Summary
In deze studie ontwikkelden we een goedkope oppervlakte-verbeterde Raman scattering (SERS) -gebaseerde vingerafdruk nanoprobe met gunstige biocompatibiliteit om labelvrije levende celbioimaging te tonen en twee bacteriestammen te detecteren, die in detail laten zien hoe SERS-spectra van levende cellen kunnen worden verkregen in een niet-destructieve methode.
Abstract
Surface-enhanced Raman scattering (SERS) -technologie heeft steeds meer aandacht getrokken op biomedisch gebied vanwege het vermogen om moleculaire vingerafdrukinformatie van biologische monsters te verstrekken, evenals het potentieel in eencellige analyse. Dit werk heeft tot doel een eenvoudige strategie vast te stellen voor labelvrije SERS-bioanalyse op basis van Au@carbon dot nanoprobes (Au@CDs). Hier worden polyfenol-afgeleide cd's gebruikt als reductiemiddel om snel kernschil Au@CD nanostructuren te synthetiseren, wat krachtige SERS-prestaties mogelijk maakt, zelfs wanneer de concentratie methyleenblauw (MB) zo laag is als 10-9 M, vanwege het coöperatieve Raman-verbeteringsmechanisme. Voor bioanalyse kan Au@CDs dienen als een unieke SERS-nanosensor om de cellulaire componenten van biosamples (bijv. Kankercellen en bacteriën) te identificeren. De moleculaire vingerafdrukken van verschillende soorten kunnen verder worden onderscheiden na combinatie met de hoofdcomponentenanalyse. Daarnaast Au@CDs ook labelvrije SERS-beeldvorming mogelijk maken om intracellulaire samenstellingsprofielen te analyseren. Deze strategie biedt een haalbare, labelvrije SERS-bioanalyse, die een nieuw perspectief biedt voor nanodiagnostiek.
Introduction
Eencellige analyse is essentieel voor de studie van het onthullen van cellulaire heterogeniteit en het beoordelen van de uitgebreide toestand van de cel. De onmiddellijke reactie van de cel op de micro-omgeving rechtvaardigt ook eencellige analyse1. Er zijn echter enkele beperkingen aan de huidige technieken. Fluorescentiedetectie kan worden toegepast op eencellige analyse, maar wordt beperkt door een lage gevoeligheid. Andere uitdagingen vloeien voort uit de gecompliceerde fluorescentieachtergrond van cellen en de fluorescentiefotobleking onder langdurige bestraling2. Oppervlakteversterkte Raman-verstrooiing (SERS) kan in aanmerking komen in termen van eencellige analyse vanwege de voordelen ervan, waaronder (1) het weergeven van de intrinsieke moleculaire vingerafdrukinformatie en de onmiddellijke situatie, (2) ultrahoge oppervlaktegevoeligheid, (3) handige multiplexdetectie, (4) hoge fotostabiliteit, (5) detectie kan worden gekwantificeerd voor vergelijkende analyse, (6) het vermijden van cellulaire autofluorescentie met de NIR-golflengte-excitatie, (7) detectie kan worden uitgevoerd in een cellulaire waterige omgeving, en (8) detectie kan worden gericht op een specifiek gebied binnen de cel 3,4,5.
