Summary
Здесь мы представляем альтернативный протокол для активной индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей C57BL / 6 с использованием иммуногенного эпитопа миелина олигодендроцитарного гликопротеина (MOG) 35-55, суспендированного в неполном адъюванте Фройнда, содержащем убитый теплом подвид Mycobacterium avium paratuberculosis.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), индуцированный гликопротеином миелина олигодендроцитов (МОГ), требует иммунизации пептидом МОГ, эмульгированным в полном адъюванте Фройнда (CFA), содержащем инактивированную Mycobacterium tuberculosis. Антигенные компоненты микобактерий активируют дендритные клетки, чтобы стимулировать Т-клетки к продуцированию цитокинов, которые способствуют ответу Th1 через толл-подобные рецепторы. Таким образом, количество и виды микобактерий, присутствующих во время антигенного вызова, напрямую связаны с развитием ЭАЭ. В этой статье представлен альтернативный протокол для индукции EAE у мышей C57BL / 6 с использованием модифицированного неполного адъюванта Фройнда, содержащего убитый теплом штамм паратуберкулеза подвида Mycobacterium avium K-10.
M. paratuberculosis, член комплекса Mycobacterium avium, является возбудителем болезни Йоне у жвачных животных и был идентифицирован как фактор риска нескольких заболеваний, опосредованных Т-клетками человека, включая рассеянный склероз. В целом, мыши, иммунизированные Mycobacterium paratuberculosis, показали более раннее начало и большую тяжесть заболевания, чем мыши, иммунизированные CFA, содержащим штамм M. tuberculosis H37Ra в тех же дозах 4 мг / мл. Антигенные детерминанты штамма К-10 подвида Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) смогли индуцировать сильный клеточный ответ Th1 во время эффекторной фазы, характеризующейся значительно большим количеством Т-лимфоцитов (CD4+ CD27+), дендритных клеток (CD11c+ I-A/I-E+) и моноцитов (CD11b+ CD115+) в селезенке по сравнению с мышами, иммунизированными CFA. Кроме того, пролиферативный ответ Т-клеток на пептид MOG, по-видимому, был самым высоким у мышей, иммунизированных M. paratuberculosis. Использование энцефалитогена (например, MOG35-55), эмульгированного в адъюванте, содержащем M. paratuberculosis в составе, может быть альтернативным и валидированным методом активации дендритных клеток для праймирования миелиновых эпитоп-специфических CD4+ Т-клеток во время индукционной фазы EAE.
Introduction
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является общей моделью для изучения демиелинизирующих расстройств человека1. Существует несколько моделей ЭАЭ: активная иммунизация с использованием различных пептидов миелина в сочетании с сильнодействующими адъювантами, пассивная иммунизация путем переноса in vitro миелин-специфических CD4+ лимфоцитов и трансгенные модели спонтанного ЭАЭ2. Каждая из этих моделей имеет специфические особенности, которые позволяют изучать различные аспекты ЭАЭ, такие как начало, эффекторная фаза или хроническая фаза. Модель гликопротеина миелиновых олигодендроцитов (MOG) EAE является хорошей моделью для изучения иммуноопосредованных механизмов хронического нейровоспаления и демиелинизации, поскольку она характеризуется мононуклеарной воспалительной инфильтрацией, демиелинизацией периферического белого вещества и снижением выздоровления после пика заболевания1.
MOG-EAE индуцируется иммунизацией восприимчивых мышей пептидом MOG35-55 в полном адъюванте Фройнда (CFA) с последующей внутрибрюшинной инъекцией коклюшного токсина. Это увеличивает проницаемость гематоэнцефалического барьера и позволяет миелиноспецифическим Т-клеткам, активированным на периферии, достигать центральной нервной системы (ЦНС), где они будут реактивированы3. CFA играет ключевую роль в индукции EAE, усиливая поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками и экспрессию цитокинов, связанных с гуморальными и клеточно-опосредованными ответами4. Этот механизм в основном обусловлен присутствием убитой Mycobacterium tuberculosis , эмульгированной в масле, компоненты которой обеспечивают сильный стимул для иммунной системы5. Фактически, индукция ЭАЭ напрямую связана с количеством микобактерий, присутствующих во время антигенного вызова6.
