Summary
ここでは、加熱死菌菌アビウム亜種パラ結核を含む不完全フロイントアジュバントに懸濁した免疫原性エピトープミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55を使用して、C57BL/6マウスで実験的自己免疫性脳脊髄炎を積極的に誘導するための代替プロトコルを提示します。
Abstract
ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)によって誘発される実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、不活化 結核菌を含む完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化したMOGペプチドによる免疫を必要とします。マイコバクテリウムの抗原成分は樹状細胞を活性化してT細胞を刺激し、トール様受容体 を介して Th1応答を促進するサイトカインを産生します。したがって、抗原チャレンジ中に存在するマイコバクテリアの量と種は、EAEの発生に直接関係しています。このメソッド論文は、加熱死菌ア ビウム 亜種 パラ結核 株K-10を含む改変不完全フロイントアジュバントを使用してC57BL/6マウスにEAEを誘導するための代替プロトコルを提示します。
マイコバクテリウム・アビウム複合体のメンバーであるM.パラ結核は、反芻動物のヨーネ病の原因物質であり、多発性硬化症を含むいくつかのヒトT細胞媒介性疾患の危険因子として同定されています。全体として、抗酸菌パラ結核を免疫したマウスは、結核菌H37Ra株を含むCFAを同じ用量の4 mg / mLで免疫したマウスよりも発症が早く、疾患の重症度が高かった。マイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核(MAP)株K-10の抗原決定基は、Tリンパ球(CD4+ CD27+)、樹状細胞(CD11c+ I-A/I-E+)、および単球(CD11b+ CD115+)の数が有意に多いことを特徴とする、エフェクター期に強力なTh1細胞応答を誘導することができました)CFAで免疫したマウスと比較した脾臓における。さらに、MOGペプチドに対する増殖性T細胞応答は、M.パラ結核免疫マウスで最も高かったようです。製剤中のパラ結核菌を含むアジュバント中で乳化された脳炎原(例えば、MOG35-55)の使用は、EAEの誘導段階でミエリンエピトープ特異的CD4+ T細胞をプライミングするための樹状細胞を活性化するための代替的かつ検証された方法であり得る。
Introduction
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、ヒト脱髄障害の研究のための一般的なモデルです1。EAEにはいくつかのモデルがある:強力なアジュバントと組み合わせた異なるミエリンペプチドを用いた能動免疫、ミエリン特異的CD4+リンパ球のin vitro導入による受動免疫、および自発的EAE2のトランスジェニックモデル。これらの各モデルには、発症期、エフェクター期、慢性期など、EAEのさまざまな側面を研究できる特定の機能があります。EAEのミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)モデルは、単核炎症浸潤、末梢白質における脱髄、および疾患ピーク1後の回復の低下を特徴とするため、慢性神経炎症および脱髄の免疫媒介メカニズムを研究するための優れたモデルです。
MOG-EAEは、完全フロイントアジュバント(CFA)中のペプチドMOG35-55 で感受性マウスを免疫し、続いて百日咳毒素を腹腔内注射することによって誘導されます。これにより、血液脳関門の透過性が高まり、末梢で活性化されたミエリン特異的T細胞が中枢神経系(CNS)に到達し、そこで再活性化されます3。CFAは、抗原提示細胞による抗原の取り込みと、体液性および細胞を介した応答に関連するサイトカインの発現を増強することにより、EAEの誘導に重要な役割を果たします4。このメカニズムは、主に油中に乳化された 結核 菌の死滅の存在によるものであり、その成分は免疫系に強い刺激を与える5。実際、EAEの誘導は、抗原チャレンジ6中に存在するマイコバクテリウムの量に直接関係しています。
不完全なフロイントアジュバント7へのマイコバクテリウム・ブチリカムなどの他の死滅抗酸菌の添加、およびアジュバントの組み合わせ8の効果は、EAEの臨床経過を調節し、その結果、結果の再現性に影響を与える可能性があります。反芻動物のヨーネ病の病因物質であるマイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核(MAP)は、その抗原成分が多発性硬化症および視神経脊髄炎スペクトラム障害の患者において強力な体液性および細胞性応答を誘発することができるため、ヒトCNS9の炎症性疾患と関連している9。したがって、このプロトコルでは、CFAの結核菌をパラ結核菌に置き換えることにより、MOG-EAEを誘導するための代替的で再現性のある方法を示します。
