Summary
В этом исследовании мы разработали недорогой поверхностно-усиленный нанозонд на основе комбинационного рассеяния света (SERS) с благоприятной биосовместимостью, чтобы показать биовизуализацию живых клеток без меток и обнаружить два бактериальных штамма, подробно показывая, как получить спектры SERS живых клеток неразрушающим методом.
Abstract
Технология комбинационного рассеяния с поверхностным усилением (SERS) привлекает все больше внимания в области биомедицины из-за ее способности предоставлять информацию о молекулярных отпечатках биологических образцов, а также из-за ее потенциала в анализе отдельных клеток. Целью данной работы является разработка простой стратегии безметочного биоанализа SERS на основе Au@carbon-точечных нанозондов (Au@CDs). Здесь CD, полученные из полифенолов, используются в качестве восстановителя для быстрого синтеза наноструктур Au@CD оболочки ядра, что обеспечивает высокую производительность SERS даже при низкой концентрации метиленового синего (MB) 10-9 М благодаря кооперативному механизму усиления комбинационного рассеяния. Для биоанализа Au@CDs может служить уникальным наносенсором SERS для идентификации клеточных компонентов биообразцов (например, раковых клеток и бактерий). Молекулярные отпечатки различных видов могут быть дополнительно различимы после объединения с анализом главных компонентов. Кроме того, Au@CDs также позволяет получать изображения SERS без меток для анализа профилей внутриклеточного состава. Эта стратегия предлагает осуществимый биоанализ SERS без меток, открывая новые перспективы для нанодиагностики.
Introduction
Анализ отдельных клеток необходим для изучения выявления клеточной гетерогенности и оценки комплексного состояния клетки. Мгновенная реакция клетки на микроокружение также требует анализа одной клетки1. Тем не менее, существуют некоторые ограничения для существующих методов. Флуоресцентное детектирование может быть применено к анализу отдельных клеток, но оно ограничено низкой чувствительностью. Другие проблемы возникают из-за сложного флуоресцентного фона клеток и флуоресцентного фотообесцвечивания при длительном облучении2. Поверхностно-усиленное комбинационное рассеяние света (SERS) может быть квалифицировано с точки зрения анализа отдельных клеток благодаря своим преимуществам, в том числе (1) отражению внутренней молекулярной информации отпечатков пальцев и мгновенной ситуации, (2) сверхвысокой поверхностной чувствительности, (3) удобному мультиплексному обнаружению, (4) высокой фотостабильности, (5) обнаружению можно количественно оценить для сравнительного анализа, (6) предотвращению клеточной автофлуоресценции с возбуждением длины волны NIR, (7) обнаружение может быть выполнено в клеточной водной среде окружающей среды, и (8) обнаружение может быть направлено на конкретную область в ячейке 3,4,5.
Существует два общепризнанных механизма, позволяющих понять SERS как фундаментальное явление: электромагнитное усиление (ЭМ) как доминирующую причину и химическое усиление (ХМ). ЭМ относится к колебаниям коллективных электронов, вызванным электромагнитными волнами, когда частота падающего света совпадает с частотой свободных электронов, колеблющихся в металле, что приводит к возникновению поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Когда локализованное SPR (LSPR) происходит за счет падающего лазерного удара по металлическим наночастицам (НЧ), это приводит к резонансному поглощению или рассеянию падающего света. Следовательно, напряженность поверхностного электромагнитного поля металлических НЧ может быть увеличена на два-пять порядков4. Тем не менее, ключом к огромному улучшению SERS является не один металлический NP, а зазор между двумя NP, который создает горячие точки. КМ генерируется с двух сторон, включая (1) взаимодействия между молекулами-мишенями и металлическими НЧ и (2) способность молекул-мишеней переносить электроны в/из металлических НЧ 4,5. Более подробную информацию можно найти в этих обзорных статьях 4,5. В предыдущей литературе было представлено несколько перспективных методов биозондирования и визуализации SERS в живых клетках, например, обнаружение апоптотических клеток6, белков в органеллах7, внутриклеточных микроРНК8, клеточных липидных мембран9,цитокинов10 и метаболитов11 в живых клетках, а также идентификация и мониторинг клеток с помощью конфокальной SERS визуализации2, 11,12,13. Интересно, что безметочный SERS представляет собой уникальное преимущество SERS, который может описывать внутренние молекулярные спектры5.