Er zijn twee algemeen erkende mechanismen om SERS als een fundamenteel fenomeen te begrijpen: elektromagnetische versterking (EM) als een dominante reden en chemische verbetering (CM). EM verwijst naar, in een bepaalde frequentie van het opwindende veld, de oscillatie van collectieve elektronen aangedreven door elektromagnetische golven wanneer de frequentie van het invallende licht overeenkomt met de frequentie van vrije elektronen die oscilleren in het metaal, wat aanleiding geeft tot oppervlakteplasmonresonantie (SPR). Wanneer gelokaliseerde SPR (LSPR) optreedt door de invallende laser die de metalen nanodeeltjes (NP's) raakt, leidt dit tot de resonantieabsorptie of verstrooiing van het invallende licht. Bijgevolg kan de elektromagnetische veldintensiteit van metalen NP's aan het oppervlak met twee tot vijf ordes4 worden verbeterd. De sleutel tot de enorme verbetering in SERS is echter niet een enkele metalen NP, maar de kloof tussen twee NP's, waardoor hotspots ontstaan. CM wordt gegenereerd van twee kanten, waaronder (1) interacties tussen doelmoleculen en metalen NP's en (2) doelmoleculen die elektronen kunnen overbrengen van / naar metalen NP's 4,5. Meer uitputtende details zijn te vinden in deze overzichtsartikelen 4,5. Verschillende veelbelovende methoden voor SERS-biosensing en beeldvorming in levende cellen zijn in eerdere literatuur gepresenteerd, bijvoorbeeld de detectie van apoptotische cellen6, eiwitten in organellen7, intracellulaire miRNA's8, cellulaire lipidemembranen, 9cytokines10 en metabolieten11 in levende cellen, evenals de identificatie en monitoring van cellen door confocale SERS-beeldvorming2, 11,12,13. Interessant is dat labelvrije SERS het unieke voordeel van SERS presenteert, dat interne moleculaire spectra5 kan beschrijven.
Een belangrijk probleem voor labelvrije SERS is een rationeel en betrouwbaar substraat. Typische SERS-substraten zijn edelmetaal NP's vanwege hun uitstekende vermogen om veel licht te verstrooien14. Tegenwoordig wordt er steeds meer aandacht besteed aan nanocomposieten vanwege hun opmerkelijke fysische en chemische eigenschappen en biocompatibiliteit. Belangrijker is dat nanocomposieten een betere SERS-activiteit kunnen vertonen vanwege de intense EM die wordt veroorzaakt door de hotspots op de nanohybriden en extra chemische versterking afkomstig van andere niet-metalen materialen15. Fei et al. gebruikten bijvoorbeeld MoS 2 quantum dots (QD's) als reducers om Au NP@MoS2QD nanocomposieten te synthetiseren voor labelvrije nabij-infrarode (NIR) SERS-beeldvorming van muis 4T1 borstkankercel (4T1-cellen)16. Li et al. fabriceerden ook een 2D SERS-substraat bestaande uit Au NP's en 2D hafnium ditelluride nanosheets voor labelvrije SERS-metingen van door voedsel overgedragen pathogene bacteriën17. Onlangs zijn carbon dots (CD's), goede elektronendonoren, gebruikt als reductanten zonder andere reductanten of bestraling om Au@carbon dot nanoprobes (Au@CDs)18 te synthetiseren, waarvan is gemeld dat ze efficiënte materialen zijn om de SERS-activiteit te verbeteren op basis van het charge-transfer (CT) -effect tussen Au-kernen en CD-schillen 19,20. Meer dan dat, cd's worden erkend als het aftoppingsmiddel en een stabilisator om te voorkomen dat Au NP's21 aggregeren. Bovendien opent het meer mogelijkheden voor reacties met analyten, omdat het een groot aantal bindende en actieve plaatsen kan bieden20. Gebruikmakend van het bovenstaande ontwikkelden Jin et al. een snelle en controleerbare methode voor het fabriceren van Ag@CD NP's met unieke SERS-eigenschappen en uitstekende katalytische activiteiten voor het monitoren van heterogene katalytische reacties in realtime18.
Hierin werd een eenvoudige en goedkope methode aangetoond voor het fabriceren van core-shell Au@CD SERS-substraten om cellulaire componenten en labelvrije SERS-bioimaging van levende cellen te identificeren, evenals om Escherichia coli (E. coli) en Staphylococcus aureus (S. aureus) te detecteren en te differentiëren, wat veelbelovend is voor de vroege diagnose van ziekte en een beter begrip van cellulaire processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van Au@CDs
OPMERKING: Figuur 1 illustreert een fabricageprocedure voor Au@CDs.
- Bereid cd-oplossing met citroenzuur (CA) en galluszuur (GA) via een typische hydrothermale behandelingsprocedure18. Voeg 100 μL 3,0 mg ml-1 van de bereide CD-oplossing toe aan 200 μl chlooraurazuur (HAuCl4) (zie materiaaltabel) bij kamertemperatuur gedurende 10 s totdat een paarse suspensie is verkregen.
