Summary
Her præsenterer vi en alternativ protokol til aktivt at inducere eksperimentel autoimmun encephalomyelitis i C57BL/6-mus ved hjælp af den immunogene epitop myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG)35-55 suspenderet i ufuldstændig Freunds adjuvans indeholdende den varmedræbte Mycobacterium avium underart paratuberculosis.
Abstract
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) induceret af myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG) kræver immunisering af et MOG-peptid emulgeret i komplet Freunds adjuvans (CFA) indeholdende inaktiveret Mycobacterium tuberculosis. De antigene komponenter i mycobakterien aktiverer dendritiske celler for at stimulere T-celler til at producere cytokiner, der fremmer Th1-responset via toll-lignende receptorer. Derfor er mængden og arten af mykobakterier, der er til stede under den antigene udfordring, direkte relateret til udviklingen af EAE. Dette metodepapir præsenterer en alternativ protokol til at inducere EAE i C57BL/6-mus ved hjælp af en modificeret ufuldstændig Freunds adjuvans indeholdende den varmedræbte Mycobacterium avium-underart paratuberkulosestamme K-10.
M. paratuberculosis, et medlem af Mycobacterium avium-komplekset, er årsagsmidlet til Johnes sygdom hos drøvtyggere og er blevet identificeret som en risikofaktor for flere humane T-cellemedierede lidelser, herunder multipel sklerose. Samlet set viste mus immuniseret med Mycobacterium paratuberculosis tidligere debut og større sygdomssværhedsgrad end mus immuniseret med CFA indeholdende stammen af M. tuberculosis H37Ra i de samme doser på 4 mg / ml. De antigene determinanter for Mycobacterium avium underarter paratuberculosis (MAP) stamme K-10 var i stand til at inducere et stærkt Th1-cellulært respons under effektorfasen, kendetegnet ved signifikant højere antal T-lymfocytter (CD4 + CD27 +), dendritiske celler (CD11c + I-A / I-E +) og monocytter (CD11b + CD115+) i milten sammenlignet med mus immuniseret med CFA. Desuden syntes det proliferative T-cellerespons på MOG-peptidet at være højest hos M. paratuberculosis-immuniserede mus. Anvendelsen af et encephalitogen (f.eks. MOG35-55) emulgeret i en adjuvans indeholdende M. paratuberculosis i formuleringen kan være en alternativ og valideret metode til aktivering af dendritiske celler til priming af myelinepitopspecifikke CD4+ T-celler under induktionsfasen af EAE.
Introduction
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en fælles model til undersøgelse af humane demyeliniserende lidelser1. Der er flere modeller af EAE: aktiv immunisering ved anvendelse af forskellige myelinpeptider i kombination med potente adjuvanser, passiv immunisering ved in vitro-overførsel af myelinspecifikke CD4 + lymfocytter og transgene modeller af spontan EAE2. Hver af disse modeller har specifikke funktioner, der gør det muligt at studere forskellige aspekter af EAE, såsom starten, effektorfasen eller den kroniske fase. Myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG) modellen af EAE er en god model til at studere de immunmedierede mekanismer for kronisk neuroinflammation og demyelinisering, da den er karakteriseret ved mononukleær inflammatorisk infiltration, demyelinering i perifer hvid substans og reduceret genopretning efter sygdommens top1.
MOG-EAE induceres ved immunisering af modtagelige mus med peptidet MOG35-55 i komplet Freunds adjuvans (CFA) efterfulgt af en intraperitoneal injektion af kighostetoksin. Dette øger permeabiliteten af blod-hjerne-barrieren og tillader myelinspecifikke T-celler aktiveret i periferien at nå centralnervesystemet (CNS), hvor de vil blive genaktiveret3. CFA spiller en central rolle i induktionen af EAE ved at øge antigenoptagelsen af antigenpræsenterende celler og ekspressionen af cytokiner relateret til humoral- og cellemedierede reaktioner4. Denne mekanisme skyldes hovedsageligt tilstedeværelsen af dræbt Mycobacterium tuberculosis emulgeret i olie, hvis komponenter giver en stærk stimulus til immunsystemet5. Faktisk er induktionen af EAE direkte relateret til mængden af mycobacterium, der er til stede under den antigene udfordring6.
