Summary
Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) 35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.
Abstract
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) requiere la inmunización por un péptido MOG emulsionado en el adyuvante de Freund completo (CFA) que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivada. Los componentes antigénicos de la micobacteria activan las células dendríticas para estimular a las células T a producir citoquinas que promueven la respuesta Th1 a través de receptores tipo toll. Por lo tanto, la cantidad y las especies de micobacterias presentes durante el desafío antigénico están directamente relacionadas con el desarrollo de EAE. Este documento de métodos presenta un protocolo alternativo para inducir EAE en ratones C57BL / 6 utilizando un adyuvante de Freund incompleto modificado que contiene la subespecie de paratuberculosis K-10 de Mycobacterium avium muerta por calor.
M. paratuberculosis, un miembro del complejo Mycobacterium avium, es el agente causal de la enfermedad de Johne en rumiantes y se ha identificado como un factor de riesgo para varios trastornos mediados por células T humanas, incluida la esclerosis múltiple. En general, los ratones inmunizados con Mycobacterium paratuberculosis mostraron un inicio más temprano y una mayor gravedad de la enfermedad que los ratones inmunizados con CFA que contenían la cepa de M. tuberculosis H37Ra a las mismas dosis de 4 mg / ml. Los determinantes antigénicos de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) cepa K-10 fueron capaces de inducir una fuerte respuesta celular Th1 durante la fase efectora, caracterizada por un número significativamente mayor de linfocitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) y monocitos (CD11b+ CD115+) en el bazo en comparación con los ratones inmunizados con CFA. Además, la respuesta proliferativa de las células T al péptido MOG pareció ser más alta en ratones inmunizados con M. paratuberculosis. El uso de un encefalitógeno (por ejemplo, MOG35-55) emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis en la formulación puede ser un método alternativo y validado para activar las células dendríticas para preparar las células T CD4+ específicas del epítopo de mielina durante la fase de inducción de la EAE.
Introduction
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo común para el estudio de los trastornos desmielinizantes humanos1. Existen varios modelos de EAE: inmunización activa utilizando diferentes péptidos de mielina en combinación con potentes adyuvantes, inmunización pasiva mediante transferencia in vitro de linfocitos CD4+ específicos de mielina y modelos transgénicos de EAE2 espontánea. Cada uno de estos modelos tiene características específicas que permiten estudiar diferentes aspectos de EAE, como el inicio, la fase efectora o la fase crónica. El modelo de glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) de EAE es un buen modelo para estudiar los mecanismos inmunomediados de la neuroinflamación crónica y la desmielinización, ya que se caracteriza por la infiltración inflamatoria mononuclear, la desmielinización en la sustancia blanca periférica y la reducción de la recuperación después del pico de la enfermedad1.
MOG-EAE es inducida por inmunización de ratones susceptibles con el péptido MOG35-55 en adyuvante de Freund completo (CFA), seguido de una inyección intraperitoneal de toxina pertussis. Esto aumenta la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y permite que las células T específicas de mielina activadas en la periferia lleguen al sistema nervioso central (SNC), donde serán reactivadas3. La CFA juega un papel clave en la inducción de EAE al mejorar la captación de antígenos por las células presentadoras de antígenos y la expresión de citoquinas relacionadas con las respuestas humorales y mediadas por células4. Este mecanismo se debe principalmente a la presencia de Mycobacterium tuberculosis muerta emulsionada en aceite, cuyos componentes proporcionan un fuerte estímulo para el sistema inmune5. De hecho, la inducción de EAE está directamente relacionada con la cantidad de micobacterias presentes durante el desafío antigénico6.