- Centrifugeer de paarse suspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op 4.000 × g en verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet als het verwijderen van de Au@CD colloïden moeilijk is.
- Resuspendeer de Au@CDs met 200 μL gedeïoniseerd water (weerstand van 18,2 MΩcm) om de overtollige cd's te wassen.
- Herhaal stap 1.2 en verkrijg de NP's van de kernschil, opnieuw gedispergeerd in 100 μL gedeïoniseerd water, en bewaar bij 4 °C. De NP's kunnen 1 maand bewaard worden.
2. Karakterisering van Au@CDs
- Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
- Laat de CD en Au@CD monsters een nacht bij -80 °C om te lyofileren uit een bevroren oplossing en plet na lyofilisatie tot poeder.
- Dispergeer de verkregen poedermonsters voldoende in het gedeïoniseerde water door ultrasoonapparaat, met 100% vermogen, gedurende 5 minuten.
- Laat een paar druppels van de monstersuspensie vallen op een Cu-gecoat TEM-rooster bedekt met een lacey koolstoffilm en leg beelden vast na het drogen met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop bij een versnellingsspanning van 200 kV (zie materiaaltabel).
- Fouriertransformatie infraroodspectroscopie (FT-IR)
- Herhaal stap 2.1.1 om vermogensmonsters te verkrijgen, maal een paar voorgedroogde KBr-deeltjes tot poeders in een mortel, voeg een snufje van het monster toe en meng tegelijkertijd met de KBr-poeders voor IR-karakterisering16.
- Ultraviolet-zichtbaar-nabij-infrarood (UV-vis-NIR) absorptiespectroscopie
- Bereid de suspensie van cd's en Au@CDs met de juiste concentratie voor om ervoor te zorgen dat de absorptie minder dan één is en voer UV-vis-NIR-karakteriseringuit 16.
- Raman-spectra
- Schakel de 785 nm halfgeleiderlaser in, met een laservermogen van 10 mW en een vergroting van 20x. Stel de blootstellingsduur in op 5 s en het accumulatiegetal op drie.
- Voeg een gelijk volume bereide Au@CDs monsters toe aan 5 μL methyleenblauw (MB) oplossing en meng grondig.
- Plaats een druppel suspensie op het messing substraat om de SERS-spectra te verzamelen.
3. Celkweek
- Kweek menselijke epitheliale longcarcinoomcellen (A549-cellen, gepasseerd in het laboratorium) in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine en incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Zaai de cellen in 96-putplaten (1 × 105 cellen / put) en behandel met Au@CDs in verschillende concentraties in het bereik van 20-100 μM. Gebruik een CCK-8-testkit om de levensvatbaarheid van de cel te meten (zie tabel met materialen). Bij elke behandeling worden drie onafhankelijke duplicaten gebruikt.
- Ga voor het uitvoeren van de SERS-experimenten verder met de onderstaande stappen:
- Doe een steriele saffierchip (zie materiaaltabel) in de 12-putplaten en zaai de cellen vervolgens op een enkele put met 1 ml medium. Incubeer de platen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2gedurende een nacht om 70% -80% samenvloeiing te bereiken.
- Voeg de Au@CDs toe aan de enkele put en incubeer gedurende 4-6 uur.
OPMERKING: Test vóór de incubatie de stabiliteit van substraten, met name NP's in de oplossingsfase. Deze materialen zijn gevoelig voor degradatie door oplossings-, aggregatie- en sedimentatieprocessen tijdens opslag en gebruik, wat EM-verliezen kan verminderen en SERS-activiteit kan verminderen. Wat nog belangrijker is, voor cellulaire opname, zou het grotendeels kunnen worden beïnvloed door de grootte van de NP's22. - Tijdens de incubatie zullen substraten de cellen binnendringen door endocytische opname. Observeer na de incubatie de cellen onder een optische microscoop totdat er een paar zwarte deeltjes in de cellen worden gezien.
