Summary
Ici, nous présentons un protocole alternatif pour induire activement l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez les souris C57BL / 6, en utilisant l’épitope immunogène myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 en suspension dans l’adjuvant de Freund incomplet contenant la sous-espèce paratuberculose de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.
Abstract
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) nécessite une immunisation par un peptide MOG émulsionné dans un adjuvant de Freund complet (CFA) contenant Mycobacterium tuberculosis. Les composants antigéniques de la mycobactérie activent les cellules dendritiques pour stimuler les cellules T à produire des cytokines qui favorisent la réponse Th1 via des récepteurs de type Toll. Par conséquent, la quantité et les espèces de mycobactéries présentes lors de la provocation antigénique sont directement liées au développement de l’EAE. Cet article sur les méthodes présente un protocole alternatif pour induire l’EAE chez les souris C57BL/6 à l’aide d’un adjuvant de Freund incomplet modifié contenant la souche K-10 de la sous-espèce Paratuberculosis de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.
M. paratuberculosis, membre du complexe Mycobacterium avium, est l’agent causal de la paratuberculose chez les ruminants et a été identifié comme un facteur de risque de plusieurs troubles induits par les lymphocytes T humains, y compris la sclérose en plaques. Dans l’ensemble, les souris immunisées avec Mycobacterium paratuberculosis ont montré une apparition plus précoce et une plus grande gravité de la maladie que les souris immunisées avec CFA contenant la souche H37Ra de M. tuberculosis aux mêmes doses de 4 mg/mL. Les déterminants antigéniques de la souche K-10 de la sous-espèce paratuberculeuse de Mycobacterium avium ont pu induire une forte réponse cellulaire Th1 pendant la phase effectrice, caractérisée par un nombre significativement plus élevé de lymphocytes T (CD4+ CD27+), de cellules dendritiques (CD11c+ I-A/I-E+) et de monocytes (CD11b+ CD115+) dans la rate comparativement aux souris immunisées par le CFA. De plus, la réponse proliférative des lymphocytes T au peptide MOG semblait être la plus élevée chez les souris immunisées contre M. paratuberculosis. L’utilisation d’un encéphalitogène (p. ex. MOG35-55) émulsionné dans un adjuvant contenant M. paratuberculosis dans la formulation peut être une méthode alternative et validée pour activer les cellules dendritiques pour amorcer les lymphocytes T CD4+ spécifiques de l’épitope de myéline pendant la phase d’induction de l’EAE.
Introduction
L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle commun pour l’étude des troubles démyélinisants humains1. Il existe plusieurs modèles d’EAE : immunisation active à l’aide de différents peptides de myéline en combinaison avec des adjuvants puissants, immunisation passive par transfert in vitro de lymphocytes CD4+ spécifiques de la myéline et modèles transgéniques d’EAE2 spontanée. Chacun de ces modèles présente des caractéristiques spécifiques qui permettent d’étudier différents aspects de l’EAE, tels que l’apparition, la phase effectrice ou la phase chronique. Le modèle de glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) de l’EAE est un bon modèle pour étudier les mécanismes à médiation immunitaire de la neuroinflammation chronique et de la démyélinisation, car il est caractérisé par une infiltration inflammatoire mononucléaire, une démyélinisation dans la substance blanche périphérique et une récupération réduite après le pic de la maladie1.
Le MOG-EAE est induit par l’immunisation de souris sensibles avec le peptide MOG35-55 dans l’adjuvant de Freund complet (CFA), suivie d’une injection intrapéritonéale de toxine coqueluche. Cela augmente la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et permet aux lymphocytes T spécifiques à la myéline activés à la périphérie d’atteindre le système nerveux central (SNC), où ils seront réactivés3. La CFA joue un rôle clé dans l’induction de l’EAE en améliorant l’absorption de l’antigène par les cellules présentatrices d’antigènes et l’expression des cytokines liées aux réponses humorales et à médiation cellulaire4. Ce mécanisme est principalement dû à la présence de Mycobacterium tuberculosis tué émulsionné dans l’huile, dont les composants fournissent un puissant stimulant pour le système immunitaire5. En fait, l’induction de l’EAE est directement liée à la quantité de mycobactérie présente lors du défi antigénique6.
