Summary
본 연구에서는 생체적합성이 우수한 저비용 표면 강화 라만 산란(SERS) 기반 지문 나노프로브를 개발하여 비파괴 방법으로 살아있는 세포의 SERS 스펙트럼을 얻는 방법을 자세히 보여주기 위해 라벨이 없는 생세포 바이오이미징을 보여주고 두 가지 박테리아 균주를 검출했습니다.
Abstract
표면 강화 라만 산란(SERS) 기술은 생물학적 샘플의 분자 지문 정보를 제공할 수 있는 능력과 단일 세포 분석의 잠재력으로 인해 생물 의학 분야에서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 이 연구는 Au@carbon 도트 나노프로브(Au@CDs)를 기반으로 하는 무표지 SERS 바이오분석을 위한 간단한 전략을 수립하는 것을 목표로 합니다. 여기서, 폴리페놀 유래 CD는 코어쉘 Au@CD 나노구조를 빠르게 합성하기 위한 환원제로 활용되며, 이는 협력적인 라만 강화 메커니즘으로 인해 메틸렌 블루(MB)의 농도가 10-9M 로 낮을 때에도 강력한 SERS 성능을 가능하게 합니다. 생물 분석의 경우 Au@CDs 고유한 SERS 나노센서 역할을 하여 생물 시료의 세포 구성 요소(예: 암세포 및 박테리아)를 식별할 수 있습니다. 다른 종의 분자 지문은 주성분 분석과 조합한 후에 더 구별될 수 있습니다. 또한 Au@CDs 무표지 SERS 이미징을 통해 세포 내 조성 프로파일을 분석할 수 있습니다. 이 전략은 실현 가능하고 라벨이 없는 SERS 생물 분석을 제공하여 나노 진단에 대한 새로운 전망을 열어줍니다.
Introduction
단일 세포 분석은 세포 이질성을 밝히고 세포의 포괄적인 상태를 평가하는 연구에 필수적입니다. 미세 환경에 대한 세포의 즉각적인 반응은 또한 단일 세포 분석을 보증합니다1. 그러나 현재 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 형광 검출은 단일 세포 분석에 적용할 수 있지만 낮은 감도로 인해 제한적입니다. 다른 문제는 세포의 복잡한 형광 배경과 장기간 조사하에서 형광 광표백으로 인해 발생합니다2. 표면 강화 라만 산란(SERS)은 (1) 고유 분자 지문 정보 및 순간 상황 반영, (2) 초고표면 감도, (3) 편리한 다중 검출, (4) 높은 광안정성, (5) 비교 분석을 위한 검출 정량화, (6) NIR 파장 여기를 통한 세포 자가형광 방지, (7) 세포 수용액에서 검출 수행 가능 등의 장점으로 인해 단일 세포 분석 측면에서 적합할 수 있습니다 환경 및 (8) 검출은 셀 내의 특정 영역(3,4,5)으로 지시될 수 있다.
SERS를 근본적인 현상으로 이해하는 데는 널리 알려진 두 가지 메커니즘이 있습니다 : 지배적 인 이유로서의 전자기 강화 (EM)와 화학적 향상 (CM). EM은 여기장의 주어진 주파수에서 입사광의 주파수가 금속에서 진동하는 자유 전자의 주파수와 일치할 때 전자기파에 의해 구동되는 집단 전자의 진동을 말하며, 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 발생시킵니다. 국소 SPR(LSPR)이 금속 나노입자(NP)에 충돌하는 입사 레이저를 통해 발생하면 입사광의 공진 흡수 또는 산란을 유발합니다. 결과적으로, 금속 NP의 표면 전자기장 강도는 2-5 차수로 향상 될 수있다4. 그러나 SERS의 엄청난 향상의 핵심은 단일 금속 NP가 아니라 두 NP 사이의 간격이 핫 스폿을 만드는 것입니다. CM은 (1) 표적 분자와 금속 NP 사이의 상호 작용 및 (2) 표적 분자가 금속 NP로 /로부터 전자를 전달할 수 있는 것을 포함하여 양면에서 생성됩니다(4,5). 보다 자세한 내용은 이 리뷰 기사 4,5에서 찾을 수 있습니다. 살아있는 세포에서 SERS 생체 감지 및 이미징을 위한 몇 가지 유망한 방법이 이전 문헌에서 제시되었는데, 예를 들어, 아폽토시스 세포(apoptotic cells)6, 세포 소기관(organelles)7의 단백질(protein in organelles)7, 세포내 miRNAs8, 세포 지질막(cellular lipid membranes)9사이토카인(cytokines)10 및 대사산물(metaboleight)11의 검출, 공초점 SERS 이미징(confocal SERS imaging)2에 의한 세포의 식별 및 모니터링, 11,12,13. 흥미롭게도, 무표지 SERS는 내부 분자 스펙트럼을 설명할 수 있는 SERS의 독특한 장점을 제시한다5.
