Summary
במחקר זה, פיתחנו ננו-פרובש טביעות אצבע מבוסס פיזור ראמאן (SERS) בעלות נמוכה עם תאימות ביולוגית חיובית כדי להראות הדמיה ביולוגית של תאים חיים ללא תוויות ולזהות שני זני חיידקים, ולהראות בפירוט כיצד להשיג ספקטרום SERS של תאים חיים בשיטה לא הרסנית.
Abstract
טכנולוגיית פיזור ראמאן משופרת פני השטח (SERS) משכה יותר ויותר תשומת לב בתחום הביו-רפואי בשל יכולתה לספק מידע מולקולרי על טביעות אצבע של דגימות ביולוגיות, כמו גם הפוטנציאל שלה באנליזה של תא יחיד. עבודה זו שואפת לבסס אסטרטגיה פשוטה לביואנליזה של SERS ללא תוויות המבוססת על ננו-גשושיות Au@carbon נקודות (Au@CDs). כאן, תקליטורים שמקורם בפוליפנולים משמשים כרדוקציה לסנתז במהירות ננו-מבנים Au@CD של מעטפת הליבה, מה שמאפשר ביצועי SERS רבי עוצמה גם כאשר ריכוז מתילן כחול (MB) נמוך עד 10-9 M, הודות למנגנון שיפור הרמאן השיתופי. עבור ביואנליזה, Au@CDs יכול לשמש כננו-חיישן SERS ייחודי לזיהוי המרכיבים התאיים של דגימות ביולוגיות (למשל, תאים סרטניים וחיידקים). ניתן להבדיל עוד יותר בין טביעות האצבע המולקולריות של מינים שונים לאחר שילוב עם ניתוח המרכיבים העיקריים. בנוסף, Au@CDs גם מאפשרים הדמיית SERS ללא תוויות כדי לנתח פרופילי הרכב תוך-תאיים. אסטרטגיה זו מציעה ביואנליזה אפשרית ונטולת תוויות של SERS, ופותחת אפשרות חדשה לננו-דיאגנוזה.
Introduction
אנליזה של תא בודד חיונית לחקר חשיפת ההטרוגניות התאית ולהערכת המצב המקיף של התא. התגובה המיידית של התא למיקרו-סביבה מצדיקה גם אנליזה של תא בודד1. עם זאת, ישנן כמה מגבלות לטכניקות הנוכחיות. זיהוי פלואורסצנטי יכול להיות מיושם על אנליזה של תא יחיד, אך הוא מוגבל על ידי רגישות נמוכה. אתגרים אחרים נובעים מהרקע הפלואורסצנטי המסובך של התאים וההלבנה הפלואורסצנטית תחת קרינה ארוכת טווח2. פיזור ראמאן משופר פני השטח (SERS) עשוי להתאים מבחינת אנליזה של תא בודד בשל יתרונותיו, כולל (1) שיקוף המידע המולקולרי הפנימי של טביעות האצבע והמצב המיידי, (2) רגישות פני שטח גבוהה במיוחד, (3) זיהוי מולטיפלקס נוח, (4) יציבות אור גבוהה, (5) ניתן לכמת זיהוי לצורך ניתוח השוואתי, (6) הימנעות מפלואורסצנטיות תאית עם עירור אורך גל NIR, (7) ניתן לבצע גילוי במימי תאי ניתן לכוון את הזיהוי לסביבה ו-(8) לאזור ספציפי בתוך התא 3,4,5.