L’ajout d’autres mycobactéries tuées, telles que Mycobacterium butyricum, à l’adjuvant de Freundincomplet 7, ainsi que l’effet des combinaisons adjuvantes8, peuvent moduler l’évolution clinique de l’EAE et par conséquent influencer la reproductibilité des résultats. Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis (MAP), l’agent étiologique de la paratuberculose chez les ruminants, a été associé à des troubles inflammatoires du SNC humain 9, car ses composants antigéniques sont capables de provoquer une forte réponse humorale et cellulaire chez les patients atteints de sclérose en plaques et de troubles du spectre de la neuromyélite optique9. Par conséquent, dans ce protocole, nous montrons une méthode alternative et reproductible pour induire MOG-EAE en remplaçant M. tuberculosis dans CFA par M. paratuberculosis.
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Protocol
Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université Juntendo (numéro d’approbation 290238) et ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health pour l’expérimentation animale.
1. Observations générales sur l’expérience
- Hébergez les souris dans des cages individuelles dans l’animalerie dans des conditions contrôlées et exemptes d’agents pathogènes à 23 °C ± 2 °C avec 50 % ± 10 % d’humidité, et un cycle lumière/obscurité de 12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.
- Injectez aux souris une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans antigène ni CFA, et utilisez-les comme témoins négatifs et positifs, respectivement.
2. Préparation des antigènes mycobactériens
- Cultiver la souche K-10 de M. paratuberculosis dans le milieu liquide 7H9 de Middlebrook enrichi de 10 % d’OADC (acide oléique, albumine, dextrose, catalase), de 0,005 % de Tween 80 et de 2 mg/L de mycobactine J pendant 2 semaines dans des flacons de culture tissulaire T25 à 37 °C. Évaluer régulièrement la croissance de la colonie par inspection visuelle.
MISE EN GARDE : Manipuler M. paratuberculosis dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). - Cultiver la culture d’enrichissement dans une fiole d’erlenmeyer de 500 mL avec une suspension de 1,7 × 105 unités formant colonies (UFC)/mL dans un volume final de 200 mL (même milieu que l’étape 2.1) dans un incubateur à agiter pendant 1 semaine.
REMARQUE : Comme les organismes contaminants peuvent affecter les résultats, les bactéries doivent être inoculées sur un milieu solide Middlebrook 7H10 pour déterminer la morphologie de la colonie et vérifier la pureté par des trousses de détection conventionnelles de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour M. paratuberculosis. - Inactiver les suspensions bactériennes pendant 5-10 min à 70 °C et centrifuger à 3 000 × g pendant 10 min. Lavez deux fois la pastille pesée dans du PBS, perturbez-la par sonication et stockez-la à -20 °C.
- Transférer la pastille dans un récipient stérile et la congeler avec de la glace sèche ou de l’azote liquide. Transférer immédiatement dans une chambre de lyophilisation.
- Lyophiliser (4 h à -50 °C sous vide) M. paratuberculosis selon le manuel de la machine.
- À la fin de la lyophilisation, retirez le récipient en acier inoxydable du lyophilisateur et transférez-le sur un banc de nettoyage biologique. Utilisez une spatule en acier inoxydable pour déloger les morceaux de MAP séchés adhérant à la paroi intérieure du contenant en acier inoxydable et pulvérisez-les aussi finement que possible.
- Peser les cellules pulvérisées à l’aide d’une balance électronique et les placer manuellement dans un flacon aseptique de 10 mL à une concentration de 10 mg/mL.
NOTE: La densité cellulaire a été quantifiée en grammes de poids sec par litre d’échantillon. Après 3 semaines, 1 mg (poids humide) de pastille cellulaire bactérienne contient environ 2,5 × 108 UFC.
3. Préparation de l’émulsion MOG 35-55
- Broyer le contenu d’un flacon de M. paratuberculosis séché (10 mg) en poudre fine avec un mortier et un pilon et ajouter 10 mL à l’adjuvant de Freund incomplet pour obtenir une solution mère de 10 mg/mL. Conserver à -4 °C.
- Avant l’immunisation, diluer la solution mère jusqu’à une concentration finale de 4 mg/mL.
- Diluer le peptide MOG35-55 dans duddH2Ojusqu’à obtention d’une concentration finale de 2 mg/mL et conserver à -20 °C.
