Bioanalisi dello scattering Raman senza etichetta potenziata dalla superficie basata su nanosonde a Au@Carbon punti

Summary

In questo studio, abbiamo sviluppato una nanosonda di impronte digitali basata su diffusione Raman potenziata dalla superficie (SERS) a basso costo con biocompatibilità favorevole per mostrare il bioimaging delle cellule vive senza etichetta e rilevare due ceppi batterici, mostrando in dettaglio come ottenere spettri SERS di cellule viventi in un metodo non distruttivo.

Abstract

La tecnologia di scattering Raman potenziato dalla superficie (SERS) ha attirato sempre più attenzione nel campo biomedico grazie alla sua capacità di fornire informazioni sulle impronte molecolari di campioni biologici, nonché al suo potenziale nell’analisi di singole cellule. Questo lavoro mira a stabilire una strategia semplice per la bioanalisi SERS label-free basata su nanosonde Au@carbon punti (Au@CDs). Qui, i CD derivati dai polifenoli sono utilizzati come riducente per sintetizzare rapidamente le nanostrutture Au@CD del guscio del nucleo, che consente potenti prestazioni SERS anche quando la concentrazione di blu di metilene (MB) è bassa come ^10-9 M, a causa del meccanismo di potenziamento Raman cooperativo. Per la bioanalisi, Au@CDs può servire come nanosensore SERS unico per identificare i componenti cellulari dei biocampioni (ad esempio, cellule tumorali e batteri). Le impronte molecolari di specie diverse possono essere ulteriormente distinte dopo la combinazione con l’analisi delle componenti principali. Inoltre, Au@CDs anche consentire l’imaging SERS label-free per analizzare i profili di composizione intracellulare. Questa strategia offre una bioanalisi SERS fattibile e senza etichettatura, aprendo una nuova prospettiva per la nanodiagnosi.

Introduction

L’analisi di una singola cellula è essenziale per lo studio della rivelazione dell’eterogeneità cellulare e per valutare lo stato completo della cellula. La risposta istantanea della cellula al microambiente giustifica anche l’analisi di una singola cellula¹. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni alle tecniche attuali. Il rilevamento della fluorescenza può essere applicato all’analisi di singole cellule, ma è limitato dalla bassa sensibilità. Altre sfide derivano dal complicato background di fluorescenza delle cellule e dal fotosbiancamento a fluorescenza sotto irradiazione a lungo termine². Lo scattering Raman potenziato dalla superficie (SERS) può qualificarsi in termini di analisi a singola cellula grazie ai suoi vantaggi, tra cui (1) riflettere le informazioni intrinseche delle impronte digitali molecolari e la situazione istantanea, (2) altissima sensibilità superficiale, (3) rilevamento multiplex conveniente, (4) alta fotostabilità, (5) il rilevamento può essere quantificato per l’analisi comparativa, (6) evitare l’autofluorescenza cellulare con l’eccitazione della lunghezza d’onda NIR, (7) il rilevamento può essere eseguito in un acquoso cellulare e (8) il rilevamento può essere diretto a una regione specifica all’interno della cella ^3,4,5.

Esistono due meccanismi ampiamente riconosciuti per comprendere il SERS come un fenomeno fondamentale: il potenziamento elettromagnetico (EM) come motivo dominante e il potenziamento chimico (CM). EM si riferisce, in una data frequenza del campo eccitante, all’oscillazione di elettroni collettivi guidati da onde elettromagnetiche quando la frequenza della luce incidente corrisponde alla frequenza degli elettroni liberi che oscillano nel metallo, dando origine alla risonanza plasmonica di superficie (SPR). Quando l’SPR localizzato (LSPR) si verifica attraverso il laser incidente che colpisce le nanoparticelle metalliche (NP), porta all’assorbimento risonante o alla dispersione della luce incidente. Di conseguenza, l’intensità del campo elettromagnetico superficiale delle NP metalliche può essere aumentata da due a cinque ordini⁴. Tuttavia, la chiave per l’enorme miglioramento in SERS non è un singolo NP metallico, ma il divario tra due NP, che crea punti caldi. La CM è generata da due lati, tra cui (1) interazioni tra molecole bersaglio e NP metalliche e (2) molecole bersaglio in grado di trasferire elettroni da / verso NP metalliche ^4,5. Dettagli più esaustivi possono essere trovati in questi articoli di revisione ^4,5. Diversi metodi promettenti per il biorilevamento e l’imaging SERS in cellule viventi sono stati presentati in letteratura precedente, ad esempio, la rilevazione di cellule apoptotiche⁶, proteine negli organelli⁷, miRNA intracellulari⁸, membrane lipidiche ^cellulari,9citochine¹⁰ e metaboliti¹¹ in cellule viventi, nonché l’identificazione e il monitoraggio delle cellule mediante imaging SERS confocale^{2, 11,12,13}. È interessante notare che il SERS label-free presenta il vantaggio unico di SERS, che può descrivere spettri molecolari interni⁵.

