Summary
En este estudio, desarrollamos una nanosonda de huellas dactilares basada en dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) de bajo costo con biocompatibilidad favorable para mostrar bioimágenes de células vivas sin marcadores y detectar dos cepas bacterianas, mostrando en detalle cómo obtener espectros SERS de células vivas en un método no destructivo.
Abstract
La tecnología de dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) ha atraído cada vez más atención en el campo biomédico debido a su capacidad para proporcionar información de huellas moleculares de muestras biológicas, así como a su potencial en el análisis de una sola célula. Este trabajo tiene como objetivo establecer una estrategia simple para el bioanálisis de SERS sin marcaje basada en nanosondas de puntos Au@carbon (Au@CDs). Aquí, los CD derivados de polifenoles se utilizan como reductor para sintetizar rápidamente nanoestructuras de Au@CD núcleo-capa, lo que permite un potente rendimiento de SERS incluso cuando la concentración de azul de metileno (MB) es tan baja como 10-9 M, debido al mecanismo cooperativo de mejora Raman. Para el bioanálisis, Au@CDs puede servir como un nanosensor SERS único para identificar los componentes celulares de las muestras biológicas (por ejemplo, células cancerosas y bacterias). Las huellas moleculares de diferentes especies se pueden distinguir aún más después de la combinación con el análisis de componentes principales. Además, Au@CDs también permiten obtener imágenes SERS sin etiquetas para analizar los perfiles de composición intracelular. Esta estrategia ofrece un bioanálisis SERS factible y sin marcas, lo que abre una nueva perspectiva para el nanodiagnóstico.
Introduction
El análisis de una sola célula es esencial para el estudio de la revelación de la heterogeneidad celular y la evaluación del estado integral de la célula. La respuesta instantánea de la célula al microambiente también justifica el análisis de una sola célula1. Sin embargo, existen algunas limitaciones en las técnicas actuales. La detección de fluorescencia se puede aplicar al análisis de una sola célula, pero está limitada por la baja sensibilidad. Otros desafíos surgen del complicado fondo de fluorescencia de las células y el fotoblanqueo de fluorescencia bajo irradiación a largo plazo2. La dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) puede calificar en términos de análisis de una sola célula debido a sus ventajas, que incluyen (1) reflejar la información intrínseca de la huella dactilar molecular y la situación instantánea, (2) sensibilidad superficial ultra alta, (3) detección múltiplex conveniente, (4) alta fotoestabilidad, (5) la detección se puede cuantificar para análisis comparativo, (6) evitar la autofluorescencia celular con la excitación de longitud de onda NIR, (7) la detección se puede realizar en un acuoso celular y (8) la detección se puede dirigir a una región específica dentro de la célula 3,4,5.
Existen dos mecanismos ampliamente reconocidos para entender el SERS como un fenómeno fundamental: el realce electromagnético (EM) como razón dominante y el realce químico (MC). EM se refiere, en una frecuencia dada del campo de excitación, a la oscilación de electrones colectivos impulsados por ondas electromagnéticas cuando la frecuencia de la luz incidente coincide con la frecuencia de los electrones libres que oscilan en el metal, dando lugar a la resonancia de plasmones superficiales (SPR). Cuando la SPR localizada (LSPR) se produce a través del láser incidente que incide en las nanopartículas metálicas (NP), conduce a la absorción o dispersión resonante de la luz incidente. En consecuencia, la intensidad del campo electromagnético superficial de los NP metálicos puede aumentarse de dos a cinco órdenes4. Sin embargo, la clave de la enorme mejora en SERS no es un solo NP de metal, sino el espacio entre dos NP, lo que crea puntos calientes. La CM se genera a partir de dos lados, incluyendo (1) las interacciones entre las moléculas diana y las NPs metálicas y (2) las moléculas diana que son capaces de transferir electrones hacia/desde las NPs metálicas 4,5. Se pueden encontrar detalles más exhaustivos en estos artículos de revisión 4,5. En la literatura previa se han presentado varios métodos prometedores para la biodetección y la obtención de imágenes de SERS en células vivas, por ejemplo, la detección de células apoptóticas6, proteínas en orgánulos7, miARN intracelulares8, membranas lipídicas celulares,9citocinas10 y metabolitos11 en células vivas, así como la identificación y monitorización de células mediante imágenes SERSconfocales 2, 11,12,13. Curiosamente, el SERS sin etiquetas presenta la ventaja única del SERS, que puede describir espectros moleculares internos5.