- À l’aide d’un homogénéisateur, mélanger la solution MOG35-55 (2 mg/mL) avec un volume égal d’adjuvant (4 mg/mL) de l’étape 3.2 dans un tube de 5 mL jusqu’à formation d’une émulsion épaisse. Toutes les 10 s de mélange, placer la solution sur de la glace pendant 20 s et faire tourner le tube pour récupérer toute la solution.
- Transférer l’émulsion dans une seringue de 1 mL, retirer tout l’air et ajouter une aiguille de 27 G. L’émulsion est maintenant prête pour l’injection.
NOTE. Étant donné qu’une certaine perte de l’émulsion visqueuse de MOG35-55 se produit pendant la préparation, il est préférable de préparer 1,5 fois la quantité nécessaire.
4. Immunisation des animaux
- Anesthésier les animaux par inhalation d’isoflurane afin de minimiser le stress sur les animaux.
- Injecter l’émulsion (200 μL contenant 200 μg/souris de MOG35-55) par voie sous-cutanée dans le bas du dos.
- Administrer une dose de toxine anticoqueluche (100 μL contenant 200 ng/souris) par voie intrapéritonéale aux jours 0 et 2 suivant l’immunisation.
ATTENTION : La toxine de la coqueluche a un effet suppresseur multiple sur le système immunitaire; Éviter l’ingestion et le contact avec les yeux et la peau.
5. Évaluation clinique
- Surveillez quotidiennement le poids des souris et les signes cliniques. Utilisez le système de notation suivant : 0 = aucun signe clinique; 1 = queue flasque; 2 = altération du réflexe de redressement et faiblesse des membres postérieurs; 3 = paralysie complète des membres postérieurs; 4 = paralysie complète des membres postérieurs avec paralysie partielle des membres antérieurs; 5 = moribond.
REMARQUE : Lors de l’observation initiale des signes cliniques, les animaux bénéficient d’un accès accru à l’eau et à la nourriture. Le chow de rongeurs est ramolli et humidifié, puis placé sur le sol de la cage à partir de la trémie de nourriture. Dans le cas des animaux déshydratés, une supplémentation en liquide sous-cutané est administrée ou une suspension de chow de rongeur est administrée par gavage oral. Si une souris a besoin de ce type d’assistance pendant plus de 3 jours, l’euthanasie sera effectuée. - Pour éviter ou minimiser la douleur et la détresse chez l’animal, utilisez les critères humains suivants : perte de poids corporel supérieure à 20 %, score clinique ≥4,0, absence du réflexe de redressement au score 3 et lorsque l’animal est incapable d’accéder à de la nourriture ou à de l’eau pendant 24 heures.
NOTE: Les souris ont été euthanasiées le jour 30 après l’induction de l’EAE par injections intrapéritonéales de pentobarbital (≥150 mg / kg).
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Representative Results
Des groupes de souris C57BL/6 (n total = 15/groupe) ont été immunisés avec MOG35-55 dans une émulsion contenant M. paratuberculosis ou par la méthode commune avec CFA. Tous les groupes de souris ont manifesté une maladie monophasique aiguë caractérisée par un seul pic d’incapacité observé à 14-17 jours, suivi d’une récupération partielle des symptômes au cours des 10 jours suivants (Figure 1A). Les souris immunisées avec l’adjuvant contenant M. paratuberculosis, quel que soit leur sexe, ont montré une apparition plus précoce de 8 à 9 jours après l’immunisation et une plus grande gravité dans la phase aiguë que les souris immunisées avec le CFA (figure 1B). Il n’y avait pas de différence significative de poids corporel entre les groupes (figure 1C). L’analyse cytofluorimétrique des cellules de rate de souris EAE et l’activité proliférative des lymphocytes T évaluée par incorporation de 3H-thymidine ont été réalisées, comme publié précédemment11. Toutes les cellules de rate des souris EAE, quel que soit l’adjuvant utilisé, ont montré une forte réponse proliférative au peptide MOG35-55, alors qu’elles n’ont pas proliféré en réponse à l’ovalbumine peptidique témoin (Figure 1D). Les souris EAE immunisées par M. paratuberculosis-immunisées présentaient une proportion accrue de lymphocytes T (CD4+ CD27+), de cellules dendritiques (CD11c+I-A/I-E+) et de monocytes (CD11b+CD115+) dans la rate par rapport aux souris immunisées contre la CFA pendant la phase aiguë de l’EAE (Figure 1E). L’analyse histologique par hématoxyline-éosine a révélé une infiltration inflammatoire mononucléaire périvasculaire et méningée typique dans le cerveau et la moelle épinière (Figure 1F).