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Protocol
すべてのマウス実験は、順天堂大学医学部の施設動物管理使用委員会(承認番号290238)によって承認され、国立衛生研究所の動物実験ガイドラインに従って実施されました。
1.実験に関する一般的なコメント
- 動物施設の個々のケージにマウスを、23°C±2°C、湿度50%±10%の制御された病原体のない条件下で、餌と水への 自由摂取 を伴う12時間の明暗サイクルで飼育します。
- 抗原およびCFAを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をマウスに注射し、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用する。
2. マイコバクテリア抗原の調製
- 10%OADC(オレイン酸、アルブミン、デキストロース、カタラーゼ)、0.005%Tween 80、および2 mg / LのマイコバクチンJが豊富なミドルブルック液体培地7H9で、37°CのT25組織培養フラスコで2週間、M .パラ結核K-10 株を増殖させます。 目視検査でコロニーの成長を定期的に評価します。
注意: パラ結核菌 は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)施設で取り扱ってください。 - 濃縮培養器500 mL三角フラスコを、1.7 × 105 コロニー形成単位(CFU)/mLの懸濁液とともに、最終容量200 mL(ステップ2.1と同じ培地)で1週間振とう培養器で増殖させます。
注:汚染生物が結果に影響を与える可能性があるため、細菌をミドルブルック7H10固体培地に接種して、コロニーの形態を決定し、 パラ結核菌の従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)検出キットで純度を確認する必要があります。 - 細菌懸濁液を70°Cで5〜10分間不活化し、3,000 × g で10分間遠心分離します。秤量したペレットをPBSで2回洗浄し、超音波処理により破砕し、-20°Cで保存した。
- ペレットを滅菌容器に移し、ドライアイスまたは液体窒素で凍結します。すぐに凍結乾燥チャンバーに移します。
- 凍結乾燥(真空下で-50°Cで4時間)機械のマニュアルに従った M.パラ結核 。
- 凍結乾燥が終了したら、凍結乾燥機からステンレス鋼容器を取り出し、バイオクリーニングベンチに移します。ステンレス容器の内壁に付着した乾燥したMAPの塊をステンレスヘラで取り除き、できるだけ細かく粉砕します。
- 電子天秤を使用して粉砕細胞を計量し、10 mg/mLの濃度の無菌10 mLバイアルに手動で入れます。
注:細胞密度は、サンプル1リットルあたりの乾燥重量のグラム数として定量化しました。3週間後、1 mg(湿重量)の細菌細胞ペレットには、約2.5 × 108 CFU が含まれています。.
3. MOG 35-55 エマルジョンの調製
- 乾燥した パラ結核菌 (10 mg)のバイアル1本の内容物を乳鉢と乳棒で微粉末に粉砕し、不完全なフロイントアジュバントに10 mLを加えて10 mg/mLのストック溶液を得ます。-4°Cで保存してください。
- 免疫化の前に、ストック溶液を最終濃度4 mg/mLに希釈してください。
- ペプチドMOG35-55 をddH2Oで最終濃度2 mg/mLに希釈し、-20°Cで保存します。
- ホモジナイザーを使用して、MOG35-55 溶液(2 mg/mL)をステップ3.2の等量のアジュバント(4 mg/mL)と5 mLチューブ内で濃厚なエマルジョンが形成されるまで混合します。10秒の混合ごとに、溶液を氷の上に20秒間置き、チューブを回転させてすべての溶液を回収します。
- エマルジョンを1 mLシリンジに移し、すべての空気を取り除き、27 Gの針を追加します。これでエマルジョンは注射の準備が整いました。
手記。調製中にMOG35-55 の粘性エマルジョンのいくらかの損失が起こるので、必要な量の1.5倍を調製することが最善である。
4.動物の予防接種
- 動物へのストレスを最小限に抑えるために、イソフルランを吸入して動物に麻酔をかけます。
- エマルジョン(200μL/マウスのMOG35-55)を腰部に皮下注射します。
- 百日咳毒素(200 ng /マウスを含む100 μL)の用量を、免疫後0日目と2日目に腹腔内投与します。.