OPMERKING: Als de SERS-intensiteit zwak is, probeer dan de Au@CD concentratie te verbeteren of de incubatietijd te verlengen. - Verwijder het medium, spoel de saffierchips voorzichtig af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en dompel ze in PBS voor SERS-detectie16.
4. Cel SERS experimenten
- Open de computer, schakel de Raman-spectrometer in, start de software en schakel vervolgens de 785 nm-laser in (zie Materiaaltabel).
- Klik op Nieuwe meting en start een nieuwe spectrale acquisitie. Kalibreer17 met siliciumwafers voordat u het monster meet.
- Neem een 20x objectieve lens om ervoor te zorgen dat een duidelijk cellulair beeld wordt waargenomen en verander vervolgens de objectieflens in 50x. Stel het laservermogen in van laag naar hoog en de juiste belichtingstijd en accumulaties.
OPMERKING: Controleer vóór de SERS-meting het juiste laservermogen om onomkeerbare celschade te voorkomen en ervoor te zorgen dat de acquisitieparameters consistent zijn. SERS-intensiteit is gerelateerd aan laservermogen, spotgrootte, accumulatie en belichtingstijd. - Kies een punt met cellen om te meten en klik op Uitvoeren. Elke cel wordt gemeten aan de hand van 20 vlekken en 10 cellen worden gemeten om het gemiddelde te nemen.
OPMERKING: Intracellulaire componenten zijn gecompliceerd, wat leidt tot grote spectra-ongelijkheid. Neem daarom spectra in vergelijkbare cellulaire regio's en neem zoveel mogelijk spectra. - Sla de spectra op.
- Klik op Nieuw Beeldacquisitie stroomlijnen, klik vervolgens op Videobeoordeling, selecteer het bereik dat u wilt fotograferen en klik op OK. Stel de parameters in: 785 nm randstroomlijn, middelpunt van 1.200 cm-1, blootstellingsduur van 5 s, accumulaties van drie en laservermogen tot 50%.
- Klik op New of Living-beeldvorming, kies Signaal naar basislijn, stel het bereik in van eerste limiet 625 tot tweede limiet 1.700 en klik vervolgens op Gebiedsinstellingen. Stel vervolgens de juiste stappen in en klik op Toepassen en OK. Klik ten slotte op Uitvoeren om SERS-beeldvorming uit te voeren.
5. Bacteriekweek en SERS-metingen
- Verdun nachtculturen van E. coli en S. aureus (1:100) in 5 ml van het nieuwe Luria-Bertani (LB) medium (zie materiaaltabel). Na groei bij 37 °C totA 600 0,4 tot 0,6, centrifugeer de cultuur bij 5.000 × g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
- Resuspendie van de pellets in 1 ml PBS, gevolgd door een centrifugatie van 5 minuten van 5.000 × g (bij kamertemperatuur) tweemaal.
- Meng de bacteriecultuur met de Au@CDs en observeer het mengsel direct onder het SERS-platform.
6. Data-analyse
- Maak de spectra glad en corrigeer de basislijn.
- Voer principal component analysis (PCA)16 uit met de verwerkte gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fabricage van de Au@CDs is geïllustreerd in figuur 1. De cd's werden bereid uit CA en GA via een typisch hydrothermaal proces18. Au@CDs werden snel gesynthetiseerd door HAuCl4 te reduceren door cd's in waterige media bij kamertemperatuur. De grootte en morfologie van cd's en Au@CDs kunnen worden waargenomen door TEM en hoge resolutie (HR) TEM23. De geprepareerde cd's zijn monodispersed met kleine formaten van bijna 2-6 nm (figuur 2A). De bolvormige Au-kern is bedekt met een laag CD-schil van ongeveer 2,1 nm (figuur 2B,C en aanvullende figuur 1).