Основной проблемой для безметочных SERS является рациональная и надежная подложка. Типичными подложками SERS являются НЧ из благородных металлов из-за их превосходной способности рассеивать много света14. В настоящее время все больше внимания уделяется нанокомпозитам из-за их замечательных физико-химических свойств и биосовместимости. Что еще более важно, нанокомпозиты могут демонстрировать лучшую активность SERS из-за интенсивного электромагнитного излучения, индуцированного горячими точками на наногибридах, и дополнительного химического усиления, происходящего от других неметаллических материалов15. Например, Fei et al. использовали квантовые точки MoS 2(QD) в качестве редукторов для синтеза нанокомпозитов AuNP@MoS 2 QD для безметочной визуализации SERS в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR) клеток рака молочной железы мышей 4T1 (клеток 4T1)16. Кроме того, Li et al. изготовили подложку 2D SERS, состоящую из нанолистов Au NP и 2D нанолистов дителлурида гафния для безметочных измерений SERS патогенных бактерий пищевого происхождения17. В последнее время углеродные точки (CD), хорошие доноры электронов, используются в качестве восстановителей без других восстановителей или облучения для синтеза Au@carbon точечных нанозондов (Au@CDs)18, которые, как сообщается, являются эффективными материалами для повышения активности SERS на основе эффекта переноса заряда (CT) между ядрами Au и оболочками CD19,20. Более того, CD признаны в качестве укупорочного агента и стабилизатора, предотвращающего агрегацию Au NP21. Кроме того, он открывает больше возможностей для реакций с аналитами, так как может обеспечить большое количество связывающих и активных сайтов20. Воспользовавшись вышеизложенным, Jin et al. разработали быстрый и контролируемый метод изготовления Ag@CD НЧ с уникальными свойствами SERS и превосходной каталитической активностью для мониторинга гетерогенных каталитических реакций в режиме реального времени18.
В данной работе был продемонстрирован простой и малозатратный метод изготовления субстратов Au@CD SERS для идентификации клеточных компонентов и биовизуализации живых клеток SERS без меток, а также для обнаружения и дифференциации Escherichia coli (E. coli) и Staphylococcus aureus (S. aureus), который является перспективным для ранней диагностики заболеваний и лучшего понимания клеточных процессов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление Au@CDs
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показана процедура изготовления Au@CDs.
- Приготовьте раствор КД с использованием лимонной кислоты (КА) и галловой кислоты (ГА) с помощью типичной процедуры гидротермальной обработки18. Добавляют 100 мкл 3,0 мг мл-1 приготовленного раствора КД в 200 мкл 10 мМ хлорауриновой кислоты (HAuCl4) (см. таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 10 с до получения фиолетовой суспензии.
- Центрифугируют фиолетовую суспензию при концентрации 4 000 × г в течение 10 мин при комнатной температуре и осторожно удаляют надосадочную жидкость с помощью пипетки, если удаление Au@CD коллоидов затруднено.
- Ресуспендируйте Au@CDs с 200 мкл деионизированной воды (удельное сопротивление 18,2 МОм·см), чтобы смыть излишки компакт-дисков.
- Повторите шаг 1.2 и получите НЧ ядра-оболочки, повторно диспергированные в 100 мкл деионизированной воды и хранят при температуре 4 °C. НЧ можно хранить в течение 1 месяца.
2. Характеристика Au@CDs
- Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
- Оставьте CD и Au@CD образцы на ночь при -80 °C для лиофилизации из замороженного раствора и измельчения после лиофилизации в порошок.
- Диспергируйте полученные образцы порошка в деионизированную воду с помощью ультразвука при 100% мощности в течение 5 мин.
- Капните несколько капель суспензии образца на сетку ПЭМ с медным покрытием, покрытую кружевной углеродной пленкой, и после сушки получите изображения с помощью просвечивающего электронного микроскопа при напряжении ускорения 200 кВ (см. таблицу материалов).
- Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (ИК-Фурье)
- Повторите шаг 2.1.1 для получения энергетических образцов, измельчите несколько предварительно высушенных частиц KBr в порошок в ступке, добавьте щепотку образца и одновременно смешайте с порошками KBr для определения ИК-характеристик16.