무표지 SERS의 주요 쟁점은 합리적이고 신뢰할 수 있는 기판입니다. 전형적인 SERS 기판은 많은 빛을 산란시키는 우수한 능력 때문에 귀금속 NP이다14. 오늘날 나노 복합체는 놀라운 물리적, 화학적 특성과 생체 적합성으로 인해 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 더 중요한 것은, 나노복합체는 나노하이브리드의 핫스팟에 의해 유도된 강렬한 EM과 다른 비금속 물질로부터 유래하는 추가적인 화학적 향상으로 인해 더 나은 SERS 활성을 나타낼 수 있다는것이다 15. 예를 들어, Fei et al. 마우스 4T1 유방암 세포(4T1 세포)의 무표지 근적외선(NIR) SERS 이미징을 위한 Au NP@MoS 2 QD 나노복합체를 합성하기 위해 MoS2양자점(QD)을 환원제로 사용했습니다16. 또한, Li 등은 식인성 병원성 박테리아의 무표지 SERS 측정을 위해 Au NPs 및 2D 하프늄 디텔루라이드 나노시트로 구성된 2D SERS 기판을 제작했다17. 최근, 좋은 전자 공여체인 탄소 도트(CD)는 다른 환원제나 조사 없이 환원제로 사용되어 Au@carbon 도트 나노프로브(Au@CDs)18를 합성하고 있으며, 이는 Au 코어와 CD 쉘 사이의 전하 이동(CT) 효과에 기초하여 SERS 활성을 향상시키는 효율적인 물질로 보고되고 있다(19,20). 그 이상으로, CD는 Au NP가 응집되는 것을 방지하기 위한 캡핑제 및 안정제로 인식된다21. 또한, 분석물과의 반응에 대한 더 많은 가능성을 열어주는데, 이는 많은 수의 결합 및 활성 부위(20)를 제공할 수 있기 때문이다. 위의 내용을 활용하여 Jin et al. 실시간으로 불균일한 촉매 반응을 모니터링하기 위해 고유한 SERS 특성과 우수한 촉매 활성을 가진 Ag@CD NP를 제조하기 위한 빠르고 제어 가능한 방법을 개발했습니다(18).
여기에서 세포 구성 요소 및 라벨이 없는 SERS 생세포 바이오이미징을 식별하고 대장 균(E. coli) 및 황색포도상구균 (S. aureus)을 검출 및 분화하기 위해 코어쉘 Au@CD SERS 기질을 제조하는 용이하고 저렴한 방법이 입증되었으며, 이는 질병의 조기 진단과 세포 과정에 대한 더 나은 이해를 약속합니다.
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Protocol
1. Au@CDs의 제작
참고: 그림 1 은 Au@CDs에 대한 제조 절차를 보여줍니다.
- 전형적인 열수 처리 절차18을 통해 시트르산(CA)과 갈산(GA)을 사용하여 CD 용액을 준비합니다. 준비된 CD 용액 100μL의 3.0mg mL-1을 10mM 염화금산(HAuCl4) 200μL에 실온에서 보라색 현탁액이 생성될 때까지 10초 동안 추가합니다.