Un problema importante para los SERS sin etiquetas es un sustrato racional y confiable. Los sustratos SERS típicos son NP de metales nobles debido a su excelente capacidad para dispersar una gran cantidad de luz14. Hoy en día, se presta cada vez más atención a los nanocompuestos debido a sus notables propiedades físicas y químicas y su biocompatibilidad. Y lo que es más importante, los nanocompuestos pueden mostrar una mejor actividad SERS debido a la intensa EM inducida por los puntos calientes de los nanohíbridos y a la mejora química adicional procedente de otros materiales no metálicos15. Por ejemplo, Fei et al. utilizaron puntos cuánticos (QD) MoS 2 como reductores para sintetizar nanocompuestos de Au NP@MoS2QD para obtener imágenes SERS de infrarrojo cercano (NIR) sin etiquetas de células de cáncer de mama 4T1 de ratón (células 4T1)16. Además, Li et al. fabricaron un sustrato SERS 2D que consistía en NPs de Au y nanoláminas de diteluro de hafnio 2D para mediciones SERS sin marcaje de bacterias patógenas transmitidas por los alimentos17. Recientemente, los puntos de carbono (CD), buenos donantes de electrones, se han utilizado como reductores sin otros reductores o irradiación para sintetizar nanosondas de puntos de Au@carbon (Au@CDs)18, que se ha informado que son materiales eficientes para mejorar la actividad de SERS basada en el efecto de transferencia de carga (CT) entre los núcleos de Au y las capas de CD19,20. Más que eso, los CD son reconocidos como el agente de recubrimiento y un estabilizador para evitar que los Au NP agreguen21. Además, abre más posibilidades de reacciones con analitos, ya que puede proporcionar un gran número de sitios de unión y activos20. Aprovechando lo anterior, Jin et al. desarrollaron un método rápido y controlable para la fabricación de NPs Ag@CD con propiedades SERS únicas y excelentes actividades catalíticas para monitorear reacciones catalíticas heterogéneas en tiempo real18.
En este trabajo, se demostró un método fácil y de bajo costo para fabricar sustratos de SERS Au@CD core-shell para identificar componentes celulares y bioimágenes de células vivas SERS sin marcadores, así como para detectar y diferenciar Escherichia coli (E. coli) y Staphylococcus aureus (S. aureus), que es prometedor para el diagnóstico temprano de enfermedades y una mejor comprensión de los procesos celulares.
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Protocol
1. Fabricación de Au@CDs
NOTA: La Figura 1 ilustra un procedimiento de fabricación para Au@CDs.
- Prepare la solución de CD utilizando ácido cítrico (CA) y ácido gálico (GA) mediante un procedimiento típico de tratamiento hidrotermal18. Añadir 100 μL de 3,0 mg mL-1 de la solución de CD preparada en 200 μL de ácido cloroáurico 10 mM (HAuCl4) (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 10 s hasta que se produzca una suspensión púrpura.
- Centrifugar la suspensión púrpura a 4.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente y retirar suavemente el sobrenadante con una pipeta si es difícil eliminar el Au@CD coloides.
- Resuspender el Au@CDs con 200 μL de agua desionizada (resistividad de 18,2 MΩcm) para lavar el exceso de CDs.
- Repetir el paso 1.2 y obtener los NP core-shell, redispersados en 100 μL de agua desionizada, y almacenar a 4 °C. Los NP se pueden almacenar durante 1 mes.
2. Caracterización de Au@CDs
- Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
- Deje las muestras de CD y Au@CD durante la noche a -80 °C para liofilizar a partir de una solución congelada y triturar después de la liofilización hasta convertirlas en polvo.
- Dispersar adecuadamente las muestras de polvo obtenidas en el agua desionizada mediante sonicación, al 100% de potencia, durante 5 min.
- Deje caer unas gotas de la suspensión de la muestra en una rejilla TEM recubierta de Cu cubierta con una película de carbono de encaje y capture imágenes después del secado utilizando un microscopio electrónico de transmisión a un voltaje de aceleración de 200 kV (consulte la Tabla de materiales).
- Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR)
- Repita el paso 2.1.1 para obtener muestras de potencia, muela algunas partículas de KBr presecas en polvos en un mortero, agregue una pizca de la muestra y mezcle con los polvos de KBr simultáneamente para la caracterización IR16.
