Summary
Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l'encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l'epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) 35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.
Abstract
L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) indotta dalla glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) richiede l'immunizzazione con un peptide MOG emulsionato in adiuvante completo di Freund (CFA) contenente Mycobacterium tuberculosis inattivato. I componenti antigenici del micobatterio attivano le cellule dendritiche per stimolare le cellule T a produrre citochine che promuovono la risposta Th1 attraverso i recettori toll-like. Pertanto, la quantità e la specie di micobatteri presenti durante la sfida antigenica sono direttamente correlate allo sviluppo di EAE. Questo documento sui metodi presenta un protocollo alternativo per indurre EAE in topi C57BL / 6 utilizzando un adiuvante di Freund incompleto modificato contenente il ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis ucciso dal calore.
M. paratuberculosis, un membro del complesso Mycobacterium avium, è l'agente eziologico della malattia di Johne nei ruminanti ed è stato identificato come un fattore di rischio per diverse malattie umane mediate da cellule T, tra cui la sclerosi multipla. Nel complesso, i topi immunizzati con Mycobacterium paratuberculosis hanno mostrato un esordio precoce e una maggiore gravità della malattia rispetto ai topi immunizzati con CFA contenenti il ceppo di M. tuberculosis H37Ra alle stesse dosi di 4 mg/ml. I determinanti antigenici del ceppo K-10 della sottospecie di Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) sono stati in grado di indurre una forte risposta cellulare Th1 durante la fase effettrice, caratterizzata da un numero significativamente più elevato di linfociti T (CD4+ CD27+), cellule dendritiche (CD11c+ I-A/I-E+) e monociti (CD11b+ CD115+) nella milza rispetto ai topi immunizzati con CFA. Inoltre, la risposta proliferativa delle cellule T al peptide MOG sembrava essere più alta nei topi immunizzati con M. paratubercolosi. L'uso di un encefalogeno (ad esempio, MOG35-55) emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis nella formulazione può essere un metodo alternativo e convalidato per attivare le cellule dendritiche per l'innesco delle cellule T CD4+ specifiche dell'epitopo mielinico durante la fase di induzione dell'EAE.
Introduction
L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello comune per lo studio dei disturbi demielinizzanti umani1. Esistono diversi modelli di EAE: immunizzazione attiva utilizzando diversi peptidi di mielina in combinazione con potenti adiuvanti, immunizzazione passiva mediante trasferimento in vitro di linfociti CD4+ specifici della mielina e modelli transgenici diEAE 2 spontanei. Ognuno di questi modelli ha caratteristiche specifiche che consentono di studiare diversi aspetti dell'EAE, come l'insorgenza, la fase effettrice o la fase cronica. Il modello di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) di EAE è un buon modello per studiare i meccanismi immuno-mediati della neuroinfiammazione cronica e della demielinizzazione, poiché è caratterizzato da infiltrazione infiammatoria mononucleare, demielinizzazione nella sostanza bianca periferica e ridotto recupero dopoil picco 1 della malattia.
MOG-EAE è indotta dall'immunizzazione di topi sensibili con il peptide MOG35-55 in adiuvante completo di Freund (CFA), seguito da un'iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse. Ciò aumenta la permeabilità della barriera emato-encefalica e consente alle cellule T mielina-specifiche attivate nella periferia di raggiungere il sistema nervoso centrale (SNC), dove saranno riattivate3. Il CFA svolge un ruolo chiave nell'induzione dell'EAE migliorando l'assorbimento dell'antigene da parte delle cellule presentanti l'antigene e l'espressione di citochine correlate alle risposte umorali e cellulo-mediate4. Questo meccanismo è dovuto principalmente alla presenza di Mycobacterium tuberculosis ucciso emulsionato nell'olio, i cui componenti forniscono un forte stimolo per il sistema immunitario5. Infatti, l'induzione di EAE è direttamente correlata alla quantità di micobatterio presente durante la sfida antigenica6.