- 자색 현탁액을 4,000 × g 에서 상온에서 10분 동안 원심분리하고 Au@CD 콜로이드의 제거가 어려운 경우 피펫을 이용하여 상층액을 부드럽게 제거한다.
- 200μL의 탈이온수(저항률 18.2MΩcm)로 Au@CDs 재현탁하여 초과 CD를 세척합니다.
- 단계 1.2를 반복하고, 코어-쉘 NP를 얻고, 100 μL의 탈이온수에 재분산시키고, 4°C에서 저장한다. NP는 1개월 동안 저장할 수 있습니다.
2. Au@CDs의 특성화
- 투과 전자 현미경 (TEM)
- CD와 Au@CD 샘플을 -80°C에서 밤새 방치하여 동결된 용액에서 동결건조하고 동결건조 후 분말로 분쇄합니다.
- 얻어진 분말 샘플을 5 분 동안 100 % 전력으로 초음파 처리하여 탈 이온수에 적절하게 분산시킵니다.
- 레이스 카본 필름으로 덮인 Cu 코팅 TEM 그리드에 샘플 현탁액 몇 방울을 떨어뜨리고 200kV 가속 전압에서 투과 전자 현미경을 사용하여 건조 후 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조).
- 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)
- 2.1.1 단계를 반복하여 전력 샘플을 얻고, 사전 건조 된 KBr 입자 몇 개를 모르타르에서 분말로 분쇄하고, 샘플의 핀치를 추가하고, IR 특성화16을 위해 KBr 분말과 동시에 혼합합니다.
- 자외선-가시광선-근적외선(UV-vis-NIR) 흡광도 분광법
- CD의 현탁액을 준비하고 적절한 농도로 Au@CDs하여 흡광도가 1 미만인지 확인하고 UV-vis-NIR 특성 분석16을 수행합니다.
- 라만 스펙트럼
- 10mW의 레이저 출력과 20x의 대박 배율로 785nm 반도체 레이저를 켭니다. 노출 지속 시간을 5초로 설정하고 누적 횟수를 3으로 설정합니다.
- 같은 부피의 준비된 Au@CDs 샘플을 5μL의 메틸렌 블루(MB) 용액에 넣고 완전히 혼합합니다.
- 황동 기판에 현탁액 한 방울을 올려 SERS 스펙트럼을 수집합니다.
3. 세포 배양
- 인간 상피 폐 암종 세포(A549 세포, 실험실에서 계대 배양)를 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 독수리 배지(DMEM)에서 배양하고, 5%CO2로 37°C의 가습 인큐베이터에서 배양한다.
- 세포를 96웰 플레이트(1 × 105 세포/웰)에 시딩하고 20-100 μM 범위의 다양한 농도의 Au@CDs로 처리합니다. CCK-8 분석 키트를 사용하여 세포 생존율을 측정합니다( 재료 표 참조). 각 치료에는 3개의 독립적인 중복이 사용됩니다.
- SERS 실험을 수행하려면 다음 단계를 진행하십시오.
- 멸균 사파이어 칩( 재료 표 참조)을 12웰 플레이트에 넣은 다음 1mL의 배지가 있는 단일 웰에 세포를 시딩합니다. 플레이트를 5%CO2와 함께 37°C의 가습된 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하여 70%-80% 합류점에 도달합니다.
- Au@CDs 단일 웰에 넣고 4-6 시간 동안 배양합니다.
참고: 배양하기 전에 기질, 특히 용액상 NP의 안정성을 테스트하십시오. 이러한 물질은 저장 및 사용 중 용해, 응집 및 침전 과정을 통해 분해되기 쉬우므로 EM 손실이 감소하고 SERS 활성이 감소할 수 있습니다. 더 중요한 것은, 세포 흡수의 경우, NPs22의 크기에 의해 크게 영향을 받을 수 있다는 것이다. - 배양하는 동안 기질은 세포내 흡수를 통해 세포로 들어갑니다. 배양 후 세포 내부에 몇 개의 검은 입자가 보일 때까지 광학 현미경으로 세포를 관찰합니다.
