Адъювантная активность микобактерий паратуберкулеза в повышении иммуногенности аутоантигенов при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите
Summary
Здесь мы представляем альтернативный протокол для активной индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей C57BL / 6 с использованием иммуногенного эпитопа миелина олигодендроцитарного гликопротеина (MOG) 35-55, суспендированного в неполном адъюванте Фройнда, содержащем убитый теплом подвид Mycobacterium avium paratuberculosis.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), индуцированный гликопротеином миелина олигодендроцитов (МОГ), требует иммунизации пептидом МОГ, эмульгированным в полном адъюванте Фройнда (CFA), содержащем инактивированную Mycobacterium tuberculosis. Антигенные компоненты микобактерий активируют дендритные клетки, чтобы стимулировать Т-клетки к продуцированию цитокинов, которые способствуют ответу Th1 через толл-подобные рецепторы. Таким образом, количество и виды микобактерий, присутствующих во время антигенного вызова, напрямую связаны с развитием ЭАЭ. В этой статье представлен альтернативный протокол для индукции EAE у мышей C57BL / 6 с использованием модифицированного неполного адъюванта Фройнда, содержащего убитый теплом штамм паратуберкулеза подвида Mycobacterium avium K-10.
M. paratuberculosis, член комплекса Mycobacterium avium, является возбудителем болезни Йоне у жвачных животных и был идентифицирован как фактор риска нескольких заболеваний, опосредованных Т-клетками человека, включая рассеянный склероз. В целом, мыши, иммунизированные Mycobacterium paratuberculosis, показали более раннее начало и большую тяжесть заболевания, чем мыши, иммунизированные CFA, содержащим штамм M. tuberculosis H37Ra в тех же дозах 4 мг / мл. Антигенные детерминанты штамма К-10 подвида Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) смогли индуцировать сильный клеточный ответ Th1 во время эффекторной фазы, характеризующейся значительно большим количеством Т-лимфоцитов (CD4+ CD27+), дендритных клеток (CD11c+ I-A/I-E+) и моноцитов (CD11b+ CD115+) в селезенке по сравнению с мышами, иммунизированными CFA. Кроме того, пролиферативный ответ Т-клеток на пептид MOG, по-видимому, был самым высоким у мышей, иммунизированных M. paratuberculosis. Использование энцефалитогена (например, MOG35-55), эмульгированного в адъюванте, содержащем M. paratuberculosis в составе, может быть альтернативным и валидированным методом активации дендритных клеток для праймирования миелиновых эпитоп-специфических CD4+ Т-клеток во время индукционной фазы EAE.
Introduction
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является общей моделью для изучения демиелинизирующих расстройств человека1. Существует несколько моделей ЭАЭ: активная иммунизация с использованием различных пептидов миелина в сочетании с сильнодействующими адъювантами, пассивная иммунизация путем переноса in vitro миелин-специфических CD4+ лимфоцитов и трансгенные модели спонтанного ЭАЭ2. Каждая из этих моделей имеет специфические особенности, которые позволяют изучать различные аспекты ЭАЭ, такие как начало, эффекторная фаза или хроническая фаза. Модель гликопротеина миелиновых олигодендроцитов (MOG) EAE является хорошей моделью для изучения иммуноопосредованных механизмов хронического нейровоспаления и демиелинизации, поскольку она характеризуется мононуклеарной воспалительной инфильтрацией, демиелинизацией периферического белого вещества и снижением выздоровления после пика заболевания1.
MOG-EAE индуцируется иммунизацией восприимчивых мышей пептидом MOG35-55 в полном адъюванте Фройнда (CFA) с последующей внутрибрюшинной инъекцией коклюшного токсина. Это увеличивает проницаемость гематоэнцефалического барьера и позволяет миелиноспецифическим Т-клеткам, активированным на периферии, достигать центральной нервной системы (ЦНС), где они будут реактивированы3. CFA играет ключевую роль в индукции EAE, усиливая поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками и экспрессию цитокинов, связанных с гуморальными и клеточно-опосредованными ответами4. Этот механизм в основном обусловлен присутствием убитой Mycobacterium tuberculosis , эмульгированной в масле, компоненты которой обеспечивают сильный стимул для иммунной системы5. Фактически, индукция ЭАЭ напрямую связана с количеством микобактерий, присутствующих во время антигенного вызова6.
Добавление других убитых микобактерий, таких как Mycobacterium butyricum, к неполному адъюванту7 Фройнда, а также эффект комбинаций адъювантов8 могут модулировать клиническое течение ЭАЭ и, следовательно, влиять на воспроизводимость результатов. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), этиологический агент болезни Йоне у жвачных животных, был связан с воспалительными заболеваниями ЦНС 9 человека, поскольку его антигенные компоненты способны вызывать сильный гуморальный и клеточный ответ у пациентов с рассеянным склерозом и нейромиелитом зрительного нерва9. Таким образом, в этом протоколе мы показываем альтернативный и воспроизводимый метод индуцирования MOG-EAE путем замены M. tuberculosis в CFA на M. paratuberculosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы продемонстрировали надежный альтернативный протокол для активной индукции тяжелой ЭАЭ у мышей C57BL/6J с использованием пептида MOG35-55 , эмульгированного в адъюванте, содержащем M. paratuberculosis10. Индукция ЭАЭ этим методом привела к более тяжелому заболеванию, чем то, к…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа получила поддержку за счет гранта Японского общества содействия науке (грант No JP 23K14675).
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114 (2013).
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