ישנם שני מנגנונים מוכרים באופן נרחב להבנת SERS כתופעה בסיסית: שיפור אלקטרומגנטי (EM) כסיבה דומיננטית ושיפור כימי (CM). EM מתייחס, בתדירות נתונה של השדה המרגש, לתנודה של אלקטרונים קולקטיביים המונעים על ידי גלים אלקטרומגנטיים כאשר תדירות אור האירוע תואמת את תדירות האלקטרונים החופשיים המתנדנדים במתכת, מה שיוצר תהודה פלסמונית פני השטח (SPR). כאשר SPR מקומי (LSPR) מתרחש באמצעות לייזר האירוע הפוגע בננו-חלקיקי המתכת (NPs), זה מוביל לבליעת התהודה או פיזור של אור האירוע. כתוצאה מכך, עוצמת השדה האלקטרומגנטי על פני השטח של NPs מתכת יכולה להיות משופרת על ידי שניים עד חמישה סדרים4. עם זאת, המפתח לשיפור העצום ב- SERS אינו NP מתכתי יחיד, אלא הפער בין שני NPs, מה שיוצר נקודות חמות. CM נוצר משני צדדים, כולל (1) אינטראקציות בין מולקולות מטרה ו-NPs מתכתיים ו-(2) מולקולות מטרה המסוגלות להעביר אלקטרונים אל NPsמתכת 4,5 וממנה. פרטים ממצים יותר ניתן למצוא במאמרי סקירהאלה 4,5. מספר שיטות מבטיחות לחישה ביולוגית ודימות SERS בתאים חיים הוצגו בספרות קודמת, למשל, זיהוי תאים אפופטוטיים6, חלבונים באברונים7, miRNA תוך תאי8, קרומי שומנים תאיים,9 ציטוקינים10, ומטבוליטים 11 בתאים חיים, כמו גם זיהוי וניטור של תאים על ידי דימות SERS קונפוקלי2, 11,12,13. באופן מעניין, SERS ללא תוויות מציג את היתרון הייחודי של SERS, שיכול לתאר ספקטרום מולקולרי פנימי5.
בעיה מרכזית עבור SERS ללא תוויות היא מצע רציונלי ואמין. מצעי SERS טיפוסיים הם NPs מתכת אצילה בגלל היכולת המצוינת שלהם לפזר הרבה אור14. כיום, יותר ויותר תשומת לב מוקדשת לננו-מרוכבים בשל התכונות הפיזיקליות והכימיות המדהימות שלהם והתאימות הביולוגית. באופן משמעותי יותר, ננו-מרוכבים יכולים להראות פעילות SERS טובה יותר בגלל הקרינה האלקטרומגנטית האינטנסיבית הנגרמת על ידי הנקודות החמות בננו-היברידים ושיפור כימי נוסף שמקורו בחומרים אחרים שאינם מתכתיים15. לדוגמה, Fei et al. השתמשו בנקודות קוונטיות MoS 2 (QDs) כמפחיתים כדי לסנתז ננו-מרוכבים Au NP@MoS2QD עבור הדמיית SERS של תאי סרטן שד 4T1 של עכבר 4T1 (תאי 4T1)16. כמו כן, Li et al. יצרו מצע SERS דו-ממדי המורכב מננו-יריעות Au NPs ו-2D hafnium ditelluride למדידות SERS נטולות תוויות של חיידקים פתוגניים הנישאים במזון17. לאחרונה, נקודות פחמן (CDs), תורמי אלקטרונים טובים, שימשו כמפחיתים ללא רדוקטנטים אחרים או קרינה כדי לסנתז ננו-גשושיות Au@carbon נקודות (Au@CDs)18, אשר דווחו כחומרים יעילים לשיפור פעילות SERS בהתבסס על אפקט העברת מטען (CT) בין ליבות Au ופגזי CD19,20. יותר מזה, תקליטורים מוכרים כסוכן מכסה ומייצב כדי למנוע Au NPs לצבור21. בנוסף, הוא פותח אפשרויות נוספות לתגובות עם אנליטים, שכן הוא יכול לספק מספר רב של אתרים מחייבים ופעילים20. תוך ניצול האמור לעיל, Jin et al. פיתחו שיטה מהירה ונשלטת לייצור NPs Ag@CD עם תכונות SERS ייחודיות ופעילויות קטליטיות, מצוינות לניטור תגובות קטליטיות, הטרוגניות בזמן אמת18.
כאן הודגמה שיטה קלה וזולה לייצור מצעי SERS Au@CD מעטפת ליבה לזיהוי רכיבים תאיים והדמיה ביולוגית של תאים חיים ללא תוויות SERS, כמו גם לזיהוי והבחנה בין Escherichia coli (E. coli) ו- Staphylococcus aureus (S. aureus), הטומנת בחובה הבטחה לאבחון מוקדם של מחלות ולהבנה טובה יותר של תהליכים תאיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. המצאת Au@CDs
הערה: איור 1 מדגים הליך ייצור עבור Au@CDs.
- הכן תמיסת CD באמצעות חומצת לימון (CA) וחומצה גאלית (GA) באמצעות הליך טיפול הידרותרמי טיפוסי18. הוסף 100 μL של 3.0 מ"ג mL-1 של תמיסת CD מוכן לתוך 200 μL של 10 mM חומצה כלורואורית (HAuCl4) (ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר במשך 10 שניות עד לקבלת תרחיף סגול.