Tilsætningen af andre dræbte mykobakterier, såsom Mycobacterium butyricum, til ufuldstændig Freunds adjuvans7 samt effekten af adjuvanskombinationer8 kan modulere EAE's kliniske forløb og følgelig påvirke resultaternes reproducerbarhed. Mycobacterium avium underarter paratuberculosis (MAP), det ætiologiske middel til Johnes sygdom hos drøvtyggere, har været forbundet med inflammatoriske lidelser hos den humane CNS 9, da dets antigene komponenter er i stand til at fremkalde et stærkt humoral- og cellemedieret respons hos patienter med multipel sklerose og neuromyelitis optica spektrumforstyrrelse9. Derfor viser vi i denne protokol en alternativ og reproducerbar metode til at inducere MOG-EAE ved at erstatte M. tuberculosis i CFA med M. paratuberculosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Juntendo University School of Medicine (godkendelsesnummer 290238) og blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guidelines for Animal Experimentation.
1. Generelle bemærkninger til eksperimentet
- Anstald musene i individuelle bure i dyrefaciliteten under kontrollerede, patogenfrie forhold ved 23 °C ± 2 °C med 50 % ± 10 % fugtighed og en 12 timers lys/mørk cyklus med ad libitum adgang til mad og vand.
- Injicer musene med fosfatbufret saltvand (PBS) uden antigen og CFA, og brug dem som henholdsvis negative og positive kontroller.
2. Fremstilling af mykobakterielle antigener
- Dyrk M. paratuberculosis K-10-stammen i Middlebrook flydende medium 7H9 beriget med 10% OADC (oliesyre, albumin, dextrose, katalase), 0,005% Tween 80 og 2 mg / L mycobactin J i 2 uger i T25 vævskulturkolber ved 37 ° C. Vurder koloniens vækst regelmæssigt ved visuel inspektion.
FORSIGTIG: Håndter M. paratuberculosis i et biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) facilitet. - Berigelseskulturen dyrkes i 500 ml Erlenmeyerkolbe med en suspension på 1,7 × 105 kolonidannende enheder (CFU)/ml i et slutvolumen på 200 ml (samme medium som trin 2.1) i en rysteinkubator i 1 uge.
BEMÆRK: Da kontaminerende organismer kan påvirke resultaterne, skal bakterierne podes på Middlebrook 7H10 faste medier for at bestemme kolonimorfologi og for at verificere renhed ved konventionelle polymerasekædereaktionssæt (PCR) til påvisning af M. paratuberculosis. - Inaktiver bakteriesuspensionerne i 5-10 minutter ved 70 °C og centrifuger ved 3.000 × g i 10 minutter. Vasket den vejede pellet i PBS to gange, afbrydes ved sonikering og opbevares ved -20 °C.
- Overfør pelleten til en steril beholder og frys den med tøris eller flydende nitrogen. Overfør straks til et frysetørrekammer.
- Frysetør (4 timer ved -50 °C under vakuum) M. paratuberkulose i henhold til maskinmanualen.
- Ved afslutningen af frysetørringen fjernes beholderen i rustfrit stål fra frysetørreren og overføres til en biorensende bænk. Brug en spatel i rustfrit stål til at løsne de tørrede MAP-klumper, der klæber til den indvendige væg i beholderen i rustfrit stål, og pulveriser dem så fint som muligt.
- De pulveriserede celler vejes ved hjælp af en elektronisk vægt og anbringes manuelt i et aseptisk 10 ml hætteglas i en koncentration på 10 mg/ml.
BEMÆRK: Celletætheden blev kvantificeret som gram tørvægt pr. Liter prøve. Efter 3 uger indeholder 1 mg (vådvægt) bakteriecellepellet ca. 2,5 × 108 CFU.
3. Fremstilling af MOG 35-55 emulsion
- Indholdet af et hætteglas tørret M. paratuberculosis (10 mg) formales til et fint pulver med morter og støder, og der tilsættes 10 ml til ufuldstændig Freunds adjuvans for at opnå en 10 mg/ml stamopløsning. Opbevares ved -4 °C.
- Før immunisering fortyndes stamopløsningen til en slutkoncentration på 4 mg/ml.