La adición de otras micobacterias muertas, como Mycobacterium butyricum, al adyuvante incompleto de Freund 7, así como el efecto de combinaciones adyuvantes8, pueden modular el curso clínico de la EAE y, en consecuencia, influir en la reproducibilidadde los resultados. Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), el agente etiológico de la enfermedad de Johne en rumiantes, se ha asociado con trastornos inflamatorios del SNChumano 9, ya que sus componentes antigénicos son capaces de provocar una fuerte respuesta humoral y mediada por células en pacientes con esclerosis múltiple y trastorno del espectro de neuromielitis óptica9. Por lo tanto, en este protocolo, mostramos un método alternativo y reproducible para inducir MOG-EAE mediante la sustitución de M. tuberculosis en CFA por M. paratuberculosis.
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Protocol
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Juntendo (Número de Aprobación 290238) y se llevaron a cabo de acuerdo con las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para la Experimentación Animal.
1. Observaciones generales sobre el experimento
- Alojar a los ratones en jaulas individuales en la instalación animal en condiciones controladas y libres de patógenos a 23 °C ± 2 °C con 50% ± 10% de humedad, y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a alimentos y agua.
- Inyecte a los ratones con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin antígeno y CFA, y utilícelos como controles negativos y positivos, respectivamente.
2. Preparación de antígenos micobacterianos
- Cultivar la cepa M. paratuberculosis K-10 en medio líquido Middlebrook 7H9 enriquecido con 10% de OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa, catalasa), 0,005% de Tween 80 y 2 mg/L de micobactina J durante 2 semanas en matraces de cultivo de tejidos T25 a 37 °C. Evalúe el crecimiento de la colonia regularmente mediante inspección visual.
PRECAUCIÓN: Manipule M. paratuberculosis en una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2). - Cultivar el matraz Erlenmeyer de 500 ml de enriquecimiento con una suspensión de 1,7 × 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en un volumen final de 200 ml (mismo medio que el paso 2.1) en una incubadora agitadora durante 1 semana.
NOTA: Como los organismos contaminantes pueden afectar los resultados, las bacterias deben ser inoculadas en medios sólidos Middlebrook 7H10 para determinar la morfología de la colonia y verificar la pureza mediante kits de detección convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para M. paratuberculosis. - Inactivar las suspensiones bacterianas durante 5-10 min a 70 °C y centrifugar a 3.000 × g durante 10 min. Lavar el pellet pesado en PBS dos veces, interrumpir por sonicación y almacenar a -20 °C.
- Transfiera el pellet a un recipiente estéril y congélelo con hielo seco o nitrógeno líquido. Transfiera inmediatamente a una cámara de liofilización.
- Liofilización (4 h a -50 °C al vacío) M. paratuberculosis según el manual de la máquina.
- Al final de la liofilización, retire el recipiente de acero inoxidable del liofilizador y transfiéralo a un banco de biolimpieza. Use una espátula de acero inoxidable para desalojar los grumos secos de MAP adheridos a la pared interna del recipiente de acero inoxidable y pulverifíquelos lo más finamente posible.
- Pesar las células pulverizadas con una balanza electrónica y colocarlas manualmente en un vial aséptico de 10 ml a una concentración de 10 mg/ml.
NOTA: La densidad celular se cuantificó como gramos de peso seco por litro de muestra. Después de 3 semanas, 1 mg (peso húmedo) de pellet de células bacterianas contiene aproximadamente 2,5 × 108 UFC.
3. Preparación de la emulsión MOG 35-55
- Moler el contenido de un vial de M. paratuberculosis seca (10 mg) hasta obtener un polvo fino con un mortero y añadir 10 ml al adyuvante de Freund incompleto para obtener una solución madre de 10 mg/ml. Conservar a -4 °C.
- Antes de la inmunización, diluir la solución madre hasta una concentración final de 4 mg/ml.
- Diluir el péptido MOG35-55 enddH2Ohasta una concentración final de 2 mg/ml y almacenar a -20 °C.
- Con un homogeneizador, mezclar la solución MOG35-55 (2 mg/ml) con un volumen igual de adyuvante (4 mg/ml) desde el paso 3.2 en un tubo de 5 ml hasta que se forme una emulsión espesa. Después de cada 10 s de mezcla, coloque la solución en hielo durante 20 s y gire el tubo para recuperar toda la solución.