Om de structuren van cd's en Au@CDs te bevestigen, werden FT-IR-spectra opgenomen om de organische functionele groepen te analyseren (figuur 2D). De band op 3.000-3.600/2.500-2.800 cm-1, 1.251/1.629 cm-1 en 1.471 cm-1 kan worden toegewezen aan O-H stretching vibratie, C=O stretching vibratie en C-O stretching vibratie, respectievelijk 24,25. Ook is de rekkende trillingsband bij 1.741 cm-1 gerelateerd aan C-C 24. Een paar van deze functionele groepen van GA en CA zijn ook aanwezig in cd's en Au@CDs, wat wijst op de succesvolle synthese van NP's. UV-vis absorptiespectra van cd's hebben een karakteristieke piek bij 265 nm, wat wijst op een geïsoleerde aromatische structuur in de koolstofkernen26, die verdwijnt bij reductie. Het spectrum van Au@CDs vertoont een karakteristieke piek bij 545 nm, die geassocieerd is met de SPR-absorptieband van de Au-kern, wat wijst op fabricage van de samengestelde nanostructuur (figuur 2E).
Zoals te zien is in figuur 3A,B, vertonen Au@CDs zelfs wanneer de concentratie MB zo laag is als 10-9 M, uitstekende SERS-prestaties in vergelijking met Au NP's. De versterkingsfactor (EF) kan worden berekend met de volgende vergelijking16, waarbij I SERS en I 0 verwijzen naar de Raman-intensiteiten van respectievelijk het SERS-spectrum en normaal Raman, en C SERS en C0 verwijzen naar de concentraties van de substraatmoleculen die respectievelijk worden gebruikt voor SERS- en Raman-metingen. Uitgaande van 1.620 cm-1 MB om te berekenen, is de EF van Au@CDs bijna 2,1 × 105, wat ongeveer drie keer sterker is dan die van de Au NP's (6,8 × 104).
Er kunnen enkele karakteristieke pieken worden gedetecteerd, zoals 770 cm-1 (in-plane buiging van C-H), 1.398 cm-1 (symmetrische rek van C-N) en 1.625 cm-1 (C-C-ringrekking), wat consistent is met gerapporteerde literatuur27. Tegelijkertijd wordt 10-5 M tot 10-9 M MB gedetecteerd, waarbij de SERS-band op 1.620 cm-1 wordt genomen voor kwantificering; de lineaire relatie wordt gedefinieerd als y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922) (figuur 3B). Naast gevoeligheid zijn reproduceerbaarheid en stabiliteit op lange termijn beide belangrijke indicatoren voor SERS-substraten. Daarom werden SERS-spectra willekeurig op 20 punten verkregen, waarbij ze een hoge gelijkenis vertoonden (figuur 3C,D); vier spectra werden gedurende 1 maand verzameld, de karakteristieke pieken van MB werden 1 maand na plaatsing bij 4 °C nog steeds gedetecteerd en de gemiddelde SERS-activiteit bij 950 cm-1, 1.185 cm-1 en 1.620 cm-1 vertoonde slechts een mate van verval van respectievelijk ongeveer 5,43%, 11,44% en 13,94% (figuur 3E), wat wijst op de goede reproduceerbaarheid en stabiliteit op lange termijn van Au@CD substraten.
In de huidige cel SERS-metingen werd eerst de cytotoxiciteit van de NP's getest. Au@CDs (20-100 μM) vertoonden nauwelijks cytotoxiciteit voor A549-cellen (figuur 3F). De bovenstaande resultaten suggereren het hoge potentieel van Au@CDs die moeten worden toegepast op labelvrije SERS-metingen in levende cellen. Zoals te zien is in figuur 4, biedt het Au@CD-geassembleerde SERS-substraat geïntegreerde SERS-mapping van de cellulaire componenten van 800 tot 1.700 cm-1. Er is waargenomen dat Au@CD NP-aggregaten duidelijke SERS-signalen vertonen zonder ruisachtergrond in de SERS-mapping van A549-cellen (figuur 4B). Drie spectra van verschillende celpunten zijn weergegeven in figuur 4C, wat de heterogeniteit van componenten in verschillende cytoplasmatische regio's en de superioriteit van de Au@CDs als SERS-sondes voor eencellige analyse aantoont. Het gemiddelde spectrum van A549-cellen wordt weergegeven in figuur 4A en overvloedige cellulaire informatie kan worden waargenomen. Gedetailleerde karakteristieke piektoewijzingen zijn opgenomen in tabel 1.