L'aggiunta di altri micobatteri uccisi, come il Mycobacterium butyricum, all'adiuvante7 incompleto di Freund, così come l'effetto delle combinazioni adiuvanti8, possono modulare il decorso clinico dell'EAE e di conseguenza influenzare la riproducibilità dei risultati. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), l'agente eziologico della malattia di Johne nei ruminanti, è stato associato a disturbi infiammatori del SNC umano 9, poiché i suoi componenti antigenici sono in grado di suscitare una forte risposta umorale e cellulo-mediata in pazienti con sclerosi multipla e neuromielite ottica dello spettro9. Pertanto, in questo protocollo, mostriamo un metodo alternativo e riproducibile per indurre MOG-EAE sostituendo M. tuberculosis in CFA con M. paratuberculosis.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Juntendo University School of Medicine (numero di approvazione 290238) e sono stati condotti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per la sperimentazione animale.
1. Osservazioni generali sull'esperimento
- Ospitare i topi in gabbie individuali nella struttura per animali in condizioni controllate e prive di agenti patogeni a 23 °C ± 2 °C con 50% ± 10% di umidità e un ciclo luce/buio di 12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua.
- Iniettare i topi con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) senza antigene e CFA e usarli rispettivamente come controlli negativi e positivi.
2. Preparazione di antigeni micobatterici
- Coltivare il ceppo M. paratuberculosis K-10 in mezzo liquido Middlebrook 7H9 arricchito con il 10% di OADC (acido oleico, albumina, destrosio, catalasi), 0,005% Tween 80 e 2 mg/L di micobactina J per 2 settimane in matraccio di coltura tissutale T25 a 37 °C. Valutare regolarmente la crescita della colonia mediante ispezione visiva.
ATTENZIONE: Maneggiare M. paratuberculosis in una struttura di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). - Coltivare il matraccio Erlenmeyer da 500 mL di arricchimento con una sospensione di 1,7 × 105 unità formanti colonie (CFU)/ml in un volume finale di 200 mL (stesso mezzo del punto 2.1) in un incubatore agitatore per 1 settimana.
NOTA: Poiché gli organismi contaminanti possono influenzare i risultati, i batteri devono essere inoculati su terreni solidi Middlebrook 7H10 per determinare la morfologia della colonia e per verificare la purezza mediante kit convenzionali di rilevamento della reazione a catena della polimerasi (PCR) per M. paratuberculosis. - Inattivare le sospensioni batteriche per 5-10 minuti a 70 °C e centrifugare a 3.000 × g per 10 minuti. Lavare il pellet pesato in PBS due volte, interrompere con la sonicazione e conservare a -20 °C.
- Trasferire il pellet in un contenitore sterile e congelarlo con ghiaccio secco o azoto liquido. Trasferire immediatamente in una camera di liofilizzazione.
- Liofilizzazione (4 h a -50 °C sotto vuoto) M. paratubercolosi secondo il manuale della macchina.
- Al termine della liofilizzazione, rimuovere il contenitore in acciaio inossidabile dal liofilizzatore e trasferirlo in un banco di biopulizia. Utilizzare una spatola in acciaio inossidabile per rimuovere i grumi MAP essiccati che aderiscono alla parete interna del contenitore in acciaio inossidabile e polverizzarli il più finemente possibile.
- Pesare le cellule polverizzate utilizzando una bilancia elettronica e metterle manualmente in un flaconcino asettico da 10 mL ad una concentrazione di 10 mg/ml.
NOTA: La densità cellulare è stata quantificata in grammi di peso secco per litro di campione. Dopo 3 settimane, 1 mg (peso umido) di pellet cellulare batterico contiene circa 2,5 × 108 CFU.
3. Preparazione dell'emulsione MOG 35-55
- Macinare il contenuto di un flaconcino di M. paratuberculosis essiccato (10 mg) in polvere fine con mortaio e pestello e aggiungere 10 mL all'adiuvante incompleto di Freund per ottenere una soluzione madre da 10 mg/ml. Conservare a -4 °C.
- Prima dell'immunizzazione, diluire la soluzione madre fino a una concentrazione finale di 4 mg/ml.
- Diluire il peptide MOG35-55 in ddH 2 O ad una concentrazione finale di2mg/ml e conservare a -20 °C.
- Utilizzando un omogeneizzatore, mescolare la soluzione MOG35-55 (2 mg/ml) con un volume uguale di adiuvante (4 mg/ml) dal punto 3.2 in un tubo da 5 mL fino a formare un'emulsione densa. Dopo ogni 10 secondi di miscelazione, posizionare la soluzione su ghiaccio per 20 s e ruotare il tubo per recuperare tutta la soluzione.