- Transfiera la emulsión a una jeringa de 1 ml, retire todo el aire y agregue una aguja de 27 G. La emulsión ya está lista para la inyección.
NOTA. Dado que se produce cierta pérdida de la emulsión viscosa de MOG35-55 durante la preparación, es mejor preparar 1,5 veces la cantidad necesaria.
4. Inmunización animal
- Anestesiar a los animales con inhalación de isoflurano para minimizar el estrés en los animales.
- Inyectar la emulsión (200 μL que contiene 200 μg/ratón de MOG35-55) por vía subcutánea en la parte baja de la espalda.
- Administrar una dosis de toxina pertussis (100 μL que contienen 200 ng/ratón) por vía intraperitoneal los días 0 y 2 después de la inmunización.
PRECAUCIÓN: La toxina pertussis tiene un efecto supresor múltiple sobre el sistema inmunológico; Evite la ingestión y el contacto con los ojos y la piel.
5. Evaluación clínica
- Controle a los ratones diariamente para determinar el peso y los signos clínicos. Utilice el siguiente sistema de puntuación: 0 = sin signos clínicos; 1 = cola flácida; 2 = deterioro del reflejo de enderezamiento y debilidad de las extremidades posteriores; 3 = parálisis completa de las extremidades posteriores; 4 = parálisis completa de las extremidades posteriores con parálisis parcial de las extremidades anteriores; 5 = moribundo.
NOTA: Tras la observación inicial de los signos clínicos, los animales reciben un mayor acceso al agua y los alimentos. La comida para roedores se ablanda y humedece, luego se coloca en el piso de la jaula desde la tolva de alimentos. En el caso de animales deshidratados, se administra una suplementación de líquidos subcutáneos, o se administra una suspensión de comida de roedores a través de sonda nasogástrica oral. Si un ratón necesita este tipo de asistencia durante más de 3 días, se realizará la eutanasia. - Para evitar o minimizar el dolor y la angustia de los animales, utilice los siguientes criterios de valoración humanos: pérdida de peso corporal superior al 20%, puntuación clínica ≥4,0, ausencia del reflejo de enderezamiento en la puntuación 3 y cuando el animal no pueda acceder al alimento o al agua durante 24 h.
NOTA: Los ratones fueron sacrificados el día 30 después de la inducción de EAE mediante inyecciones intraperitoneales de pentobarbital (≥150 mg/kg).
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Representative Results
Grupos de ratones C57BL/6 (total n = 15/grupo) fueron inmunizados con MOG35-55 en una emulsión que contenía M. paratuberculosis o por el método común con CFA. Todos los grupos de ratones manifestaron una enfermedad monofásica aguda caracterizada por un único pico de discapacidad observado a los 14-17 días, seguido de una recuperación parcial de los síntomas durante los siguientes 10 días (Figura 1A). Los ratones inmunizados con el adyuvante que contiene M. paratuberculosis, independientemente del sexo, mostraron un inicio más temprano de 8 a 9 días después de la inmunización y una mayor gravedad en la fase aguda que los ratones inmunizados con CFA (Figura 1B). No hubo diferencia significativa en el peso corporal entre los grupos (Figura 1C). Se realizó un análisis citofluorimétrico de células del bazo de ratones EAE y actividad proliferativa de linfocitos T evaluada por incorporación de 3H-timidina, como se publicó anteriormente11. Todas las células del bazo de ratones EAE, independientemente del adyuvante utilizado, mostraron una fuerte respuesta proliferativa al péptido MOG35-55, mientras que no proliferaron en respuesta al péptido control ovoalbúmina (Figura 1D). Los ratones EAE inmunizados con M. paratuberculosis mostraron una mayor proporción de linfocitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+I-A/I-E+) y monocitos (CD11b+CD115+) en el bazo en comparación con ratones inmunizados con CFA durante la fase aguda de EAE (Figura 1E). El análisis histológico por hematoxilina-eosina reveló una típica infiltración inflamatoria mononuclear perivascular y meníngea en el cerebro y la médula espinal (Figura 1F).