- Peptidet MOG35-55 fortyndes i ddH 2 O til en slutkoncentration på2mg/ml og opbevares ved -20 °C.
- Brug en homogenisator til at blande MOG35-55-opløsningen (2 mg / ml) med et lige så stort volumen adjuvans (4 mg / ml) fra trin 3.2 i et 5 ml rør, indtil der dannes en tyk emulsion. Efter hver 10 s blanding anbringes opløsningen på is i 20 s, og røret drejes for at genvinde hele opløsningen.
- Overfør emulsionen til en 1 ml sprøjte, fjern al luft, og tilsæt en 27 G kanyle. Emulsionen er nu klar til injektion.
SEDDEL. Da der opstår noget tab af den viskøse emulsion af MOG35-55 under fremstillingen, er det bedst at forberede 1,5 gange den nødvendige mængde.
4. Immunisering af dyr
- Bedøv dyrene med indånding af isofluran for at minimere stress på dyrene.
- Emulsionen (200 μL indeholdende 200 μg/mus af MOG35-55) injiceres subkutant i lænden.
- Administrer en dosis kighostetoksin (100 μL indeholdende 200 ng/mus) intraperitonealt på dag 0 og 2 efter immunisering.
FORSIGTIG: Pertussis-toksin har en multipel undertrykkende virkning på immunsystemet; Undgå indtagelse og kontakt med øjne og hud.
5. Klinisk vurdering
- Overvåg musene dagligt for vægt og kliniske tegn. Brug følgende scoringssystem: 0 = ingen kliniske tegn; 1 = slap hale; 2 = forringelse af bagleddets oprettende refleks og svaghed; 3 = fuldstændig lammelse af bagbenene; 4 = fuldstændig lammelse af bagbenene med delvis lammelse af forbenene; 5 = døende.
BEMÆRK: Ved den første observation af kliniske tegn får dyrene øget adgang til vand og mad. Gnaver chow blødgøres og fugtes og placeres derefter på burgulvet fra madbeholderen. I tilfælde af dehydrerede dyr administreres subkutant væsketilskud, eller en gnaver chow-opslæmning gives via oral sonde. Hvis en mus har brug for denne type hjælp i over 3 dage, vil der blive gennemført eutanasi. - For at undgå eller minimere dyrs smerte og angst skal du bruge følgende menneskelige endepunkter: vægttab på mere end 20%, klinisk score ≥4,0, fravær af oprettende refleks ved score 3, og når dyret ikke er i stand til at få adgang til foder eller vand i 24 timer.
BEMÆRK: Musene blev aflivet på dag 30 efter EAE-induktion ved intraperitoneale injektioner af pentobarbital (≥150 mg / kg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grupper af C57BL/6 mus (total n = 15/gruppe) blev immuniseret med MOG35-55 i en emulsion indeholdende M. paratuberculosis eller ved den fælles metode med CFA. Alle grupper af mus manifesterede en akut monofasisk sygdom karakteriseret ved en enkelt top af handicap observeret efter 14-17 dage efterfulgt af en delvis genopretning af symptomer i løbet af de næste 10 dage (figur 1A). Mus, der var immuniseret med adjuvansen indeholdende M. paratuberculosis, uanset køn, viste en tidligere debut fra 8 til 9 dage efter immunisering og større sværhedsgrad i den akutte fase end mus immuniseret med CFA (figur 1B). Der var ingen signifikant forskel i kropsvægt mellem grupperne (figur 1C). Cytofluorimetrisk analyse af miltceller fra EAE-mus og proliferativ aktivitet af T-lymfocytter vurderet ved 3H-thymidinkorporering blev udført, som tidligere offentliggjort11. Alle miltceller fra EAE-mus, uanset den anvendte adjuvans, viste et stærkt proliferativt respons på peptidet MOG35-55, mens de ikke prolifererede som reaktion på kontrolpeptidet ovalbumin (figur 1D). M. paratuberculosis-immuniserede EAE-mus viste en øget andel af T-lymfocytter (CD4 + CD27 +), dendritiske celler (CD11c + I-A / I-E +) og monocytter (CD11b + CD115+) i milten sammenlignet med CFA-immuniserede mus i den akutte fase af EAE (figur 1E). Histologisk analyse af hæmatoxylin-eosin afslørede en typisk perivaskulær og meningeal mononukleær inflammatorisk infiltration i hjernen og rygmarven (figur 1F).