- Спектроскопия поглощения в ультрафиолетовом и видимом ближнем инфракрасном диапазонах (UV-vis-NIR)
- Приготовьте суспензию компакт-дисков и Au@CDs с надлежащей концентрацией, чтобы убедиться, что абсорбция меньше единицы, и выполните характеристику УФ-видимого ближнего ИК-диапазона16.
- Спектры комбинационного рассеяния света
- Включите полупроводниковый лазер с длиной волны 785 нм с лазерной мощностью 10 мВт и 20-кратным увеличением возражения. Установите длительность экспозиции на 5 с, а количество накоплений на три.
- В 5 мкл раствора метиленового синего (МБ) добавить равный объем подготовленных Au@CDs образцов и тщательно перемешать.
- Поместите каплю суспензии на латунную подложку для сбора спектров SERS.
3. Клеточная культура
- Культивирование клеток эпителиальной карциномы легкого человека (клетки А549, пассированные в лаборатории) в модифицированной среде Eagle (DMEM) компании Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином, и инкубируют в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
- Высевают клетки в 96-луночные планшеты (1 × 10,5 клеток/лунку) и обрабатывают Au@CDs в различных концентрациях в диапазоне 20-100 мкМ. Используйте набор для анализа CCK-8 для измерения жизнеспособности клеток (см. таблицу материалов). В каждой процедуре используются три независимых дубликата.
- Для проведения экспериментов SERS выполните следующие действия:
- Поместите стерильный сапфировый чип (см. Таблицу материалов) в 12-луночные планшеты, а затем засейте клетки в одну лунку с 1 мл среды. Инкубируйте планшеты в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2в течение ночи до достижения слияния 70%-80%.
- Добавьте Au@CDs в одну лунку и выдержите 4-6 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инкубацией проверьте стабильность субстратов, особенно NP фазы раствора. Эти материалы подвержены деградации в результате процессов растворения, агрегации и осаждения во время хранения и использования, что может уменьшить потери ЭМ и снизить активность SERS. Что еще более важно, на клеточное поглощение может в значительной степени влиять размер НУП22. - Во время инкубации субстраты будут проникать в клетки через эндоцитарное поглощение. После инкубации наблюдайте за клетками под оптическим микроскопом до тех пор, пока внутри клеток не будет видно несколько черных частиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если интенсивность SERS слабая, попробуйте повысить концентрацию Au@CD или продлить время инкубации. - Удалите среду, осторожно промойте сапфировые чипы фосфатно-солевым буфером (PBS) и окуните их в PBS для обнаружения SERS16.
4. Эксперименты Cell SERS
- Откройте компьютер, включите рамановский спектрометр, запустите программное обеспечение, а затем включите лазер с длиной волны 785 нм (см. таблицу материалов).
- Нажмите на New Measurement (Новое измерение ) и начните новое спектральное измерение. Откалибруйте17 с кремниевыми пластинами перед измерением образца.
- Возьмите объектив с 20-кратным увеличением, чтобы обеспечить четкое изображение с ячейками, затем измените объектив на 50-кратный. Установите мощность лазера от низкой до высокой, а также соответствующее время экспозиции и накопления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед измерением SERS проверьте соответствующую мощность лазера, чтобы предотвратить необратимое повреждение ячейки и убедиться, что параметры сбора данных согласованы. Интенсивность SERS связана с мощностью лазера, размером пятна, накоплением и временем экспозиции. - Выберите точку ячеек для измерения и нажмите « Выполнить». Каждая клетка измеряется по 20 точкам, а 10 клеток измеряются для получения среднего значения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Внутриклеточные компоненты сложны, что приводит к большому диспаритету спектров. Поэтому берите спектры в похожих клеточных областях и берите как можно больше спектров. - Сохраните спектры.
- Нажмите « Новое упорядочение получения изображений», затем нажмите « Видеообзор», выберите диапазон для фотографирования и нажмите «ОК». Установите параметры: линия тока края 785 нм, центр 1 200 см-1, продолжительность экспозиции 5 с, количество накоплений 3 и мощность лазера 50%.