- Espectroscopía de absorbancia ultravioleta-visible-infrarrojo cercano (UV-vis-NIR)
- Preparar la suspensión de CD y Au@CDs con la concentración adecuada para garantizar que la absorbancia sea inferior a uno y realizar la caracterización UV-vis-NIR16.
- Espectros Raman
- Encienda el láser semiconductor de 785 nm, con una potencia láser de 10 mW y un aumento de objeción de 20x. Establezca la duración de la exposición en 5 s y el número de acumulaciones en tres.
- Agregue un volumen igual de muestras de Au@CDs preparadas en 5 μl de solución de azul de metileno (MB) y mezcle bien.
- Coloque una gota de suspensión sobre el sustrato de latón para recoger los espectros SERS.
3. Cultivo celular
- Cultivo de células de carcinoma epitelial de pulmón humano (células A549, aprobadas en el laboratorio) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
- Siembre las células en placas de 96 pocillos (1 × 105 células/pocillo) y trátelas con Au@CDs en diferentes concentraciones en el rango de 20-100 μM. Utilice un kit de ensayo CCK-8 para medir la viabilidad celular (consulte la Tabla de materiales). En cada tratamiento se utilizan tres duplicados independientes.
- Para realizar los experimentos SERS, siga los pasos que se indican a continuación:
- Coloque un chip de zafiro estéril (consulte la Tabla de materiales) en las placas de 12 pocillos y luego siembre las células en un solo pocillo con 1 ml de medio. Incubar las placas en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2durante la noche para alcanzar una confluencia del 70%-80%.
- Agregue el Au@CDs en el pocillo individual e incube durante 4-6 h.
NOTA: Antes de la incubación, pruebe la estabilidad de los sustratos, especialmente los NP en fase de solución. Estos materiales son susceptibles a la degradación a través de procesos de disolución, agregación y sedimentación durante el almacenamiento y el uso, lo que puede disminuir las pérdidas de EM y disminuir la actividad de SERS. Y lo que es más importante, en el caso de la absorción celular, podría verse afectada en gran medida por el tamaño de las NP22. - Durante la incubación, los sustratos entrarán en las células a través de la absorción endocítica. Después de la incubación, observe las células bajo un microscopio óptico hasta que se vean algunas partículas negras dentro de las células.
NOTA: Si la intensidad del SERS es débil, intente aumentar la concentración de Au@CD o prolongar el tiempo de incubación. - Retire el medio, enjuague suavemente las virutas de zafiro con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y sumérjalas en PBS para la detección de SERS16.
4. Experimentos de SERS celulares
- Abra la computadora, encienda el espectrómetro Raman, inicie el software y luego encienda el láser de 785 nm (consulte la tabla de materiales).
- Haga clic en Nueva medición e inicie una nueva adquisición espectral. Calibre17 con obleas de silicio antes de la medición de la muestra.
- Tome una lente de objetivo de 20x para asegurarse de que se observe una imagen celular clara, luego cambie la lente del objetivo a 50x. Ajuste la potencia del láser de baja a alta y el tiempo de exposición y las acumulaciones adecuadas.
NOTA: Antes de la medición del SERS, compruebe la potencia del láser adecuada para evitar daños irreversibles en la célula y asegúrese de que los parámetros de adquisición sean consistentes. La intensidad del SERS está relacionada con la potencia del láser, el tamaño del punto, la acumulación y el tiempo de exposición. - Elija un punto de celdas para medir y haga clic en Ejecutar. Cada celda se mide con 20 puntos y se miden 10 celdas para tomar el promedio.
NOTA: Los componentes intracelulares son complicados, lo que lleva a una amplia disparidad de espectros. Por lo tanto, tome espectros en regiones celulares similares y tome tantos espectros como sea posible. - Guarde los espectros.
- Haga clic en Nueva adquisición de imágenes optimizada, luego haga clic en Revisión de video, seleccione el rango que desea fotografiar y haga clic en Aceptar. Ajuste los parámetros: línea de borde de 785 nm, centro de 1.200 cm-1, duración de la exposición de 5 s, número de acumulaciones de tres y potencia del láser al 50%.