Добавление других убитых микобактерий, таких как Mycobacterium butyricum, к неполному адъюванту7 Фройнда, а также эффект комбинаций адъювантов8 могут модулировать клиническое течение ЭАЭ и, следовательно, влиять на воспроизводимость результатов. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), этиологический агент болезни Йоне у жвачных животных, был связан с воспалительными заболеваниями ЦНС 9 человека, поскольку его антигенные компоненты способны вызывать сильный гуморальный и клеточный ответ у пациентов с рассеянным склерозом и нейромиелитом зрительного нерва9. Таким образом, в этом протоколе мы показываем альтернативный и воспроизводимый метод индуцирования MOG-EAE путем замены M. tuberculosis в CFA на M. paratuberculosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на мышах были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинской школы Университета Хунтендо (номер одобрения 290238) и проводились в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по экспериментам на животных.
1. Общие замечания к эксперименту
- Размещайте мышей в отдельных клетках на животноводческом предприятии в контролируемых условиях, свободных от патогенов, при температуре 23 °C ± 2 °C при влажности 50% ± 10% и 12-часовом цикле свет/темнота с свободным доступом к пище и воде.
- Вводите мышам фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) без антигена и CFA и используйте их в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно.
2. Получение микобактериальных антигенов
- Выращивают штамм M. paratuberculosis K-10 в жидкой среде Миддлбрука 7H9, обогащенной 10% OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза, каталаза), 0,005% Tween 80 и 2 мг/л микобактина J в течение 2 недель в колбах для культивирования тканей T25 при 37 °C. Регулярно оценивайте рост колонии путем визуального осмотра.
ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с M. paratuberculosis в учреждении уровня биобезопасности 2 (BSL-2). - Выращивают обогащенную культуру 500 мл колбы Эрленмейера с суспензией 1,7 × 10,5 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл в конечном объеме 200 мл (та же среда, что и на этапе 2.1) в встряхивающем инкубаторе в течение 1 недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку загрязняющие организмы могут повлиять на результаты, бактерии должны быть инокулированы на твердую среду Middlebrook 7H10 для определения морфологии колоний и проверки чистоты с помощью обычных наборов для обнаружения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для M. paratuberculosis. - Инактивировать бактериальные суспензии в течение 5-10 мин при 70 °С и центрифуге при 3000 × г в течение 10 мин. Промыли взвешенные гранулы в PBS дважды, разрушили ультразвуком и хранили при -20 °C.
- Переложите гранулу в стерильный контейнер и заморозьте ее сухим льдом или жидким азотом. Немедленно переложите в камеру сублимационной сушки.
- Сублимационная сушка (4 ч при -50 °C в вакууме) M. paratuberculosis в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
- По окончании лиофилизации извлеките контейнер из нержавеющей стали из сублимационной сушилки и перенесите его на стол для биоочистки. Используйте шпатель из нержавеющей стали, чтобы удалить высохшие комки MAP, прилипшие к внутренней стенке контейнера из нержавеющей стали, и измельчить их как можно мельче.
- Взвесьте измельченные клетки с помощью электронных весов и вручную поместите их в асептический флакон объемом 10 мл в концентрации 10 мг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток была количественно определена в граммах сухого веса на литр образца. Через 3 недели 1 мг (сырой вес) гранулы бактериальных клеток содержит примерно 2,5 × 108 КОЕ.
3. Приготовление эмульсии MOG 35-55
- Содержимое одного флакона высушенного M. paratuberculosis (10 мг) измельчить в мелкий порошок с помощью ступки и пестика и добавить 10 мл к неполному адъюванту Фройнда для получения исходного раствора 10 мг/мл. Хранить при температуре -4 °C.
- Перед иммунизацией разбавьте исходный раствор до конечной концентрации 4 мг/мл.
- Разбавьте пептид MOG35-55 в ddH 2 O до конечной концентрации2мг/мл и храните при -20 °C.