Figure 1 : Résultats représentatifs de l’EAE. (A) Scores cliniques de souris évalués quotidiennement; (B) différences dans l’évolution de la maladie; C) le poids corporel; (D) réponse proliférative des lymphocytes T au peptide MOG35-55; (E) populations de cellules immunitaires dans les splénocytes pendant la phase aiguë; (F) images histologiques de coupes de moelle épinière (grossissement 4x) colorées à l’hématoxyline-éosine (barre d’échelle = 200 μm) pendant la phase aiguë. Les flèches indiquent des infiltrats inflammatoires. Les données montrent les résultats combinés de trois expériences indépendantes (n = 5 souris/groupe/expérience). Les données sont exprimées sous forme d’écart type moyen ± calculé à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Bonferroni ou du test U de Mann-Whitney. Abréviations : EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale; MOG = glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; CFA = adjuvant de Freund complet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons démontré un protocole alternatif robuste pour induire activement une EAE sévère chez les souris C57BL/6J en utilisant le peptide MOG35-55 émulsionné dans un adjuvant contenant M. paratuberculosis10. L’induction de l’EAE par cette méthode a entraîné une maladie plus sévère que celle induite par le protocole commun avec le CFA. Cette différence pourrait être due aux différents composants lipidiques dans la paroi cellulaire des mycobactéries11. En fait, contrairement à d’autres mycobactéries, M. paratuberculosis produit un antigène lipopentapeptidique à la surface de la paroi cellulaire au lieu de glycopeptidolipides11. Ce lipopentapeptide n’a pas réagi de manière croisée avec d’autres espèces étroitement apparentées et s’est avéré être une cible pour une forte réponse humorale spécifique chez les patients atteints de maladies auto-immunes12. Les mycobactéries possèdent des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes qui jouent différents rôles dans les réponses immunitaires9. Par exemple, nous avons récemment montré que l’immunisation orale avec M. paratuberculosis augmente la sévérité du MOG-EAE13, alors que la vaccination par le bacille de Calmette-Guérin (BCG)-Tokyo-172 semble avoir un rôle protecteur dans la progression des modèles EAE actifs et spontanés14.
Les limites potentielles du protocole comprennent l’évolution monophasique auto-limitée de l’EAE, qui peut devenir chronique si les concentrations de mycobactérie dans l’adjuvant et la toxine de la coqueluche sont doublées. Cet aspect est très important à considérer, en particulier lors de l’étude de l’aspect neurodégénératif de l’EAE à l’aide de souris knockout, car l’absence de phase de récupération peut être causée par les fortes doses des réactifs utilisés et non par le manque de fonction de certains gènes. En outre, bien que le protocole décrit ci-dessus puisse être appliqué à d’autres protocoles EAE en faisant varier les souches et l’âge des souris ou le type et la quantité de protéines, pour s’assurer que les expériences EAE sont effectuées d’une manière méthodologiquement correcte, les groupes expérimentaux doivent être appariés pour l’âge et le sexe.
Étant donné que l’incidence de la maladie peut varier, les recommandations de dépannage sont les suivantes : la concentration optimale de M. paratuberculosis peut varier de 2 à 4 mg/mL, et un connecteur à trois voies peut être utilisé pour mélanger de petits volumes de l’antigène en phase aqueuse. Nous avons décrit une méthode de préparation de l’émulsion à l’aide d’un homogénéisateur; Cependant, une méthode alternative et simple pour mélanger de petits volumes d’antigène dans la phase aqueuse, dans la phase huileuse, implique l’utilisation d’un raccord de connecteur à trois voies, auquel deux seringues en verre sont connectées. En conclusion, nous avons identifié M. paratuberculosis comme un puissant adjuvant candidat dans l’induction de l’EAE active. D’autres études sur le mode d’action et le type d’immunité induite chez différentes espèces animales augmenteront la confiance dans la possibilité d’adopter cette méthode alternative pour comprendre le mécanisme de la neuroinflammation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a reçu le soutien d’une subvention de la Société japonaise pour la promotion de la science (subvention no. JP 23K14675).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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