- Haga clic en Imágenes nuevas de vivo, elija Señal a línea de base, establezca el rango desde el primer límite 625 hasta el segundo límite 1.700 y, a continuación, haga clic en Configuración de área. A continuación, establezca los pasos adecuados y haga clic en Aplicar y Aceptar. Por último, haga clic en Ejecutar para empezar a realizar la creación de imágenes SERS.
5. Cultivo bacteriano y mediciones SERS
- Diluir durante la noche cultivos de E. coli y S. aureus (1:100) en 5 mL del nuevo medio Luria-Bertani (LB) (ver Tabla de Materiales). Después del crecimiento a 37 °C a A600 0,4 a 0,6, centrifugar el cultivo a 5.000 × g durante 5 min para granular las células.
- Vuelva a suspender los gránulos en 1 ml de PBS seguido de una centrifugación de 5.000 × g de 5 min (a temperatura ambiente) dos veces.
- Mezcle el cultivo bacteriano con el Au@CDs y observe la mezcla directamente debajo de la plataforma SERS.
6. Análisis de datos
- Suavizar los espectros y corregir la línea de base.
- Realizar análisis de componentes principales (PCA)16 con los datos procesados.
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Representative Results
La fabricación del Au@CDs se ilustra en la Figura 1. Los CD se prepararon a partir de CA y AG a través de un proceso hidrotermal típico18. Au@CDs sintetizaron rápidamente mediante la reducción de HAuCl4 por CD en medios acuosos a temperatura ambiente. El tamaño y la morfología de los CD y Au@CDs pueden ser observados por TEM y TEM23 de alta resolución. Los CD preparados son monodispersos con tamaños pequeños de casi 2-6 nm (Figura 2A). El núcleo esférico de Au está recubierto con una capa de capa de CD de aproximadamente 2,1 nm (Figura 2B, C y Figura 1 suplementaria).
Para confirmar las estructuras de los CD y Au@CDs, se registraron espectros FT-IR para analizar los grupos funcionales orgánicos (Figura 2D). La banda a 3.000-3.600/2.500-2.800 cm-1, 1.251/1.629 cm-1 y 1.471 cm-1 se puede asignar a la vibración de estiramiento O-H, la vibración de estiramiento C=O y la vibración de estiramiento C-O, respectivamente 24,25. Además, la banda vibratoria de estiramiento a 1.741 cm-1 está relacionada con C-C 24. Algunos de estos grupos funcionales de GA y CA también están presentes en CD y Au@CDs, lo que sugiere la síntesis exitosa de NP. Los espectros de absorción UV-vis de los CD tienen un pico característico a 265 nm, lo que indica una estructura aromática aislada en los núcleos de carbono26, que desaparece al reducirse. El espectro de Au@CDs exhibe un pico característico a 545 nm, que está asociado con la banda de absorción SPR del núcleo de Au, lo que indica la fabricación de la nanoestructura compuesta (Figura 2E).
Como se muestra en la Figura 3A, B, incluso cuando la concentración de MB es tan baja como 10-9 M, Au@CDs exhiben un excelente rendimiento de SERS en comparación con las NP de Au. El factor de mejora (FE) puede calcularse mediante la siguiente ecuación16, donde I SERS e I 0 se refieren a las intensidades Raman del espectro SERS y Raman normal, respectivamente, y C SERS y C0 se refieren a las concentraciones de las moléculas de sustrato utilizadas para las mediciones SERSy Raman, respectivamente. Tomando 1.620 cm-1 de MB para calcular, el FE de Au@CDs es de casi 2,1 × 105, que es aproximadamente tres veces más fuerte que el de los NP de Au (6,8 × 104).
Se pueden detectar algunos picos característicos, como 770 cm-1 (flexión en el plano de C-H), 1.398 cm-1 (estiramiento simétrico de C-N) y 1.625 cm-1 (estiramiento del anillo C-C), lo que es consistente con la literatura reportada27. Al mismo tiempo, se detectan 10-5 M a 10-9 M de MB, tomando la banda SERS a 1.620 cm-1 para su cuantificación; la relación lineal se define como y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922) (Figura 3B). Además de la sensibilidad, la reproducibilidad y la estabilidad a largo plazo son indicadores importantes para los sustratos SERS. Por lo tanto, los espectros SERS se adquirieron en 20 puntos al azar, exhibiendo alta similitud entre ellos (Figura 3C,D); Se recolectaron cuatro espectros durante 1 mes, los picos característicos de MB aún se detectaron 1 mes después de la colocación a 4 °C, y la actividad promedio de SERS a 950 cm-1, 1,185 cm-1 y 1,620 cm-1 solo mostró un grado de decaimiento de alrededor de 5.43%, 11.44% y 13.94%, respectivamente (Figura 3E), lo que indica la buena reproducibilidad y estabilidad a largo plazo de Au@CD sustratos.