- Щёлкните по New of Living imaging, выберите Signal to Baseline, установите диапазон от первого предела 625 до второго предела 1,700, а затем нажмите Area setup. Затем задайте правильные шаги и нажмите « Применить» и «ОК». Наконец, нажмите кнопку «Выполнить », чтобы начать визуализацию SERS.
5. Бактериологическое исследование и измерение SERS
- Ночные культуры E. coli и S. aureus (1:100) разводят в 5 мл новой среды Лурия-Бертани (LB) (см. таблицу материалов). После роста при температуре от 37 °C до600 0,4 до 0,6 центрифугируют культуру при 5 000 × г в течение 5 мин для гранулирования клеток.
- Повторно суспендируйте гранулы в 1 мл PBS с последующим центрифугированием в течение 5 минут по 5 000 × г (при комнатной температуре) дважды.
- Смешайте бактериальную культуру с Au@CDs и наблюдайте за смесью непосредственно под платформой SERS.
6. Анализ данных
- Сглаживание спектров и коррекция базовой линии.
- Выполните анализ главных компонент (PCA)16 с обработанными данными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изготовление Au@CDs проиллюстрировано на рисунке 1. Компакт-диски получали из КА и ГА с помощью типичного гидротермального процесса18. Au@CDs были быстро синтезированы путем восстановления HAuCl4 с помощью CD в водных средах при комнатной температуре. Размер и морфологию CD и Au@CDs можно наблюдать с помощью ПЭМ и ТЭМ высокого разрешения (HR)TEM23. Полученные компакт-диски являются монодисперсными с малыми размерами около 2-6 нм (рис. 2А). Сферическое ядро Au покрыто слоем оболочки CD размером около 2,1 нм (рис. 2B, C и дополнительный рисунок 1).
Для подтверждения структур КД и Au@CDs были зарегистрированы ИК-Фурье спектры для анализа органических функциональных групп (рис. 2D). Полоса 3,000-3,600/2,500-2,800 см-1, 1,251/1,629 см-1 и 1,471 см-1 может быть отнесена к вибрации растяжения O-H, вибрации растяжения C=O и вибрации растяжения C-O, соответственно 24,25. Кроме того, растягивающая колебательная полоса на 1,741 см-1 связана с C-C 24. Некоторые из этих функциональных групп из ГА и СА также присутствуют в КД и Au@CDs, что свидетельствует об успешном синтезе НЧ. Спектры поглощения УФ-видимого излучения КД имеют характерный пик на длине волны 265 нм, что указывает на изолированную ароматическую структуру в углеродных сердечниках26, которая исчезает при восстановлении. Спектр Au@CDs демонстрирует характерный пик на длине волны 545 нм, который связан с полосой поглощения SPR ядра Au, что указывает на фабрикацию композитной наноструктуры (рис. 2E).
Как показано на рисунке 3A, B, даже когда концентрация MB составляет всего 10-9 M, Au@CDs демонстрируют отличные характеристики SERS по сравнению с Au NP. Коэффициент усиления (EF) может быть рассчитан по следующему уравнению16, где I SERS и I 0 относятся к интенсивностям комбинационного рассеяния спектра SERS и нормального рамановского рассеяния соответственно, а C SERS и C0 относятся к концентрациям молекул субстрата, используемых для измерений SERSи комбинационного рассеяния света, соответственно. Если взять для вычисления 1620 см-1 МБ, то ЭФ Au@CDs составляет почти 2,1 × 105, что примерно в три раза больше, чем у Au NP (6,8 × 104).
Можно обнаружить несколько характерных пиков, таких как 770 см-1 (изгиб в плоскости C-H), 1398 см-1 (симметричное растяжение C-N) и 1625 см-1 (растяжение кольца C-C), что согласуется с опубликованной литературой27. В то же время обнаруживается от 10-5 М до 10-9 М МБ, принимая для количественной оценки полосу SERS на уровне 1 620 см-1; линейная зависимость определяется как y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922) (рис. 3B). В дополнение к чувствительности, воспроизводимость и долговременная стабильность являются важными показателями для подложек SERS. Таким образом, спектры SERS были получены по 20 точкам случайным образом, демонстрируя высокое сходство между ними (рис. 3C,D); В течение 1 месяца были собраны четыре спектра, характерные пики MB все еще регистрировались через 1 месяц после размещения при 4 °C, а средняя активность SERS на 950 см-1, 1185 см-1 и 1620 см-1 показала только степень распада около 5,43%, 11,44% и 13,94% соответственно (рис. 3E), что указывает на хорошую воспроизводимость и долговременную стабильность Au@CD подложек.