- צנטריפוגו את המתלה הסגול ב-4,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והוציאו בעדינות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה אם קשה להסיר את Au@CD הקולואידים.
- השהה מחדש את Au@CDs עם 200 μL של מים deionized (התנגדות של 18.2 MΩcm) כדי לשטוף את עודפי CDs.
- חזור על שלב 1.2 וקבל את NPs קליפת הליבה, מפוזרים מחדש ב 100 μL של מים deionized, ולאחסן ב 4 ° C. ניתן לאחסן את NPs למשך חודש אחד.
2. אפיון Au@CDs
- מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
- השאירו את דגימות ה-CD וה-Au@CD למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C כדי לבצע ליופיליזציה מתמיסה קפואה ולמחוץ לאחר ליופיליזציה לאבקה.
- פזרו את דגימות האבקה המתקבלות לתוך המים שעברו דה-יוניזציה כראוי על ידי סוניקציה, בעוצמה של 100%, למשך 5 דקות.
- שחררו כמה טיפות של מתלה הדגימה על רשת TEM מצופה Cu המכוסה בסרט פחמן תחרה, וצלמו תמונות לאחר הייבוש באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת במתח תאוצה של 200 קילו-וולט (ראו טבלת חומרים).
- ספקטרוסקופיית אינפרא אדום התמרת פורייה (FT-IR)
- חזור על שלב 2.1.1 כדי לקבל דגימות כוח, טחן כמה חלקיקי KBr מיובשים מראש לאבקות במכתש, הוסף קמצוץ מהדגימה וערבב עם אבקות KBr בו זמנית לאפיון IR16.
- ספקטרוסקופיית ספיגה אולטרה סגול-נראה-קרוב אינפרא אדום (UV-vis-NIR)
- הכינו את המתלה של תקליטורים Au@CDs בריכוז מתאים כדי לוודא שהספיגה תהיה פחות מאחת ובצעו אפיון UV-vis-NIR16.
- ספקטרום ראמאן
- הפעל את לייזר המוליכים למחצה 785 ננומטר, עם עוצמת לייזר של 10 mW והגדלה התנגדות של פי 20. הגדר את משך החשיפה ל- 5 שניות ואת מספר ההצטברות לשלוש.
- הוסף נפח שווה של דגימות Au@CDs מוכנות ל- 5 μL של תמיסת מתילן כחול (MB) וערבב היטב.
- הניחו טיפה של מתלה על מצע הפליז כדי לאסוף את ספקטרום SERS.
3. תרבית תאים
- תרבית תאי קרצינומה ריאתיים אפיתליאליים אנושיים (תאי A549, עברו במעבדה) בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ודגרים באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- זרעו את התאים בצלחות של 96 בארות (1 × 10,5 תאים/באר) וטפלו עם Au@CDs בריכוזים שונים בטווח של 20-100 מיקרומטר. השתמשו בערכת בדיקה CCK-8 כדי למדוד את כדאיות התא (ראו טבלת חומרים). בכל טיפול נעשה שימוש בכפילויות עצמאיות.
- לביצוע ניסויי SERS, בצע את השלבים הבאים:
- הכניסו שבב ספיר סטרילי (ראו טבלת חומרים) לצלחות של 12 בארות ואז זרעו את התאים על באר אחת עם 1 מ"ל של תווך. דגרו על הצלחות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2למשך הלילה כדי להגיע למפגש של 70%-80%.
- מוסיפים את Au@CDs לבאר הבודדת ודגרים במשך 4-6 שעות.
הערה: לפני הדגירה, בדוק את יציבות המצעים, במיוחד NPs בשלב התמיסה. חומרים אלה רגישים להתכלות באמצעות תהליכי פירוק, צבירה ושיקוע במהלך אחסון ושימוש, מה שעשוי להפחית הפסדי EM ולהפחית את פעילות SERS. באופן משמעותי יותר, עבור ספיגה תאית, זה יכול להיות מושפע במידה רבה על ידי גודל NPs22. - במהלך הדגירה, הסובסטרטים ייכנסו לתאים באמצעות ספיגה אנדוציטית. לאחר הדגירה, התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ אופטי עד שכמה חלקיקים שחורים נראים בתוך התאים.