- Используя гомогенизатор, смешайте раствор MOG35-55 (2 мг/мл) с равным объемом адъюванта (4 мг/мл) со стадии 3.2 в пробирке объемом 5 мл до образования густой эмульсии. После каждых 10 секунд смешивания поместите раствор на лед на 20 секунд и вращайте трубку, чтобы восстановить весь раствор.
- Перелейте эмульсию в шприц объемом 1 мл, удалите весь воздух и добавьте иглу 27 г. Теперь эмульсия готова к инъекциям.
ЗАМЕТКА. Поскольку во время приготовления происходит некоторая потеря вязкой эмульсии MOG35-55 , лучше всего приготовить в 1,5 раза больше необходимого количества.
4. Иммунизация животных
- Обезболивайте животных ингаляцией изофлурана, чтобы свести к минимуму стресс для животных.
- Введите эмульсию (200 мкл, содержащую 200 мкг/мышь MOG35-55) подкожно в нижнюю часть спины.
- Вводят дозу коклюшного токсина (100 мкл, содержащий 200 нг/мышь) внутрибрюшинно на 0-й и 2-й дни после иммунизации.
ВНИМАНИЕ: Коклюшный токсин оказывает множественное супрессивное действие на иммунную систему; Избегайте проглатывания и контакта с глазами и кожей.
5. Клиническая оценка
- Ежедневно контролируйте мышей на предмет веса и клинических признаков. Используйте следующую систему подсчета баллов: 0 = отсутствие клинических признаков; 1 = вялый хвост; 2 = нарушение выпрямляющего рефлекса и слабость задних конечностей; 3 = полный паралич задних конечностей; 4 = полный паралич задних конечностей с частичным параличом передних конечностей; 5 = умирающий.
ПРИМЕЧАНИЕ: При первичном наблюдении клинических признаков животным предоставляется расширенный доступ к воде и пище. Чау-чау грызунов размягчают и увлажняют, затем помещают на пол клетки из бункера для корма. В случае обезвоженных животных вводят добавки подкожной жидкости или дают суспензию для грызунов через ротовой зонд. Если мышь нуждается в таком виде помощи более 3 дней, будет проведена эвтаназия. - Чтобы избежать или свести к минимуму боль и страдания животных, используйте следующие конечные точки человека: потеря массы тела более чем на 20%, клинический балл ≥4,0, отсутствие рефлекса выпрямления при балле 3 и когда животное не может получить доступ к корму или воде в течение 24 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были усыплены на 30-й день после индукции EAE внутрибрюшинными инъекциями пентобарбитала (≥150 мг / кг).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Группы мышей C57BL/6 (всего n = 15/группа) иммунизировали MOG35-55 в эмульсии, содержащей M. paratuberculosis, или обычным методом с CFA. Во всех группах мышей проявлялось острое монофазное заболевание, характеризующееся единичным пиком инвалидности, наблюдаемым через 14-17 дней, с последующим частичным восстановлением симптомов в течение следующих 10 дней (рис. 1А). Мыши, иммунизированные адъювантом, содержащим M. paratuberculosis, независимо от пола, показали более раннее начало через 8-9 дней после иммунизации и большую тяжесть в острой фазе, чем мыши, иммунизированные CFA (рис. 1B). Не было выявлено существенной разницы в массе тела между группами (рис. 1С). Цитофлуориметрический анализ клеток селезенки мышей EAE и пролиферативной активности Т-лимфоцитов, оцениваемых по включению 3H-тимидина, был проведен, как было опубликованоранее 11. Все клетки селезенки мышей EAE, независимо от используемого адъюванта, показали сильный пролиферативный ответ на пептид MOG35-55, тогда как они не пролиферировали в ответ на контрольный пептид овальбумин (рис. 1D). У мышей, иммунизированных M. paratuberculosis EAE, наблюдалась повышенная доля Т-лимфоцитов (CD4+ CD27+), дендритных клеток (CD11c+I-A/I-E+) и моноцитов (CD11b+CD115+) в селезенке по сравнению с мышами, иммунизированными CFA, во время острой фазы EAE (рис. 1E). Гистологический анализ гематоксилин-эозином выявил типичную периваскулярную и менингеальную мононуклеарную воспалительную инфильтрацию в головном и спинном мозге (рис. 1F).