참고: SERS 강도가 약한 경우 Au@CD 농도를 높이거나 배양 시간을 연장하십시오. - 배지를 제거하고, 사파이어 칩을 인산염 완충 식염수(PBS)로 부드럽게 헹구고, SERS 검출을 위해 PBS에 담근다(16).
4. 세포 SERS 실험
- 컴퓨터를 열고 라만 분광기를 켜고 소프트웨어를 시작한 다음 785nm 레이저를 켭니다( 재료 표 참조).
- New Measurement(새 측정)를 클릭하고 새로운 스펙트럼 수집을 시작합니다. 샘플 측정 전에 실리콘 웨이퍼로17을 보정하십시오.
- 20x 대물 렌즈를 사용하여 선명한 세포 이미지가 관찰되도록 한 다음 대물 렌즈를 50x로 변경합니다. 레이저 출력을 낮음에서 높음으로 설정하고 적절한 노출 시간과 축적을 설정합니다.
알림: SERS 측정 전에 적절한 레이저 출력을 확인하여 돌이킬 수 없는 셀 손상을 방지하고 획득 매개변수가 일관되는지 확인하십시오. SERS 강도는 레이저 출력, 스폿 크기, 축적 및 노출 시간과 관련이 있습니다. - 측정할 셀 지점을 선택하고 실행을 클릭합니다. 각 세포는 20개의 스팟으로 측정하고, 10개의 셀은 평균을 취하여 측정한다.
참고: 세포 내 구성 요소는 복잡하여 스펙트럼 불균형이 큽니다. 따라서 유사한 세포 영역에서 스펙트럼을 취하고 가능한 한 많은 스펙트럼을 취하십시오. - 스펙트럼을 저장합니다.
- New Streamline 이미지 획득을 클릭한 다음 Video Review를 클릭하고 촬영할 범위를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 매개변수를 설정합니다: 785nm 에지 유선형, 중심 1,200cm-1, 노출 시간 5초, 누적 횟수 3, 레이저 출력 50%.
- New of Living 이미징을 클릭하고 Signal to Baseline을 선택하고 첫 번째 한계 625에서 두 번째 한계 1,700까지 범위를 설정한 다음 Area setup을 클릭합니다. 그런 다음 적절한 단계를 설정하고 적용 및 확인을 클릭합니다. 마지막으로 Run(실행)을 클릭하여 SERS 이미징 수행을 시작합니다.
5. 세균 배양 및 SERS 측정
- 대장균과 황색포도상구균(1:100)의 하룻밤 배양물을 새로운 Luria-Bertani(LB) 배지 5mL에 희석합니다(재료 표 참조). 37°C에서 600 0.4 내지 0.6으로 성장시킨 후, 배양액을 5,000 × g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다.
- 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁시킨 후 5분 동안 5,000 × g 원심분리(실온에서)를 2회 실시하였다.
- 박테리아 배양액을 Au@CDs과 혼합하고 SERS 플랫폼 바로 아래에서 혼합물을 관찰합니다.
6. 데이터 분석
- 스펙트럼을 평활화하고 기준선을 수정합니다.
- 처리된 데이터로 주성분 분석(PCA)16을 수행합니다.
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Representative Results
Au@CDs의 제작은 그림 1에 나와 있습니다. CD는 전형적인 열수 공정18을 통해 CA 및 GA로부터 제조되었다. Au@CDs 실온에서 수성 매질에서 CD에 의해 HAuCl4를 환원시킴으로써 신속하게 합성되었다. CD 및 Au@CDs의 크기 및 형태는 TEM 및 고분해능(HR)TEM23에 의해 관찰될 수 있다. 준비된 CD는 거의 2-6nm의 작은 크기로 단분산됩니다(그림 2A). 구형 Au 핵은 약 2.1nm의 CD 껍질 층으로 코팅되어 있습니다(그림 2B, C 및 보충 그림 1).