הערה: אם עוצמת ה-SERS חלשה, נסה לשפר את ריכוז Au@CD או להאריך את זמן הדגירה. - הסר את המדיום, שטוף בעדינות את שבבי הספיר במי מלח חוצצי פוספט (PBS), וטבול אותם ב- PBS לזיהוי SERS16.
4. ניסויים ב-Cell SERS
- פתח את המחשב, הפעל את ספקטרומטר ראמאן, הפעל את התוכנה ולאחר מכן הפעל את הלייזר 785 ננומטר (ראה טבלת חומרים).
- לחץ על מדידה חדשה והתחל רכישה ספקטרלית חדשה. כייל17 עם פרוסות סיליקון לפני מדידת הדגימה.
- קח עדשת אובייקטיבי 20x כדי להבטיח תמונה סלולרית ברורה נצפית, ולאחר מכן שנה את עדשת המטרה ל 50x. הגדר את עוצמת הלייזר מנמוך לגבוה ואת זמן החשיפה וההצטברות המתאימים.
הערה: לפני מדידת SERS, בדוק את עוצמת הלייזר המתאימה כדי למנוע נזק בלתי הפיך לתאים וודא שהפרמטרים של הרכישה עקביים. עוצמת SERS קשורה לעוצמת לייזר, גודל ספוט, הצטברות וזמן חשיפה. - בחר נקודת תאים למדידה ולחץ על הפעל. כל תא נמדד על ידי 20 נקודות, ו -10 תאים נמדדים כדי לקחת את הממוצע.
הערה: רכיבים תוך-תאיים הם מורכבים, מה שמוביל לפער ספקטרום רחב. לכן, קחו ספקטרום באזורים תאיים דומים וקחו כמה שיותר ספקטרום. - שמור את הספקטרה.
- לחץ על New Streamline image acquisition, לאחר מכן לחץ על סקירת וידאו, בחר את הטווח לצילום ולחץ על אישור. הגדר את הפרמטרים: ייעול קצה של 785 ננומטר, מרכז של 1,200 ס"מ-1, משך חשיפה של 5 שניות, מספר הצטברות של שלוש ועוצמת לייזר של 50%.
- לחץ על הדמיה חדשה של חיים, בחר אות לקו בסיס, הגדר את הטווח ממגבלה ראשונה 625 למגבלה שנייה 1,700, ולאחר מכן לחץ על הגדרת אזור. לאחר מכן הגדר את השלבים המתאימים ולחץ על החל ואישור. לבסוף, לחץ על הפעל כדי להתחיל לבצע הדמיית SERS.
5. תרבית חיידקים ומדידות SERS
- דילול תרביות לילה של E. coli ו- S. aureus (1:100) ב- 5 מ"ל של התווך החדש לוריא-ברטאני (LB) (ראה טבלת חומרים). לאחר צמיחה ב 37 ° C ל A600 0.4 עד 0.6, צנטריפוגה את התרבית ב 5,000 × גרם במשך 5 דקות כדי לגלול את התאים.
- השהה מחדש את הכדוריות ב 1 מ"ל של PBS ולאחר מכן 5 דקות 5,000 × גרם צנטריפוגה (בטמפרטורת החדר) פעמיים.
- ערבבו את תרבית החיידקים עם Au@CDs והתבוננו בתערובת ישירות מתחת לפלטפורמת SERS.
6. ניתוח נתונים
- החלק את הספקטרום ותקן את קו הבסיס.
- בצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA)16 עם הנתונים המעובדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ייצור Au@CDs מומחש באיור 1. התקליטורים הוכנו מ-CA ומ-GA בתהליך הידרותרמי טיפוסי18. Au@CDs סונתזו במהירות על ידי הפחתת HAuCl4 על ידי תקליטורים במדיה מימית בטמפרטורת החדר. ניתן לראות את הגודל והמורפולוגיה של תקליטורים Au@CDs על ידי TEM ורזולוציה גבוהה (HR)TEM23. התקליטורים המוכנים מפוזרים בגדלים קטנים של כמעט 2-6 ננומטר (איור 2A). גרעין Au הכדורי מצופה בשכבה של מעטפת CD של כ-2.1 ננומטר (איור 2B,C ואיור משלים 1).