Bovendien tonen Au@CDs ook een goed vermogen om twee bacteriestammen te detecteren en te differentiëren. De verkregen spectra lijken sterk op de gepubliceerde literatuur voor E. coli en S. aureus, zoals fenylalanine bij 1.030 cm-1 en een ringademhaling van nucleïnezuur bij 741 cm-1 (figuur 5A, B), die de betrouwbaarheid van SERS-metingen verifieert28. Gedetailleerde karakteristieke piekopdrachten28,29,30,31 zijn weergegeven in tabel 2. Het PCA-model discrimineert ook goed (figuur 5C,D).
Figuur 1: Schematische illustratie van de syntheseroute van de Au@CDs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve karakterisering van cd's en Au@CDs. (A) HRTEM-afbeelding van cd's. Schaalbalk: 10 nm. (B) TEM-afbeelding van Au@CDs. Schaalbalk: 100 nm. (C) HRTEM-afbeelding van het interfacegebied van Au@CDs. Schaal bar: 10 nm; inzet: 2 nm. (D) FT-IR-spectra van ruwe GA, CA en as-prepared CD's en Au@CDs. (E) UV-vis absorptiespectra van CD's, Au NP's en Au@CDs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: SERS-activiteiten van Au@CDs. (A) SERS-spectra van bulk MB (10-5 M, zwarte lijn) en de 10-9 M MB (blauwe lijn en groene lijn) oplossing. (B) SERS-spectra van MB bij verschillende concentraties (10-9-10-5 M). Insert: De lineaire relatie van de SERS-band op 1.620 cm-1 van MB, y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922). Resultaten van SERS-substraatreproduceerbaarheid (C), relatieve standaarddeviatie (RSD) histogram (1.620 cm-1 piek van MB bij 10-7 M) (D) en langetermijnstabiliteitsexperimenten (E). (F) Cel levensvatbaarheid van A549-cellen na 24 uur incubatie met de Au@CD concentratiegradiënt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vingerafdrukanalyse en labelvrije SERS-beeldvorming van A549-cellen. (A) Gemiddelde SERS-spectrum van A549-cellen. (B) Het heldere veld, SERS-mapping en samengevoegde afbeeldingen van de A549-cellen. Schaalbalken: 20 μm. (C) SERS-spectra van verschillende celpunten gemarkeerd in de samengevoegde afbeelding van 1, 2 en 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vingerafdrukanalyse van twee bacteriestammen. De gemiddelde SERS-spectra van E. coli (A)en S. aureus (B). De 2D PCA (C) en 3D PCA (D) op de differentiële analyse van twee bacteriestammen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Toewijzingen voor de Raman-pieken van A549-cellen. Afkortingen: Pro = proline; HYP = hydroxyproline; Tyr = tyrosine; Trp = trypotofaan; Phe = fenylalanine; A = adenine; T = thymine; C = cytosine; G = guanine; buigen = buigen; str = stretchen; def = vervorming; twist = draaien; adem = ademhaling; kwispelen = kwispelen; sym = symmetrisch; asym = asymmetrisch; BK = ruggengraat. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Opdrachten voor de Raman-toppen van E. coli en S. aureus. Afkortingen: Tyr = tyrosine; Phe = fenylalanine; A = adenine; G = guanine; str = stretchen; def = vervorming; adem = ademhaling; sym = symmetrisch. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Dynamische lichtverstrooiingsstudie van Au@CDs. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kortom, Au@CDs met een ultradunne CD-schil van 2,1 nm zijn met succes gefabriceerd. De nanocomposieten vertonen een superieure SERS-gevoeligheid dan pure Au NP's. Ook beschikken Au@CDs over uitstekende prestaties op het gebied van reproduceerbaarheid en stabiliteit op lange termijn. Verder onderzoek omvat het nemen van Au@CDs als substraten om SERS-beeldvorming van A549-cellen uit te voeren31 en om twee bacteriestammen te detecteren32. Het is bewezen dat Au@CDs kan worden gebruikt als een ultragevoelige SERS-sonde, voornamelijk op basis van de chemische versterking tussen Au NP's en CD's.