В современных измерениях SERS клеток, во-первых, проверялась цитотоксичность НЧ. Au@CDs (20-100 мкМ) практически не проявляли цитотоксичности к клеткам А549 (рис. 3F). Приведенные выше результаты свидетельствуют о высоком потенциале Au@CDs применения для безметочных измерений SERS в живых клетках. Как показано на рисунке 4, Au@CD собранная подложка SERS обеспечивает интегрированное SERS-картирование клеточных компонентов в диапазоне от 800 до 1700 см-1. Замечено, что Au@CD NP-агрегаты демонстрируют явные сигналы SERS без шумового фона при SERS-картировании ячеек A549 (рис. 4B). На рисунке 4С показаны три спектра из разных клеточных точек, демонстрирующие гетерогенность компонентов в различных цитоплазматических областях и превосходство Au@CDs в качестве SERS-зондов для анализа отдельных клеток. Средний спектр клеток А549 показан на рисунке 4А, и можно наблюдать обильную клеточную информацию. Подробные присвоения характеристических пиков приведены в таблице 1.
Кроме того, Au@CDs также демонстрируют хорошую способность обнаруживать и дифференцировать два бактериальных штамма. Полученные спектры очень похожи на опубликованную литературу для E. coli и S. aureus, такие как фенилаланин в 1030 см-1 и кольцевое дыхание нуклеиновой кислоты в 741 см-1 (рис. 5A, B), что подтверждает надежность измерений SERS28. Подробные характеристические присвоения пиков28,29,30,31 приведены в таблице 2. Модель PCA также хорошо различает (рис. 5C, D).
Рисунок 1: Схематическое изображение пути синтеза Au@CDs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативная характеристика компакт-дисков и Au@CDs. (A) Изображение компакт-дисков HRTEM. Масштабная линейка: 10 нм. (Б) ПЭМ-изображение Au@CDs. Масштабная линейка: 100 нм. (C) Изображение HRTEM интерфейсной области Au@CDs. Масштабная линейка: 10 нм; Врезка: 2 нм. (D) ИК-Фурье спектры необработанных компакт-дисков и Au@CDs в состоянии ИК-Фурье. (E) УФ-видимые спектры поглощения CD, Au NP и Au@CDs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Деятельность SERS Au@CDs. (A) Спектры SERS объемного раствора MB (10-5 M, черная линия) и 10-9 M MB (синяя линия и зеленая линия). (B) SERS спектры MB при различных концентрациях (10-9-10-5 М). Вставка: Линейная зависимость полосы SERS на расстоянии 1,620 см-1 MB, y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922). Результаты экспериментов по воспроизводимости подложки SERS (C), гистограмме относительного стандартного отклонения (RSD) (пик MB 1 620 см-1 на 10-7 м) (D) и долговременной стабильности (E). (F) Жизнеспособность клеток A549 после 24 ч инкубации с градиентом концентрации Au@CD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ отпечатков пальцев и безметочная SERS визуализация клеток A549. (A) Средний спектр SERS ячеек A549. (B) Яркое поле, картографирование SERS и объединенные изображения ячеек A549. Масштабные линейки: 20 мкм. (C) Спектры SERS различных точек ячейки, отмеченных на объединенном изображении 1, 2 и 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Дактилоскопический анализ двух штаммов бактерий. Средние спектры SERS E. coli (A) и S. aureus (B). 2D PCA (C) и 3D PCA (D) по дифференциальному анализу двух бактериальных штаммов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Присвоения для комбинационных пиков ячеек A549. Сокращения: Pro = пролин; HYP = гидроксипролин; Тир = тирозин; Trp = трипотофан; фенилаланин = фенилаланин; А = аденин; Т = тимин; С = цитозин; G = гуанин; bend = изгиб; str = растяжение; def = деформация; скручивание = скручивание; дыхание = дыхание; wag = виляние; sym = симметричный; asym = асимметричный; bk = позвоночник. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Распределение пиков комбинационного рассеяния E. coli и S. aureus. Сокращения: Tyr = тирозин; фенилаланин = фенилаланин; А = аденин; G = гуанин; str = растяжение; def = деформация; дыхание = дыхание; sym = симметричный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Дополнительный рисунок 1: Динамическое исследование рассеяния света Au@CDs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Таким образом, Au@CDs с ультратонкой оболочкой CD 2,1 нм были успешно изготовлены. Нанокомпозиты демонстрируют более высокую чувствительность к SERS, чем чистые НЧ Au. Кроме того, Au@CDs обладают отличными характеристиками воспроизводимости и долговременной стабильности. Дальнейшие исследования включают использование Au@CDs в качестве субстратов для выполнения SERS-визуализации клеток A54931 и обнаружения двух бактериальных штаммов32. Доказано, что Au@CDs может быть использован в качестве сверхчувствительного зонда SERS в основном на основе химического усиления между Au NP и CD.