כדי לאשר את המבנים של תקליטורים ו-Au@CDs, ספקטרום FT-IR הוקלט כדי לנתח את הקבוצות הפונקציונליות האורגניות (איור 2D). ניתן להקצות את הרצועה ב-3,000-3,600/2,500-2,800 סמ-1, 1,251/1,629 סמ-1 ו-1,471 ס"מ-1 לרטט מתיחה O-H, רטט מתיחה C=O ורטט מתיחה C-O, בהתאמה 24,25. כמו כן, רצועת הרטט המתיחה ב 1,741 cm-1 קשורה C-C 24. כמה מהקבוצות הפונקציונליות הללו מ-GA ו-CA קיימות גם בתקליטורים וב-Au@CDs, מה שמרמז על סינתזה מוצלחת של NPs. ספקטרום בליעת UV-vis של תקליטורים הוא בעל שיא אופייני של 265 ננומטר, דבר המצביע על מבנה ארומטי מבודד בליבות פחמן26, אשר נעלם עם החיזור. הספקטרום של Au@CDs מציג שיא אופייני של 545 ננומטר, אשר קשור לרצועת בליעת SPR של גרעין Au, מה שמצביע על ייצור של ננו-מבנה מרוכב (איור 2E).
כפי שניתן לראות באיור 3A,B, אפילו כאשר ריכוז MB נמוך עד 10-9 M, Au@CDs מציגים ביצועי SERS מצוינים בהשוואה ל-Au NPs. ניתן לחשב את מקדם ההשבחה (EF) באמצעות המשוואה הבאה16, כאשר I SERS ו- I 0 מתייחסים לעוצמות הרמאן של ספקטרום SERS ו- Raman נורמלי, בהתאמה, ו- C SERS ו- C 0 מתייחסים לריכוזים של מולקולות המצע המשמשות למדידות SERSו- Raman, בהתאמה. אם ניקח 1,620 cm-1 של MB לחשב, EF של Au@CDs הוא כמעט 2.1 × 105, שהוא בערך פי שלושה חזק יותר מזה של Au NPs (6.8 × 104).
ניתן לזהות מספר פסגות אופייניות, כגון 770 cm-1 (כיפוף במישור של C-H), 1,398 cm-1 (מתיחה סימטרית של C-N), ו-1,625 cm-1 (מתיחת טבעת C-C), העולה בקנה אחד עם ספרותמדווחת 27. במקביל, 10-5 M עד 10-9 M של MB מזוהים, לוקח את רצועת SERS ב 1,620 cm-1 לכימות; הקשר הליניארי מוגדר כ- y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922) (איור 3B). בנוסף לרגישות, יכולת שחזור ויציבות לטווח ארוך הם אינדיקטורים משמעותיים עבור מצעי SERS. לכן, ספקטרום SERS נרכש על 20 נקודות באופן אקראי, והראה דמיון רב ביניהן (איור 3C,D); ארבעה ספקטרום נאספו במהלך חודש אחד, הפסגות האופייניות של MB עדיין זוהו חודש לאחר המיקום ב-4°C, ופעילות ה-SERS הממוצעת ב-950 cm-1, 1,185 cm-1 ו-1,620 cm-1 הראתה רק דרגת דעיכה של כ-5.43%, 11.44% ו-13.94%, בהתאמה (איור 3E), מה שמצביע על יכולת שחזור טובה ויציבות ארוכת טווח של מצעים Au@CD.
במדידות SERS התא הנוכחיות, ראשית, נבדקה ציטוטוקסיות של NPs. Au@CDs (20-100 מיקרומטר) בקושי הראה ציטוטוקסיות לתאי A549 (איור 3F). התוצאות לעיל מצביעות על הפוטנציאל הגבוה של Au@CDs להיות מיושם על מדידות SERS ללא תוויות בתאים חיים. כפי שניתן לראות באיור 4, מצע SERS מורכב Au@CD מספק מיפוי SERS משולב של רכיבי התא מ-800 עד 1,700 סמ"ק-1. נצפה כי צברי NP Au@CD מציגים אותות SERS ברורים ללא רקע רעש במיפוי SERS של תאי A549 (איור 4B). שלושה ספקטרום מנקודות תא שונות מוצגים באיור 4C, ומדגימים את ההטרוגניות של רכיבים באזורים ציטופלזמיים שונים ואת עליונותו של Au@CDs כגשושיות SERS לאנליזה של תא יחיד. הספקטרום הממוצע של תאי A549 מוצג באיור 4A, וניתן לראות שפע של מידע תאי. מטלות שיא אופייניות מפורטות מופיעות בטבלה 1.