Er zijn een paar belangrijke punten tijdens SERS-metingen in het vorige protocol. Ten eerste, voordat Au@CDs worden toegepast in cellen en bacteriële monsters, is het noodzakelijk om te zorgen voor een superieure SERS-substraatformule en de juiste concentratie, die kan worden geverifieerd door kleurstofmoleculen. Vervolgens is het SERS-spectrum op elk cellulair punt inconsistent omdat de biologische monsters complex en dynamisch zijn.
Als u een grotere laserspot neemt, zal het SERS-spectrum vanaf verschillende punten meer op elkaar lijken. Van belang is dat het SERS-spectrum van hetzelfde cellulaire punt mogelijk niet in overeenstemming is met verschillende laservermogens. Het is algemeen aanvaard dat het gemiddelde SERS-spectrum van biologische monsters consistent is; daarom is het van cruciaal belang om het SERS-spectrum zoveel mogelijk in dezelfde cellulaire regio's te verkrijgen en vervolgens verschillende cellulaire regio's te gemiddelden. Bovendien wordt de intracellulaire SERS-detectiegevoeligheid gemakkelijk beïnvloed door achtergrondsignalen. De Raman-achtergrondsignalen komen voornamelijk van drie aspecten, waaronder (1) een substraat, zoals saffier, siliciumwafer, enzovoort, (2) een SERS-sonde en (3) biologische monsters. Daarom wordt aanbevolen om waar mogelijk substraten zonder achtergrondgeluid te kiezen, hoewel dit moeilijk is.
In vergelijking met conventionele Raman-spectroscopie kan SERS de signaalintensiteit aanzienlijk verbeteren met verschillende ordes van grootte33. In dit werk werd goud gekozen voor de fabricage van samengestelde NP's omdat het een beter vermogen bezat om de grootte en vorm te optimaliseren, minder cytotoxisch en chemisch inert en robuuster dan zilver34. Ondertussen kunnen CD-shells die aan Au-oppervlakken zijn bevestigd, de interacties tussen cellen en metalen NP'sverminderen 33. Concluderend toonden de bovenstaande resultaten labelvrije SERS aan als een niet-invasieve en niet-destructieve techniek, die een intrinsieke chemische samenstelling van analyten op eencellig niveaukan bieden 35.
Eerdere studies hebben aangetoond dat het essentieel is om de juiste detectieomgeving en -tijd te controleren in geval van vervorming van native vingerafdrukinformatie5. Daarom is het essentieel om ervoor te zorgen dat er geen schade aan de cellen is, met als doel betrouwbare spectra te verkrijgen. Andere uitdagingen zijn: (1) voor intracellulaire SERS-metingen kunnen SERS-actieve Au NP's interageren met intracellulaire componenten zoals eiwitten, lipiden of nucleïnezuren4. Daarom moeten biocompatibiliteit en SERS-signaaltoewijzingen worden overwogen; (2) constante laserblootstelling tijdens SERS-detectie kan de celcytotoxiciteit of biosamples beschadigen; en (3) zoals weergegeven in figuur 5A, B, heeft het draagbare SERS-platform nog steeds enkele beperkingen - Raman-intensiteit of signalen die kunnen worden gedetecteerd, zijn niet goed zoals wat wordt weergegeven in figuur 4.
Bovendien kunnen deze geïntegreerde strategieën, in combinatie met andere technologieën zoals druppelmicrofluïdica 36, deep learning 37, machine learning38, katalytische haarspeldassemblageversterkingstechnologie39 en fluorescentietechnologie40, de superioriteit van SERS ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32071399 en 62175071), het Science and Technology Program van Guangzhou (2019050001), de Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2021A1515011988) en de Open Foundation of the Key Laboratory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine (Fujian Normal University), Ministerie van Onderwijs, China (JYG2009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al.
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U.
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q.
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