Figura 1: Resultados representativos de EAE. (A) Puntuaciones clínicas de ratones evaluados diariamente; (B) diferencias en el curso de la enfermedad; C) peso corporal; (D) respuesta proliferativa de células T al péptido MOG35-55 ; (E) poblaciones de células inmunes en esplenocitos durante la fase aguda; (F) imágenes histológicas de secciones de la médula espinal (aumento 4x) teñidas con hematoxilina-eosina (barra de escala = 200 μm) durante la fase aguda. Las flechas indican infiltrados inflamatorios. Los datos muestran resultados combinados de tres experimentos independientes (n = 5 ratones/grupo/experimento). Los datos se expresan como media ± desviación estándar calculada mediante un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Bonferroni o la prueba U de Mann-Whitney. Abreviaturas: EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; MOG = glicoproteína oligodendrocitos de mielina; PBS = solución salina tamponada con fosfato; CFA = adyuvante completo de Freund. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Demostramos un protocolo alternativo robusto para inducir activamente EAE severa en ratones C57BL / 6J utilizando el péptido MOG35-55 emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis10. La inducción de EAE por este método resultó en una enfermedad más grave que la inducida por el protocolo común con CFA. Esta diferencia podría deberse a los diferentes componentes lipídicos en la pared celular de las micobacterias11. De hecho, a diferencia de otras micobacterias, M. paratuberculosis produce un antígeno lipopentapéptido en la superficie de la pared celular en lugar de glicopeptidolípidos11. Este lipopentapéptido no reaccionó de forma cruzada con otras especies estrechamente relacionadas y ha demostrado ser un objetivo para una fuerte respuesta humoral específica en pacientes con trastornos autoinmunes12. Las micobacterias poseen patrones moleculares asociados a patógenos que desempeñan diferentes funciones en las respuestas inmunes9. Por ejemplo, recientemente hemos demostrado que la inmunización oral con M. paratuberculosis aumenta la gravedad de MOG-EAE13, mientras que la vacunación con bacilo de Calmette-Guerin (BCG)-Tokio-172 parece tener un papel protector en la progresión de los modelos de EAE activos y espontáneos14.
Las limitaciones potenciales del protocolo incluyen el curso monofásico autolimitado de EAE, que puede volverse crónico si se duplican las concentraciones de micobacterias en el adyuvante y la toxina pertussis. Este aspecto es muy importante a tener en cuenta, especialmente cuando se estudia el aspecto neurodegenerativo de EAE utilizando ratones knockout, ya que la ausencia de fase de recuperación puede ser causada por las altas dosis de los reactivos utilizados y no por la falta de función de ciertos genes. Además, aunque el protocolo descrito anteriormente se puede aplicar a otros protocolos EAE variando las cepas y la edad de los ratones o el tipo y la cantidad de proteína, para garantizar que los experimentos con EAE se realicen de una manera metodológicamente correcta, los grupos experimentales deben coincidir por edad y sexo.
Dado que la incidencia de la enfermedad puede variar, las recomendaciones para la resolución de problemas son: la concentración óptima de M. paratuberculosis puede variar de 2 a 4 mg / ml, y se puede usar un conector de tres vías para mezclar pequeños volúmenes del antígeno en la fase acuosa. Hemos descrito un método para preparar la emulsión mediante el uso de un homogeneizador; Sin embargo, un método alternativo y simple para mezclar pequeños volúmenes de antígeno en la fase acuosa, en la fase de aceite, implica el uso de un accesorio de conector de tres vías, al que se conectan dos jeringas de vidrio. En conclusión, identificamos M. paratuberculosis como un potente candidato adyuvante en la inducción de EAE activa. Otros estudios sobre el modo de acción y el tipo de inmunidad inducida en diferentes especies animales aumentarán la confianza en la posibilidad de adoptar este método alternativo para comprender el mecanismo de la neuroinflamación.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo recibió apoyo de una subvención de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (subvención no. JP 23K14675).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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