En las mediciones de SERS de las células actuales, en primer lugar, se comprobó la citotoxicidad de las NPs. Au@CDs (20-100 μM) apenas mostraron citotoxicidad para las células A549 (Figura 3F). Los resultados anteriores sugieren el alto potencial de Au@CDs para ser aplicados a las mediciones de SERS sin marcaje en células vivas. Como se muestra en la Figura 4, el sustrato SERS ensamblado en Au@CD proporciona un mapeo SERS integrado de los componentes celulares de 800 a 1.700 cm-1. Se ha observado que Au@CD agregados NP exhiben señales SERS obvias sin ruido de fondo en el mapeo SERS de las celdas A549 (Figura 4B). En la Figura 4C se muestran tres espectros de diferentes puntos celulares, lo que demuestra la heterogeneidad de los componentes en varias regiones citoplasmáticas y la superioridad de las Au@CDs como sondas SERS para el análisis de una sola célula. El espectro medio de las células A549 se muestra en la Figura 4A, y se puede observar abundante información celular. En el Cuadro 1 se detallan las asignaciones de crestas características.
Además, Au@CDs también demuestran una buena capacidad para detectar y diferenciar dos cepas bacterianas. Los espectros obtenidos son bastante similares a los publicados en la literatura para E. coli y S. aureus, como la fenilalanina a 1.030 cm-1 y una respiración en anillo de ácido nucleico a 741 cm-1 (Figura 5A, B), lo que verifica la fiabilidad de las mediciones de SERS28. En el Cuadro 2 se detallan las asignaciones de crestascaracterísticas 28,29,30,31. El modelo PCA también discrimina bien (Figura 5C,D).
Figura 1: Ilustración esquemática de la vía de síntesis del Au@CDs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización representativa de los CD y Au@CDs. (A) Imagen HRTEM de los CD. Barra de escala: 10 nm. (B) Imagen TEM de Au@CDs. Barra de escala: 100 nm. (C) Imagen HRTEM de la región de interfaz de Au@CDs. Barra de escala: 10 nm; Recuadro: 2 nm. (D) Espectros FT-IR de AG en bruto, CA y CD y Au@CDs preparados. (E) Espectros de absorción UV-vis de CDs, Au NPs y Au@CDs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Actividades SERS de Au@CDs. (A) Espectros SERS de MB a granel (10-5 M, línea negra) y la solución MB 10-9 M (línea azul y línea verde). (B) Espectros SERS de MB a diferentes concentraciones (10-9-10-5 M). Insertar: La relación lineal de la banda SERS a 1.620 cm-1 de MB, y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922). Resultados de los experimentos de reproducibilidad del sustrato SERS (C), histograma de desviación estándar relativa (RSD) (pico de MB de 1.620 cm-1 a 10-7 M) (D) y estabilidad a largo plazo (E). (F) Viabilidad celular de las células A549 después de 24 h de incubación con el gradiente de concentración Au@CD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de huellas dactilares e imágenes SERS sin etiquetas de células A549. (A) Espectro SERS medio de las células A549. (B) El campo claro, el mapeo SERS y las imágenes fusionadas de las celdas A549. Barras de escala: 20 μm. (C) Espectros SERS de diferentes puntos de celda marcados en la imagen combinada de 1, 2 y 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de huellas dactilares de dos cepas bacterianas. Los espectros medios del SERS de E. coli (A) y S. aureus (B). El PCA 2D (C) y el PCA 3D (D) en el análisis diferencial de dos cepas bacterianas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Asignaciones para los picos Raman de las células A549. Abreviaturas: Pro = prolina; HYP = hidroxiprolina; Tyr = tirosina; Trp = tripotófano; Phe = fenilalanina; A = adenina; T = timina; C = citosina; G = guanina; doblar = doblar; str = estiramiento; def = deformación; torsión = torsión; aliento = respiración; wag = meneando; sym = simétrico; asimétrico = asimétrico; BK = columna vertebral. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Asignaciones para los picos Raman de E. coli y S. aureus. Abreviaturas: Tyr = tirosina; Phe = fenilalanina; A = adenina; G = guanina; str = estiramiento; def = deformación; aliento = respiración; sym = simétrico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Figura complementaria 1: Estudio dinámico de dispersión de luz de Au@CDs. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En resumen, se han fabricado con éxito Au@CDs con una carcasa de CD ultrafina de 2,1 nm. Los nanocompuestos muestran una sensibilidad SERS superior a la de los NP de Au puros. Además, Au@CDs poseen un excelente rendimiento en reproducibilidad y estabilidad a largo plazo. Otras investigaciones incluyen la toma de Au@CDs como sustratos para realizar imágenes SERS de células A54931 y para detectar dos cepas bacterianas32. Se ha demostrado que Au@CDs puede utilizarse como una sonda SERS ultrasensible basada principalmente en la mejora química entre Au NPs y CDs.