Рисунок 1: Репрезентативные результаты EAE. (A) Клинические оценки мышей, оцениваемых ежедневно; (B) различия в течении заболевания; (С) масса тела; (D) пролиферативный ответ Т-клеток на пептид MOG35-55 ; (E) популяции иммунных клеток в спленоцитах во время острой фазы; (F) гистологические изображения срезов спинного мозга (4-кратное увеличение), окрашенных гематоксилин-эозином (шкала = 200 мкм) во время острой фазы. Стрелками обозначены воспалительные инфильтраты. Данные показывают объединенные результаты трех независимых экспериментов (n = 5 мышей/группа/эксперимент). Данные выражаются в виде среднего ± стандартного отклонения, рассчитанного с использованием одностороннего ANOVA, за которым следует тест Бонферрони post hoc или U-критерий Манна-Уитни. Сокращения: EAE = экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит; MOG = гликопротеин миелина олигодендроцита; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; CFA = полный адъювант Фройнда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы продемонстрировали надежный альтернативный протокол для активной индукции тяжелой ЭАЭ у мышей C57BL/6J с использованием пептида MOG35-55 , эмульгированного в адъюванте, содержащем M. paratuberculosis10. Индукция ЭАЭ этим методом привела к более тяжелому заболеванию, чем то, которое индуцировано общим протоколом с CFA. Это различие может быть связано с различными липидными компонентами в клеточной стенке микобактерий11. Фактически, в отличие от других микобактерий, M. paratuberculosis продуцирует липопентапептидный антиген на поверхности клеточной стенки вместо гликопептидолипидов11. Этот липопентапептид не вступал в перекрестную реакцию с другими близкородственными видами и, как было показано, является мишенью для сильного специфического гуморального ответа у пациентов с аутоиммунными заболеваниями12. Микобактерии обладают патогенными молекулярными паттернами, которые играют различную роль в иммунных реакциях9. Например, недавно мы показали, что пероральная иммунизация M. paratuberculosis увеличивает тяжесть MOG-EAE13, тогда как вакцинация бациллой Кальметта-Герена (BCG)-Tokyo-172, по-видимому, играет защитную роль в прогрессировании активных и спонтанных моделей EAE14.
Потенциальные ограничения протокола включают самоограниченное монофазное течение ЭАЭ, которое может стать хроническим, если концентрации микобактерий в адъюванте и коклюшном токсине удваиваются. Этот аспект очень важно учитывать, особенно при изучении нейродегенеративного аспекта ЭАЭ с использованием нокаутных мышей, поскольку отсутствие фазы восстановления может быть вызвано высокими дозами используемых реагентов, а не отсутствием функции определенных генов. Кроме того, хотя описанный выше протокол может быть применен к другим протоколам EAE путем варьирования штаммов и возраста мышей или типа и количества белка, для обеспечения того, чтобы эксперименты EAE проводились методологически правильным образом, экспериментальные группы должны быть сопоставлены по возрасту и полу.
Поскольку частота заболевания может варьироваться, рекомендации по устранению неполадок таковы: оптимальная концентрация M. paratuberculosis может варьироваться от 2 до 4 мг/мл, а для смешивания небольших объемов антигена в водной фазе можно использовать трехсторонний соединитель. Мы описали способ приготовления эмульсии с использованием гомогенизатора; Однако альтернативный и простой способ смешивания небольших объемов антигена в водной фазе, в масляной фазе, предполагает использование трехходового соединительного штуцера, к которому подключаются два стеклянных шприца. В заключение мы идентифицировали M. paratuberculosis как мощного адъювантного кандидата в индукции активной ЭАЭ. Дальнейшие исследования механизма действия и типа иммунитета, индуцированного у разных видов животных, повысят уверенность в возможности принятия этого альтернативного метода для понимания механизма нейровоспаления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа получила поддержку за счет гранта Японского общества содействия науке (грант No JP 23K14675).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G.
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