Figur 1: Repræsentative EAE-resultater. A) kliniske resultater af mus, der evalueres dagligt B) forskelle i sygdomsforløb C) kropsvægt D) T-celle proliferativ respons på MOG35-55 peptidet; E) immuncellepopulationer i splenocytter i den akutte fase (F) histologiske billeder af rygmarvssektioner (4x forstørrelse) farvet med hæmatoxylin-eosin (skalastang = 200 μm) i den akutte fase. Pile angiver inflammatoriske infiltrater. Dataene viser kombinerede resultater af tre uafhængige eksperimenter (n = 5 mus / gruppe / eksperiment). Data udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse beregnet ved hjælp af en envejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis post hoc-test eller Mann-Whitney U-test. Forkortelser: EAE = eksperimentel autoimmun encephalomyelitis; MOG = myelin oligodendrocytglycoprotein; PBS = fosfatbufret saltvand CFA = komplet Freunds adjuvans. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerede en robust alternativ protokol til aktivt at inducere svær EAE i C57BL/6J-mus ved hjælp af peptidet MOG35-55 emulgeret i en adjuvans indeholdende M. paratuberculosis10. Induktion af EAE ved denne metode resulterede i en mere alvorlig sygdom end den, der blev induceret af den fælles protokol med CFA. Denne forskel kan skyldes de forskellige lipidiske komponenter i mykobakteriernes cellevæg11. Faktisk producerer M. paratuberculosis i modsætning til andre mykobakterier et lipopentapeptidantigen på cellevægsoverfladen i stedet for glycopeptidolipider11. Dette lipopentapeptid krydsreagerede ikke med andre nært beslægtede arter og har vist sig at være et mål for en stærk specifik humoral respons hos patienter med autoimmune lidelser12. Mykobakterier besidder patogenassocierede molekylære mønstre, der spiller forskellige roller i immunresponser9. For eksempel har vi for nylig vist, at oral immunisering med M. paratuberculosis øger sværhedsgraden af MOG-EAE13, mens vaccination med bacillus Calmette-Guerin (BCG)-Tokyo-172 ser ud til at have en beskyttende rolle i progressionen af aktive og spontane EAE-modeller14.
Potentielle begrænsninger i protokollen inkluderer det selvbegrænsende monofasiske forløb af EAE, som kan blive kronisk, hvis koncentrationerne af mycobacterium i adjuvans- og kighostetoksinet fordobles. Dette aspekt er meget vigtigt at overveje, især når man studerer det neurodegenerative aspekt af EAE ved hjælp af knockout-mus, da fraværet af genopretningsfase kan skyldes de høje doser af de anvendte reagenser og ikke af manglen på funktion af visse gener. Selv om den ovenfor beskrevne protokol kan anvendes på andre EAE-protokoller ved at variere musenes stammer og alder eller typen og mængden af protein, skal forsøgsgrupperne matches for alder og køn for at sikre, at EAE-eksperimenter udføres på en metodologisk korrekt måde.
Da forekomsten af sygdommen kan variere, er anbefalinger til fejlfinding: den optimale M. paratuberculosis-koncentration kan variere fra 2 til 4 mg / ml, og en trevejsforbindelse kan bruges til blanding af små mængder antigen i den vandige fase. Vi har beskrevet en metode til fremstilling af emulsionen ved anvendelse af en homogenisator; En alternativ og enkel metode til blanding af små mængder antigen i den vandige fase i oliefasen involverer imidlertid anvendelse af en trevejsforbindelsesbeslag, hvortil to glassprøjter er forbundet. Afslutningsvis identificerede vi M. paratuberculosis som en potent adjuvanskandidat i induktionen af aktiv EAE. Yderligere undersøgelser af virkningsmåden og typen af immunitet induceret i forskellige dyrearter vil øge tilliden til muligheden for at vedtage denne alternative metode til at forstå mekanismen for neuroinflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde modtog støtte fra et tilskud fra Japanese Society for the promotion of Science (bevilling nr. JP 23K14675).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G.
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