- Trasferire l'emulsione in una siringa da 1 ml, rimuovere tutta l'aria e aggiungere un ago da 27 G. L'emulsione è ora pronta per l'iniezione.
NOTA. Poiché durante la preparazione si verifica una certa perdita dell'emulsione viscosa di MOG35-55 , è meglio preparare 1,5 volte la quantità necessaria.
4. Immunizzazione animale
- Anestetizzare gli animali con inalazione di isoflurano per ridurre al minimo lo stress sugli animali.
- Iniettare l'emulsione (200 μL contenenti 200 μg/topo di MOG35-55) per via sottocutanea nella parte bassa della schiena.
- Somministrare una dose di tossina della pertosse (100 μL contenenti 200 ng/topo) per via intraperitoneale nei giorni 0 e 2 dopo l'immunizzazione.
ATTENZIONE: La tossina della pertosse ha un effetto soppressivo multiplo sul sistema immunitario; Evitare l'ingestione e il contatto con gli occhi e la pelle.
5. Valutazione clinica
- Monitorare i topi quotidianamente per il peso e i segni clinici. Utilizzare il seguente sistema di punteggio: 0 = nessun segno clinico; 1 = coda flaccida; 2 = compromissione del riflesso raddrizzante e debolezza degli arti posteriori; 3 = paralisi completa degli arti posteriori; 4 = paralisi completa degli arti posteriori con paralisi parziale degli arti anteriori; 5 = moribondo.
NOTA: Dopo l'osservazione iniziale dei segni clinici, agli animali viene fornito un maggiore accesso all'acqua e al cibo. Il chow del roditore viene ammorbidito e inumidito, quindi posto sul pavimento della gabbia dalla tramoggia del cibo. Nel caso di animali disidratati, viene somministrata un'integrazione di liquido sottocutaneo o viene somministrato un impasto di roditore tramite sonda orale. Se un topo ha bisogno di questo tipo di assistenza per più di 3 giorni, verrà condotta l'eutanasia. - Per evitare o ridurre al minimo il dolore e l'angoscia degli animali, utilizzare i seguenti endpoint umani: perdita di peso corporeo superiore al 20%, punteggio clinico ≥4,0, assenza del riflesso raddrizzante al punteggio 3 e quando l'animale non è in grado di accedere al mangime o all'acqua per 24 ore.
NOTA: I topi sono stati sottoposti a eutanasia il giorno 30 dopo l'induzione di EAE mediante iniezioni intraperitoneali di pentobarbital (≥150 mg / kg).
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Representative Results
Gruppi di topi C57BL/6 (totale n = 15/gruppo) sono stati immunizzati con MOG35-55 in un'emulsione contenente M. paratubercolosi o con il metodo comune con CFA. Tutti i gruppi di topi hanno manifestato una malattia monofasica acuta caratterizzata da un singolo picco di disabilità osservato a 14-17 giorni, seguito da un parziale recupero dei sintomi nei successivi 10 giorni (Figura 1A). I topi immunizzati con l'adiuvante contenente M. paratuberculosis, indipendentemente dal sesso, hanno mostrato un esordio più precoce da 8 a 9 giorni dopo l'immunizzazione e una maggiore gravità nella fase acuta rispetto ai topi immunizzati con CFA (Figura 1B). Non c'era alcuna differenza significativa nel peso corporeo tra i gruppi (Figura 1C). Sono state eseguite analisi citofluorimetriche di cellule di milza da topi EAE e attività proliferativa dei linfociti T valutati mediante incorporazione di 3H-timidina, come precedentemente pubblicato11. Tutte le cellule della milza dei topi EAE, indipendentemente dall'adiuvante utilizzato, hanno mostrato una forte risposta proliferativa al peptide MOG35-55, mentre non proliferavano in risposta al peptide di controllo ovalbumina (Figura 1D). I topi EAE immunizzati con M. paratubercolosi hanno mostrato una maggiore percentuale di linfociti T (CD4+ CD27+), cellule dendritiche (CD11c+I-A/I-E+) e monociti (CD11b+CD115+) nella milza rispetto ai topi immunizzati CFA durante la fase acuta dell'EAE (Figura 1E). L'analisi istologica mediante ematossilina-eosina ha rivelato una tipica infiltrazione infiammatoria mononucleare perivascolare e meningea nel cervello e nel midollo spinale (Figura 1F).
