרונית ודמיאלינציה, שכן הוא מאופיין בחדירה דלקתית חד-גרעינית, דמיאלינציה בחומר הלבן ההיקפי והתאוששות מופחתת לאחר שיא המחלה1.
MOG-EAE מושרה על ידי חיסון עכברים רגישים עם הפפטיד MOG35-55 באדג’ובנט מלא של פרוינד (CFA), ואחריו הזרקה תוך צפקית של רעלן שעלת. זה מגביר את החדירות של מחסום הדם-מוח ומאפשר לתאי T ספציפיים למיאלין המופעלים בפריפריה להגיע למערכת העצבים המרכזית (CNS), שם הם יופעלו מחדש3. CFA ממלא תפקיד מפתח בהשראת EAE על ידי שיפור ספיגת האנטיגן על ידי תאים מציגי אנטיגן וביטוי ציטוקינים הקשורים לתגובות הומור ותאיות4. מנגנון זה נובע בעיקר מנוכחות של Mycobacterium tuberculosis מומת בשמן, שמרכיביו מספקים גירוי חזק למערכת החיסונית5. למעשה, השראת EAE קשורה ישירות לכמות המיקובקטריום הקיימת במהלך האתגר האנטיגני6.
התוספת של מיקובקטריה מומתת אחרת, כגון Mycobacterium butyricum, לאדג’ובנט7 של פרוינד, כמו גם ההשפעה של שילובים אדג’ובנטיים8, יכולה לווסת את המהלך הקליני של EAE וכתוצאה מכך להשפיע על יכולת השחזור של התוצאות. תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP), הסוכן האטיולוגי של מחלת ג’ון במעלי גירה, נקשר להפרעות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית 9 האנושית, שכן מרכיביו האנטיגניים מסוגלים לעורר תגובה הומוריסטית ותאית חזקה בחולים עם טרשת נפוצה והפרעת ספקטרום נוירומיאליטיס אופטיקה9. לכן, בפרוטוקול זה, אנו מראים שיטה חלופית וניתנת לשחזור להשראת MOG-EAE על ידי החלפת M. tuberculosis ב- CFA ב- M. paratuberculosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדגמנו פרוטוקול חלופי חזק לגרימת EAE חמור באופן פעיל בעכברי C57BL/6J באמצעות הפפטיד MOG35-55 המתחלב באדג’ובנט המכיל M. paratuberculosis10. השראת EAE בשיטה זו הביאה למחלה חמורה יותר מזו שנגרמה על ידי הפרוטוקול המשותף עם CFA. הבדל זה יכול לנבוע מהמרכיבים השומניים השונים בדופן התא של המיקו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו קיבלה תמיכה ממענק מהאגודה היפנית לקידום המדע (מענק מס. JP 23K14675).
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114 (2013).
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