CD와 Au@CDs의 구조를 확인하기 위해 FT-IR 스펙트럼을 기록하여 유기 작용기를 분석했습니다(그림 2D). 3,000-3,600/2,500-2,800 cm-1, 1,251/1,629 cm-1 및 1,471 cm-1의 밴드는 OH 스트레칭 진동, C=O 스트레칭 진동 및 CO 스트레칭 진동에 각각24,25로 할당할 수 있습니다. 또한 1,741cm-1에서 늘어나는 진동 대역은 C-C 24와 관련이 있습니다. GA 및 CA로부터의 이들 작용기 중 몇몇은 또한 CD 및 Au@CDs에 존재하며, 이는 NP의 성공적인 합성을 시사한다. CD의 UV-vis 흡수 스펙트럼은 265 nm에서 특징적인 피크를 가지며, 이는 환원시 사라지는 탄소 코어26에서 격리된 방향족 구조를 나타낸다. Au@CDs 스펙트럼은 545nm에서 특징적인 피크를 나타내며, 이는 Au 핵의 SPR 흡수 밴드와 연관되어 복합 나노 구조의 제조를 나타냅니다(그림 2E).
도 3A,B에서 보는 바와 같이, MB의 농도가 10-9 M로 낮을 때에도, Au@CDs Au NPs에 비해 우수한 SERS 성능을 나타낸다. 증강 인자(EF)는 다음의 수학식16에 의해 계산될 수 있으며, 여기서 SERS와 I0는 각각 SERS 스펙트럼 및 정상 라만의 라만 강도를 의미하고, CSERS와C0는 각각 SERS 및 라만 측정에 사용되는 기질 분자의 농도를 의미한다. 1,620cm-1MB를 계산하면 Au@CDs의 EF는 거의 2.1 × 105로 Au NP보다 약 3배 더 강합니다(6.8 × 104).
770 cm-1 (C-H의 면내 굽힘), 1,398 cm-1 (C-N의 대칭 스트레칭) 및 1,625 cm-1 (C-C 링 스트레칭)과 같은 몇 가지 특징적인 피크가 검출될 수 있으며, 이는 보고된 문헌27과 일치한다. 동시에 10-5M에서 10-9M의 MB가 검출되어 정량화를 위해 1,620cm-1에서 SERS 밴드를 취합니다. 선형 관계는 y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922)로 정의됩니다 (그림 3B). 감도 외에도 재현성 및 장기 안정성은 모두 SERS 기판에 대한 중요한 지표입니다. 따라서 SERS 스펙트럼은 20개 지점에서 무작위로 획득되어 이들 간에 높은 유사성을 나타냈습니다(그림 3C,D). 4개의 스펙트럼이 1개월 동안 수집되었고, MB의 특징적인 피크는 4°C에 배치된 후 1개월 후에도 여전히 검출되었으며, 950 cm-1, 1,185 cm-1, 및 1,620 cm-1에서의 평균 SERS 활성은 각각 약 5.43%, 11.44%, 및 13.94%의 붕괴도를 나타내었으며(도 3E), 이는 Au@CD 기질의 우수한 재현성 및 장기 안정성을 나타낸다.
본 세포 SERS 측정에서, 첫째로, NPs의 세포독성을 시험하였다. Au@CDs(20-100 μM)은 A549 세포에 대해 세포독성을 거의 나타내지 않았습니다(그림 3F). 위의 결과는 살아있는 세포에서 무표지 SERS 측정에 적용될 수 있는 Au@CDs의 높은 잠재력을 시사합니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 Au@CD 조립된 SERS 기판은 800cm-1에서 1,700cm까지의 세포 구성 요소에 대한 통합 SERS 매핑을 제공합니다. Au@CD NP 응집체는 A549 셀의 SERS 매핑에서 노이즈 배경 없이 명백한 SERS 신호를 나타내는 것으로 관찰되었습니다(그림 4B). 서로 다른 세포 지점의 3가지 스펙트럼이 그림 4C에 표시되어 있으며, 이는 다양한 세포질 영역에서 성분의 이질성과 단일 세포 분석을 위한 SERS 프로브로서의 Au@CDs의 우수성을 보여줍니다. A549 세포의 평균 스펙트럼은 그림 4A에 나와 있으며 풍부한 세포 정보를 관찰할 수 있습니다. 상세한 특성 피크 할당은 표 1에 제공되어 있다.