בנוסף, Au@CDs גם מפגינים יכולת טובה לזהות ולהבדיל בין שני זני חיידקים. הספקטרום המתקבל דומה למדי לספרות שפורסמה עבור E. coli ו- S. aureus, כגון פנילאלנין ב- 1,030 cm-1 ונשימה טבעתית של חומצת גרעין ב- 741 cm-1 (איור 5A, B), אשר מאמתת את האמינות של מדידות SERS28. הקצאות שיא אופייניות מפורטות28,29,30,31 מובאות בטבלה 2. גם מודל ה-PCA מפלה היטב (איור 5C,D).
איור 1: המחשה סכמטית של מסלול הסינתזה של Au@CDs. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אפיון מייצג של תקליטורים ו-Au@CDs. (A) תמונת HRTEM של תקליטורים. סרגל קנה מידה: 10 ננומטר. (B) תמונת TEM של Au@CDs. סרגל קנה מידה: 100 ננומטר. (C) תמונת HRTEM של אזור הממשק של Au@CDs. סרגל קנה מידה: 10 ננומטר; כניסה: 2 ננומטר. (D) ספקטרום FT-IR של GA גולמי, CA ותקליטורים Au@CDs שהוכנו כפי שהוכנו. (E) ספקטרום בליעת UV-vis של תקליטורים, Au NPs ו- Au@CDs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פעילויות SERS של Au@CDs. (A) ספקטרום SERS של MB בתפזורת (10-5 M, קו שחור) ופתרון 10-9 M MB (קו כחול וקו ירוק). (B) ספקטרום SERS של MB בריכוזים שונים (10-9-10-5 M). הוספה: הקשר הליניארי של רצועת SERS ב- 1,620 cm-1 של MB, y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922). תוצאות ניסויי שחזור מצע SERS (C), היסטוגרמה של סטיית תקן יחסית (RSD) (1,620 ס"מ-1 שיא של MB ב-10-7 מטר) (D), וניסויי יציבות לטווח ארוך (E). (F) כדאיות תאים של תאי A549 לאחר 24 שעות של דגירה עם שיפוע ריכוז Au@CD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח טביעות אצבע והדמיית SERS ללא תוויות של תאי A549. (A) ספקטרום SERS ממוצע של תאי A549. (B) השדה הבהיר, מיפוי SERS ותמונות ממוזגות של תאי A549. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (C) ספקטרום SERS של נקודות תא שונות המסומנות בתמונה הממוזגת של 1, 2 ו- 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח טביעות אצבע של שני זני חיידקים. ספקטרום SERS הממוצע של E. coli (A) ו- S. aureus (B). 2D PCA (C) ו- 3D PCA (D) על ניתוח דיפרנציאלי של שני זני חיידקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: הקצאות לפסגות ראמאן של תאי A549. קיצורים: Pro = proline; HYP = הידרוקסיפרולין; צור = טירוזין; Trp = טריפוטופן; Phe = פנילאלנין; A = אדנין; T = תימין; C = ציטוזין; G = גואנין; כיפוף = כיפוף; str = מתיחה; def = דפורמציה; טוויסט = פיתול; נשימה = נשימה; לכשכש = לכשכש; סים = סימטרי; asym = אסימטרי; bk = עמוד שדרה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: מטלות לפסגות הרמאן של E. coli ו-S. aureus. קיצורים: צור = טירוזין; Phe = פנילאלנין; A = אדנין; G = גואנין; str = מתיחה; def = דפורמציה; נשימה = נשימה; SYM = סימטרי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור משלים 1: מחקר פיזור אור דינמי של Au@CDs. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לסיכום, Au@CDs עם מעטפת CD דקה במיוחד של 2.1 ננומטר יוצרו בהצלחה. הננו-מרוכבים מראים רגישות SERS גבוהה יותר מאשר Au NPs טהורים. כמו כן, Au@CDs בעלי ביצועים מצוינים ביכולת שחזור ויציבות לטווח ארוך. מחקר נוסף כולל לקיחת Au@CDs כמצעים לביצוע הדמיית SERS של תאי A54931 ולאיתור שני זני חיידקים32. הוכח כי Au@CDs יכול לשמש כבדיקת SERS רגישה במיוחד המבוססת בעיקר על השיפור הכימי בין Au NPs ו- CDs.