Un problema importante per il SERS label-free è un substrato razionale e affidabile. I substrati tipici di SERS sono NP di metalli nobili a causa della loro eccellente capacità di disperdere molta luce¹⁴. Al giorno d’oggi, sempre più attenzione è rivolta ai nanocompositi a causa delle loro notevoli proprietà fisiche e chimiche e biocompatibilità. Più significativamente, i nanocompositi possono mostrare una migliore attività SERS a causa dell’intensa EM indotta dai punti caldi sui nanoibridi e dall’ulteriore miglioramento chimico proveniente da altri materiali non metallici¹⁵. Ad esempio, Fei et al. hanno utilizzato i punti quantici (QD) MoS 2 come riduttori per sintetizzare nanocompositi QD Au NP@MoS₂per l’imaging SERS nel vicino infrarosso (NIR) senza etichetta delle cellule di cancro al seno 4T1 del topo (cellule 4T1)¹⁶. Inoltre, Li et al. hanno fabbricato un substrato SERS 2D costituito da NP Au e nanofogli di ditellururo di afnio 2D per misurazioni SERS senza etichetta di batteri patogeni di origine alimentare¹⁷. Recentemente, i punti di carbonio (CD), buoni donatori di elettroni, sono stati usati come riducenti senza altri riducenti o irradiazione per sintetizzare Au@carbon nanosonde a punti (Au@CDs)¹⁸, che sono stati segnalati come materiali efficienti per migliorare l’attività SERS in base all’effetto di trasferimento di carica (CT) tra nuclei Au e gusci CD ^19,20. Inoltre, i CD sono riconosciuti come l’agente di tappatura e uno stabilizzatore per impedire alle NP di aggregare²¹. Inoltre, apre maggiori possibilità di reazioni con analiti, in quanto può fornire un gran numero di siti di legame e attivi²⁰. Sfruttando quanto sopra, Jin et al. hanno sviluppato un metodo rapido e controllabile per fabbricare NP Ag@CD con proprietà SERS uniche ed eccellenti attività catalitiche per il monitoraggio di reazioni catalitiche eterogenee in tempo reale¹⁸.

Qui, è stato dimostrato un metodo facile e a basso costo per la fabbricazione di substrati SERS Au@CD core-shell per identificare componenti cellulari e bioimaging cellulare vivo SERS label-free, nonché per rilevare e differenziare Escherichia coli (E. coli) e Staphylococcus aureus (S. aureus), che è promettente per la diagnosi precoce della malattia e una migliore comprensione dei processi cellulari.

Protocol

1. Fabbricazione di Au@CDs Nota : la Figura 1 illustra una procedura di fabbricazione per Au@CDs. Preparare la soluzione CD utilizzando acido citrico (CA) e acido gallico (GA) mediante una tipica procedura di trattamento idrotermale18. Aggiungere 100 μL di 3,0 mg mL-1 della soluzione CD preparata in 200 μL di acido cloroaurico 10 mM (HAuCl4) (vedere Tabella dei materiali</s…

Representative Results

La fabbricazione del Au@CDs è illustrata nella Figura 1. I CD sono stati preparati da CA e GA tramite un tipico processo idrotermale18. Au@CDs sono stati rapidamente sintetizzati riducendo HAuCl4 da CD in mezzi acquosi a temperatura ambiente. Le dimensioni e la morfologia dei CD e dei Au@CDs possono essere osservate da TEM e TEM23 ad alta risoluzione (HR). I CD preparati sono monodispersi con piccole dimens…

Discussion

In sintesi, Au@CDs con un guscio CD ultrasottile di 2,1 nm sono stati fabbricati con successo. I nanocompositi mostrano una sensibilità SERS superiore rispetto agli Au NP puri. Inoltre, Au@CDs possiedono eccellenti prestazioni in termini di riproducibilità e stabilità a lungo termine. Ulteriori ricerche includono l’assunzione di Au@CDs come substrati per eseguire l’imaging SERS delle cellule A549³¹ e per rilevare due ceppi batterici³². È stato dimostrato che Au@CDs può…

Materials

10x PBS buffer (Cell culture)	Langeco Technology	BL316A
6 well cell culture plate	LABSELECT	11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	GLPBIO	GK10001
Citric acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	C108869
CO2 incubator	Thermo Fisher Technologies	3111
Constant temperature magnetic agitator	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Cryogenic high speed centrifuge	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture medium	Procell	PM150210
Electronic balance	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Enzyme marker	Thermo Fisher Technologies	3111
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biological Technology	11011-8611
Figure 1	Figdraw.
Fourier infrared spectrometer	Thermo, America	Nicolet 380
Freeze dryer	Tecan	Infinite F50
Gallic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	G104228
Handheld Raman spectrometer	OCEANHOOD, Shanghai, China	Uspectral-PLUS
HAuCl4	Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscope	Thermo Fisher Technologies	FEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclave	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Yongxin Optical	XD-202
LB Broth BR	Huankai picoorganism	028320
Medical ultra-low temperature refrigerator	Thermo Fisher Technologies	ULTS1368
Methylene blue	Sigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive Solution	beyotime	C0207
Penicillin streptomycin double resistance	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Pure water meter	Millipore, USA	Milli-Q System
Raman spectrometer	Renishaw
Sapphire chip	beyotime
Thermostatic water bath	Changzhou Noki
Ultra-clean table	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometer	MADAPA, China	UV-6100S
Wire 3.4	Renishaw