В предыдущем протоколе есть несколько ключевых моментов при измерениях SERS. Во-первых, перед нанесением Au@CDs в клетки и образцы бактерий необходимо убедиться в превосходной формуле субстрата SERS, а также в правильной концентрации, которая может быть проверена молекулами красителя. Следовательно, спектр SERS непостоянен в каждой клеточной точке, потому что биологические образцы сложны и динамичны.
Если взять большее лазерное пятно, спектр SERS из разных точек будет более похожим. Следует отметить, что спектр SERS одной и той же сотовой точки может не совпадать с разной мощностью лазера. Общепризнано, что средний спектр биологических образцов SERS постоянен; поэтому крайне важно получить спектр SERS в одном и том же клеточном регионе, насколько это возможно, а затем усреднить несколько различных клеточных областей. Кроме того, на чувствительность обнаружения внутриклеточной SERS легко влияют фоновые сигналы. Рамановские фоновые сигналы в основном исходят от трех аспектов, включая (1) подложку, такую как сапфир, кремниевая пластина и т. д., (2) зонд SERS и (3) биологические образцы. Следовательно, рекомендуется по возможности выбирать подложки без фонового шума, хотя это и сложно.
По сравнению с обычной рамановской спектроскопией, SERS может существенно повысить интенсивность сигнала на несколько порядков33. В этой работе золото было выбрано для изготовления композитных НЧ, потому что оно обладало лучшей способностью оптимизировать размер и форму, будучи менее цитотоксическим, а также более химически инертным и прочным, чем серебро34. Между тем, оболочки CD, прикрепленные к поверхностям Au, могут уменьшать взаимодействие между клетками и металлическими НЧ33. В заключение, приведенные выше результаты продемонстрировали, что безметочный SERS является неинвазивным и неразрушающим методом, который может обеспечить собственный химический состав аналитов на уровне35 одной клетки.
Предыдущие исследования показали, что в случае искажения исходной информации об отпечатках пальцев важно контролировать соответствующую среду обнаруженияи время 5. Поэтому важно убедиться в отсутствии повреждений на клетках, чтобы получить достоверные спектры. Другие проблемы включают: (1) при внутриклеточных измерениях SERS SERS-активные Au NP могут взаимодействовать с внутриклеточными компонентами, такими как белки, липиды или нуклеиновыекислоты. В связи с этим необходимо учитывать биосовместимость и присвоение сигналов SERS; (2) постоянное лазерное воздействие во время обнаружения SERS может повредить цитотоксичность клеток или биообразцов; и (3) как показано на рисунке 5A, B, портативная платформа SERS по-прежнему имеет некоторые ограничения - либо интенсивность комбинационного рассеяния, либо сигналы, которые могут быть обнаружены, не так хороши, как показано на рисунке 4.
Кроме того, в сочетании с другими технологиями, такими как капельная микрофлюидика36, глубокое обучение 37, машинное обучение 38, технология амплификации каталитических шпилек39 и флуоресцентная технология40, эти интегрированные стратегии могут развить превосходство SERS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32071399 и 62175071), Научно-технической программой Гуанчжоу (2019050001), Гуандунским фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (2021A1515011988) и Открытым фондом Ключевой лаборатории оптоэлектронной науки и техники для медицины (Фуцзяньский педагогический университет) Министерства образования Китая (JYG2009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al.
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U.
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q.
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