또한 Au@CDs 두 가지 박테리아 균주를 검출하고 구별하는 우수한 능력을 보여줍니다. 얻어진 스펙트럼은 1,030 cm-1의 페닐알라닌 및 741 cm-1의 핵산 고리 호흡과 같은 대장균 및 황색포도상구균에 대한 공개된 문헌과 매우 유사하며(그림 5A, B), 이는 SERS 측정의 신뢰성을 검증합니다28. 상세한 특성 피크 할당(28,29,30,31)은 표 2에 제공된다. PCA 모델도 잘 구별합니다(그림 5C,D).
그림 1: Au@CDs의 합성 경로에 대한 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : CD 및 Au@CDs의 대표적인 특성. (A) CD의 HRTEM 이미지. 스케일 바: 10nm. (B) Au@CDs의 TEM 이미지. 스케일 바: 100nm. (C) Au@CDs의 인터페이스 영역의 HRTEM 이미지. 스케일 바: 10 nm; 삽입 : 2 nm. (D) 원시 GA, CA 및 준비된 CD 및 Au@CDs의 FT-IR 스펙트럼. (E) CD, Au NP 및 Au@CDs의 UV-vis 흡수 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Au@CDs의 SERS 활동. (A) 벌크 MB (10-5 M, 검은 선) 및 10-9 M MB (청색 선 및 녹색 선) 용액의 SERS 스펙트럼. (B) 상이한 농도 (10-9-10-5 M)에서 MB의 SERS 스펙트럼. 삽입: MB의 1,620cm-1에서 SERS 밴드의 선형 관계, y = 0.2437x + 2.1756(R2 = 0.9922). SERS 기질 재현성(C), 상대 표준 편차(RSD) 히스토그램(1,620cm-1 피크 MB at 10-7 M)(D) 및 장기 안정성(E) 실험 결과. (F) Au@CD 농도 구배로 24시간 배양한 후 A549 세포의 세포 생존율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: A549 세포의 지문 분석 및 비표지 SERS 이미징. (A) A549 세포의 평균 SERS 스펙트럼. (B) A549 셀의 명시야, SERS 매핑 및 병합된 이미지. 스케일 바: 20μm. (C) 1, 2 및 3의 병합된 이미지에 표시된 다른 세포 지점의 SERS 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 두 가지 박테리아 균주의 지문 분석. 대장균 (A)과 황색 포도상구균(B)의 평균 SERS 스펙트럼. 2D PCA(C) 및 3D PCA(D)는 두 박테리아 균주의 감별 분석에 관한 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: A549 세포의 라만 피크에 대한 할당. 약어: Pro = proline; HYP = 하이드록시프롤린; 티르 = 티로신; Trp = 트립포토판; Phe = 페닐알라닌; A = 아데닌; T = 티민; C = 시토신; G = 구아닌; 굽힘 = 굽힘; str = 스트레칭; def = 변형; 트위스트 = 비틀림; 호흡 = 호흡; 흔들림 = 흔들림; sym = 대칭; 비대칭 = 비대칭; BK = 백본. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 대장균(E. coli)과 황색포도상구균(S. aureus)의 라만 피크에 대한 할당.약어: Tyr = 티로신; Phe = 페닐알라닌; A = 아데닌; G = 구아닌; str = 스트레칭; def = 변형; 호흡 = 호흡; sym = 대칭. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: Au@CDs의 동적 광산란 연구. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
요약하면, 2.1nm의 초박형 CD 쉘을 가진 Au@CDs이 성공적으로 제작되었습니다. 나노 복합체는 순수한 Au NP보다 우수한 SERS 감도를 보여줍니다. 또한 Au@CDs 재현성과 장기 안정성에서 우수한 성능을 가지고 있습니다. 추가 연구에는 A549 세포(31)의 SERS 이미징을 수행하고 2개의 박테리아 균주(32)를 검출하기 위해 Au@CDs 기질로 사용하는 것이 포함됩니다. Au@CDs는 주로 Au NP와 CD 사이의 화학적 향상을 기반으로 하는 초고감도 SERS 프로브로 사용될 수 있음이 입증되었습니다.