注意:百日咳毒素は免疫系に複数の抑制効果があります。摂取や目や皮膚との接触を避けてください。
5.臨床評価
- マウスの体重と臨床徴候を毎日監視します。.次のスコアリングシステムを使用します:0 =臨床徴候なし。1 =弛緩した尾。2 =右反射の障害および後肢の衰弱。3 =後肢の完全な麻痺;4 =前肢の部分的な麻痺を伴う後肢の完全な麻痺;5 =瀕死の状態。
注:臨床徴候の最初の観察時に、動物は水と食物へのアクセスの増加を提供されます。げっ歯類のチャウチャウを柔らかくして湿らせてから、フードホッパーからケージの床に置きます。脱水動物の場合、皮下液補給が投与されるか、またはげっ歯類の固形飼料スラリーが経口経管栄養を介して与えられる。マウスがこの種の援助を3日以上必要とする場合、安楽死が行われます。 - 動物の痛みや苦痛を回避または最小限に抑えるには、次の人間のエンドポイントを使用します:体重減少が20%を超える、臨床スコア≥4.0、スコア3での右反射の欠如、および動物が24時間飼料または水にアクセスできない場合。
注:マウスは、ペントバルビタール(≥150 mg / kg)の腹腔内注射によるEAE誘導後30日目に安楽死させました。
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Representative Results
C57BL/6マウスの群(合計n = 15/群)を、パラ結核菌を含むエマルジョン中のMOG35-55で、またはCFAとの一般的な方法で免疫した。マウスのすべてのグループは、14〜17日で観察された障害の単一のピークを特徴とする急性単相性疾患を示し、その後10日間にわたって症状が部分的に回復しました(図1A)。パラ結核菌を含むアジュバントで免疫したマウスは、性別に関係なく、CFAで免疫したマウスよりも免疫後8〜9日目に発症が早く、急性期に重症度が高かった(図1B)。群間で体重に有意差はなかった(図1C)。EAEマウス由来の脾臓細胞の細胞蛍光分析および3H-チミジン取り込みによって評価されたTリンパ球の増殖活性が、以前に発表されたように実施された11。EAEマウスのすべての脾臓細胞は、使用したアジュバントに関係なく、ペプチドMOG35-55に対して強い増殖応答を示したが、対照ペプチドオボアルブミンに対しては増殖しなかった(図1D)。M.パラ結核免疫EAEマウスは、EAEの急性期にCFA免疫マウスと比較して、脾臓のTリンパ球(CD4+ CD27+)、樹状細胞(CD11c+I-A/I-E+)、および単球(CD11b+CD115+)の割合の増加を示しました(図1E)。ヘマトキシリン-エオジンによる組織学的分析により、脳と脊髄に典型的な血管周囲および髄膜単核炎症浸潤が明らかになりました(図1F)。
図1:代表的なEAE結果。 (A)毎日評価されたマウスの臨床スコア;(B)疾患経過の違い;(C)体重;(d)MOG35-55 ペプチドに対するT細胞増殖応答;(e)急性期における脾細胞における免疫細胞集団;(F)急性期にヘマトキシリン-エオジン(スケールバー=200μm)で染色した脊髄切片(倍率4倍)の組織像。矢印は炎症性浸潤を示す。データは、3つの独立した実験(n = 5匹のマウス/グループ/実験)の結合結果を示す。データは±一元配置分散分析とそれに続くボンフェローニの事後検定またはマンホイットニーU検定を使用して計算された平均標準偏差として表されます。略語:EAE =実験的自己免疫性脳脊髄炎;MOG =ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質;PBS = リン酸緩衝生理食塩水;CFA = 完全なフロイントアジュバント。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
パラ結核菌10を含むアジュバントで乳化したペプチドMOG35-55を使用して、C57BL / 6Jマウスで重度のEAEを積極的に誘導するための堅牢な代替プロトコルを実証しました。この方法によるEAEの誘導は、CFAとの共通プロトコールによって誘発されたものよりも重篤な疾患をもたらした。この違いは、抗酸菌11の細胞壁における脂質成分の違いに起因する可能性がある。実際、他の抗酸菌とは異なり、パラ結核菌は、グリコペプチド脂質の代わりに細胞壁表面にリポペンタペプチド抗原を産生します11。このリポペンタペプチドは、他の密接に関連する種と交差反応せず、自己免疫疾患患者における強い特異的体液性応答の標的であることが示されています12。マイコバクテリアは、免疫応答において異なる役割を果たす病原体関連分子パターンを有する9.例えば、パラ結核菌による経口免疫はMOG-EAE13の重症度を高めるが、カルメット・ゲラン桿菌(BCG)-Tokyo-172によるワクチン接種は、活動性および自然発生性のEAEモデルの進行に保護的役割を果たすようである14。
プロトコルの潜在的な制限には、EAEの自己限定的な単相コースが含まれ、アジュバントおよび百日咳毒素中のマイコバクテリウムの濃度が2倍になると慢性化する可能性があります。回復期の欠如は、特定の遺伝子の機能の欠如ではなく、使用される試薬の高用量によって引き起こされる可能性があるため、特にノックアウトマウスを使用してEAEの神経変性の側面を研究する場合、この側面を考慮することが非常に重要です。さらに、上記のプロトコルは、マウスの系統および年齢またはタンパク質の種類および量を変化させることによって他のEAEプロトコルに適用することができるが、EAE実験が方法論的に正しい方法で行われることを確実にするために、実験群は年齢および性別について一致させなければならない。
疾患の発生率は異なる可能性があるため、トラブルシューティングの推奨事項は、最適な パラ結核菌 濃度は2〜4 mg / mLの範囲であり、三元コネクタを使用して水相で少量の抗原を混合できます。ホモジナイザーを用いてエマルジョンを調製する方法を記載した。しかしながら、少量の抗原を水相中、油相中で混合するための代替的かつ簡単な方法は、2つのガラスシリンジが接続される三方向コネクタ継手の使用を含む。結論として、 我々はM.パラ結核を 活性型EAEの誘導における強力なアジュバント候補として同定した。異なる動物種で誘発される作用機序および免疫の種類に関するさらなる研究は、神経炎症のメカニズムを理解するためにこの代替方法を採用する可能性に対する信頼性を高めるであろう。
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Disclosures
著者は、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
本研究は、日本学術振興会の助成を受けています(助成番号。特開23K14675)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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