Figura 1: Risultati EAE rappresentativi. (A) punteggi clinici di topi valutati giornalmente; (B) differenze nel decorso della malattia; (C) peso corporeo; (D) risposta proliferativa delle cellule T al peptide MOG35-55 ; E) popolazioni di cellule immunitarie negli splenociti durante la fase acuta; (F) immagini istologiche di sezioni del midollo spinale (ingrandimento 4x) colorate con ematossilina-eosina (barra della scala = 200 μm) durante la fase acuta. Le frecce indicano infiltrati infiammatori. I dati mostrano i risultati combinati di tre esperimenti indipendenti (n = 5 topi / gruppo / esperimento). I dati sono espressi come deviazione media ± standard calcolata utilizzando un ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Bonferroni o dal test U di Mann-Whitney. Abbreviazioni: EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; MOG = glicoproteina oligodendrocitaria della mielina; PBS = soluzione salina tamponata fosfato; CFA = coadiuvante completo di Freund. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Abbiamo dimostrato un robusto protocollo alternativo per indurre attivamente EAE grave in topi C57BL / 6J utilizzando il peptide MOG35-55 emulsionato in un adiuvante contenente M. paratuberculosis10. L'induzione di EAE con questo metodo ha provocato una malattia più grave di quella indotta dal protocollo comune con CFA. Questa differenza potrebbe essere dovuta alle diverse componenti lipidiche nella parete cellulare dei micobatteri11. Infatti, a differenza di altri micobatteri, M. paratuberculosis produce un antigene lipopentapeptide sulla superficie della parete cellulare invece di glicopeptidolipidi11. Questo lipopentapeptide non ha reagito in modo incrociato con altre specie strettamente correlate e ha dimostrato di essere un bersaglio per una forte risposta umorale specifica nei pazienti con disturbi autoimmuni12. I micobatteri possiedono modelli molecolari associati ai patogeni che svolgono ruoli diversi nelle risposte immunitarie9. Ad esempio, abbiamo recentemente dimostrato che l'immunizzazione orale con M. paratuberculosis aumenta la gravità di MOG-EAE13, mentre la vaccinazione con bacillo Calmette-Guerin (BCG)-Tokyo-172 sembra avere un ruolo protettivo nella progressione dei modelli EAE attivi e spontanei14.
I potenziali limiti del protocollo includono il decorso monofasico autolimitato di EAE, che può diventare cronico se le concentrazioni di micobatterio nell'adiuvante e nella tossina della pertosse sono raddoppiate. Questo aspetto è molto importante da considerare, soprattutto quando si studia l'aspetto neurodegenerativo dell'EAE utilizzando topi knockout, in quanto l'assenza di fase di recupero può essere causata dalle alte dosi dei reagenti utilizzati e non dalla mancanza di funzione di alcuni geni. Inoltre, sebbene il protocollo sopra descritto possa essere applicato ad altri protocolli EAE variando i ceppi e l'età dei topi o il tipo e la quantità di proteine, per garantire che gli esperimenti EAE siano eseguiti in modo metodologicamente corretto, i gruppi sperimentali devono essere abbinati per età e sesso.
Poiché l'incidenza della malattia può variare, le raccomandazioni per la risoluzione dei problemi sono: la concentrazione ottimale di M. paratubercolosi può variare da 2 a 4 mg / ml e un connettore a tre vie può essere utilizzato per miscelare piccoli volumi dell'antigene nella fase acquosa. Abbiamo descritto un metodo per preparare l'emulsione utilizzando un omogeneizzatore; Tuttavia, un metodo alternativo e semplice per miscelare piccoli volumi di antigene nella fase acquosa, nella fase oleosa, prevede l'uso di un raccordo connettore a tre vie, a cui sono collegate due siringhe di vetro. In conclusione, abbiamo identificato M. paratuberculosis come un potente candidato adiuvante nell'induzione di EAE attivi. Ulteriori studi sulla modalità d'azione e sul tipo di immunità indotta in diverse specie animali aumenteranno la fiducia nella possibilità di adottare questo metodo alternativo per comprendere il meccanismo della neuroinfiammazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro ha ricevuto il sostegno di una sovvenzione della Società giapponese per la promozione della scienza (sovvenzione n. JP 23K14675).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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