이전 프로토콜에서 SERS 측정 중에 몇 가지 핵심 사항이 있습니다. 첫째, Au@CDs 세포 및 박테리아 샘플에 적용하기 전에 우수한 SERS 기질 공식과 염료 분자로 확인할 수 있는 올바른 농도를 보장해야 합니다. 그 후, SERS 스펙트럼은 생물학적 샘플이 복잡하고 동적이기 때문에 모든 세포 지점에서 일관되지 않습니다.
더 큰 레이저 스폿을 취하면 다른 지점의 SERS 스펙트럼이 더 유사합니다. 참고로, 동일한 세포 지점의 SERS 스펙트럼은 상이한 레이저 출력에 부합하지 않을 수 있다. 생물학적 샘플의 평균 SERS 스펙트럼이 일관된다는 것은 잘 알려져 있습니다. 따라서 가능한 한 동일한 세포 영역에서 SERS 스펙트럼을 얻은 다음 여러 다른 세포 영역의 평균을 구하는 것이 중요합니다. 또한 세포 내 SERS 검출 감도는 배경 신호의 영향을 쉽게 받습니다. 라만 배경 신호는 주로 (1) 사파이어, 실리콘 웨이퍼 등과 같은 기판, (2) SERS 프로브 및 (3) 생물학적 샘플을 포함한 세 가지 측면에서 비롯됩니다. 따라서 가능하면 배경 소음이 없는 기판을 선택하는 것이 좋지만 이는 어렵습니다.
기존의 라만 분광법과 비교하여 SERS는 신호 강도를33 자릿수만큼 크게 향상시킬 수 있습니다. 이 작업에서 금은 크기와 모양을 최적화하는 능력이 더 우수하고 은34보다 세포 독성이 적고 화학적으로 불활성이며 견고하기 때문에 복합 NP의 제조를 위해 선택되었습니다. 한편, Au 표면에 부착된 CD 쉘은 세포와 금속 NP 사이의 상호작용을 감소시킬 수 있다(33). 결론적으로, 상기 결과는 비침습적 및 비파괴적 기술로서 비표지 SERS를 입증했으며, 이는 단일 세포 수준35에서 분석물의 고유한 화학적 조성을 제공할 수 있다.
이전 연구에서는 기본 지문 정보가 왜곡된 경우 적절한 감지 환경과 시간을 제어하는 것이 필수적이라는 것을 보여주었다5. 따라서 신뢰할 수 있는 스펙트럼을 얻기 위해 세포에 손상이 없는지 확인하는 것이 중요합니다. (1) 세포내 SERS 측정의 경우, SERS 활성 Au NP는 단백질, 지질 또는 핵산과 같은 세포내 성분과 상호작용할 수 있다4. 따라서 생체 적합성 및 SERS 신호 할당을 고려해야 합니다. (2) SERS 검출 중 지속적인 레이저 노출은 세포 독성 또는 생물 시료를 손상시킬 수 있습니다. (3) 그림 5A, B에서 볼 수 있듯이 휴대용 SERS 플랫폼에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다 - 라만 강도 또는 감지 할 수있는 신호가 그림 4에 표시된 것과 같이 좋지 않습니다.
또한, 액적 미세유체(36), 딥 러닝(deep learning)(37), 머신 러닝(machine learning)(38), 촉매 헤어핀 어셈블리 증폭 기술(catalytic hairpin assembly amplification technology)(39) 및 형광 기술(fluorescence technology)(40)과 같은 다른 기술들과 결합될 때, 이러한 통합 전략들은 SERS의 우수성을 발전시킬 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(32071399 및 62175071), 광저우 과학 기술 프로그램(2019050001), 광동 기초 및 응용 기초 연구 재단(2021A1515011988) 및 중국 교육부 광전자 과학 기술 핵심 연구소(푸젠 사범 대학) 개방형 재단(JYG2009)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al.
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U.
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q.
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