Hay algunos puntos clave durante las mediciones de SERS en el protocolo anterior. En primer lugar, antes de aplicar Au@CDs en células y muestras bacterianas, es necesario garantizar una fórmula de sustrato SERS superior, así como la concentración adecuada, que puede verificarse mediante moléculas de colorante. Por lo tanto, el espectro SERS es inconsistente en todos los puntos celulares porque las muestras biológicas son complejas y dinámicas.
Si se toma un punto láser más grande, el espectro SERS de diferentes puntos será más similar. Cabe destacar que el espectro SERS del mismo punto celular puede no estar de acuerdo con diferentes potencias láser. Es bien aceptado que el espectro promedio de SERS de muestras biológicas es consistente; por lo tanto, es fundamental obtener el espectro SERS en las mismas regiones celulares tanto como sea posible y luego promediar varias regiones celulares diferentes. Además, la sensibilidad de detección del SERS intracelular se ve fácilmente afectada por las señales de fondo. Las señales de fondo Raman provienen principalmente de tres aspectos, que incluyen (1) un sustrato, como zafiro, oblea de silicio, etc., (2) una sonda SERS y (3) muestras biológicas. En consecuencia, se recomienda elegir sustratos sin ruido de fondo siempre que sea posible, aunque esto es difícil.
En comparación con la espectroscopia Raman convencional, SERS puede mejorar sustancialmente la intensidad de la señal en varios órdenes de magnitud33. En este trabajo, se eligió el oro para la fabricación de NPs compuestas porque poseía una mejor capacidad para optimizar el tamaño y la forma, siendo menos citotóxico y químicamente más inerte y robusto que la plata34. Mientras tanto, las carcasas de CD adheridas a superficies de Au pueden reducir las interacciones entre las células y los NP metálicos33. En conclusión, los resultados anteriores demostraron que el SERS sin marcaje es una técnica no invasiva y no destructiva, que puede proporcionar una composición química intrínseca de los analitos a nivel de una sola célula35.
Estudios previos han demostrado que es esencial controlar el entorno y el tiempo de detección adecuados en caso de distorsión de la información nativa de las huellas dactilares5. Por lo tanto, es esencial asegurarse de que no haya daños en las células, con el objetivo de obtener espectros fiables. Otros desafíos incluyen: (1) para las mediciones intracelulares de SERS, las Au NP activas en SERS pueden interactuar con componentes intracelulares como proteínas, lípidos o ácidos nucleicos4. Por lo tanto, es necesario tener en cuenta la biocompatibilidad y las asignaciones de señales SERS; (2) la exposición constante al láser durante la detección de SERS puede dañar la citotoxicidad celular o las muestras biológicas; y (3) como se muestra en la Figura 5A, B, la plataforma SERS portátil todavía tiene algunas limitaciones, ya sea que la intensidad Raman o las señales que se pueden detectar no sean buenas, como se muestra en la Figura 4.
Además, cuando se combinan con otras tecnologías como la microfluídica de gotas 36, el aprendizaje profundo37, el aprendizaje automático 38, la tecnología de amplificación de ensamblaje de horquilla catalítica39 y la tecnología de fluorescencia40, estas estrategias integradas pueden desarrollar la superioridad de SERS.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32071399 y 62175071), el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (2019050001), la Fundación de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (2021A1515011988) y la Fundación Abierta del Laboratorio Clave de Ciencia y Tecnología Optoelectrónica para la Medicina (Universidad Normal de Fujian), Ministerio de Educación, China (JYG2009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
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