ישנן מספר נקודות מפתח במהלך מדידות SERS בפרוטוקול הקודם. ראשית, לפני יישום Au@CDs בתאים ובדגימות חיידקים, יש צורך להבטיח נוסחת מצע SERS מעולה, כמו גם את הריכוז הנכון, אשר ניתן לאמת על ידי מולקולות צבע. כתוצאה מכך, ספקטרום SERS אינו עקבי בכל נקודה תאית מכיוון שהדגימות הביולוגיות מורכבות ודינמיות.
אם לוקחים נקודת לייזר גדולה יותר, ספקטרום SERS מנקודות שונות יהיה דומה יותר. יש לציין כי ספקטרום ה-SERS של אותה נקודה סלולרית עשוי שלא להיות בהתאם לעוצמת לייזר שונה. מקובל כי ספקטרום SERS הממוצע של דגימות ביולוגיות הוא עקבי; לכן, קריטי לקבל את ספקטרום ה-SERS באותם אזורים תאיים ככל האפשר, ולאחר מכן להגיע לממוצע של כמה אזורים תאיים שונים. בנוסף, רגישות זיהוי SERS תוך תאית מושפעת בקלות מאותות רקע. אותות הרקע של ראמאן מגיעים בעיקר משלושה היבטים, כולל (1) מצע, כגון ספיר, פרוסת סיליקון וכן הלאה, (2) בדיקת SERS, ו-(3) דגימות ביולוגיות. לכן, מומלץ לבחור מצעים ללא רעשי רקע במידת האפשר, אם כי הדבר קשה.
בהשוואה לספקטרוסקופיית ראמאן קונבנציונלית, SERS יכול לשפר באופן משמעותי את עוצמת האות בכמה סדרי גודל33. בעבודה זו, זהב נבחר לייצור NPs מרוכבים מכיוון שהייתה לו יכולת טובה יותר לייעל את הגודל והצורה, בהיותו פחות ציטוטוקסי כמו גם יותר אינרטי וחזק מבחינה כימית מאשר כסף34. בינתיים, פגזי CD המחוברים למשטחי Au יכולים להפחית את האינטראקציות בין תאים ומתכת NPs33. לסיכום, התוצאות לעיל הדגימו SERS ללא תוויות כטכניקה לא פולשנית ולא הרסנית, אשר יכולה לספק הרכב כימי מהותי של אנליטים ברמה של תא יחיד35.
מחקרים קודמים הראו כי חיוני לשלוט בסביבת הזיהוי המתאימה ובזמן במקרה של עיוות מידע טביעת אצבע מקורי5. לכן, חיוני לוודא שאין נזק על התאים, במטרה לקבל ספקטרום אמין. אתגרים אחרים כוללים: (1) עבור מדידות SERS תוך-תאיות, Au NPs הפעילים ב-SERS עשויים לקיים אינטראקציה עם רכיבים תוך-תאיים כגון חלבונים, שומנים או חומצות גרעין4. לכן, יש לשקול תאימות ביולוגית והקצאות אותות SERS; (2) חשיפה קבועה ללייזר במהלך זיהוי SERS עלולה לפגוע בציטוטוקסיות התא או בדגימות ביולוגיות; ו-(3) כפי שמוצג באיור 5A,B, לפלטפורמת SERS הניידת עדיין יש מגבלות מסוימות – עוצמת הרמאן או האותות שניתן לזהות אינם טובים כמו מה שמוצג באיור 4.
בנוסף, בשילוב עם טכנולוגיות אחרות כגון מיקרופלואידיקה טיפתית 36, למידה עמוקה 37, למידת מכונה38, טכנולוגיית הגברה קטליטית להרכבת סיכות שיער39 וטכנולוגיית פלואורסצנטיות40, אסטרטגיות משולבות אלה יכולות לפתח את העליונות של SERS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071399 ו-62175071), תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגזו (2019050001), קרן המחקר הבסיסית והיישומית של גואנגדונג (2021A1515011988), והקרן הפתוחה של מעבדת המפתח למדע אופטואלקטרוניקה וטכנולוגיה לרפואה (אוניברסיטת פוג'יאן נורמל), משרד החינוך, סין (JYG2009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al.
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U.
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q.
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
