Summary
في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير مسبار نانوي لبصمات الأصابع منخفض التكلفة معزز بالسطح (SERS) مع توافق حيوي مناسب لإظهار التصوير الحيوي للخلايا الحية الخالية من الملصقات واكتشاف سلالتين بكتيرية ، موضحين بالتفصيل كيفية الحصول على أطياف SERS للخلايا الحية بطريقة غير مدمرة.
Abstract
جذبت تقنية تشتت رامان المحسن سطحيا (SERS) المزيد والمزيد من الاهتمام في المجال الطبي الحيوي نظرا لقدرتها على توفير معلومات البصمة الجزيئية للعينات البيولوجية ، فضلا عن إمكاناتها في تحليل الخلية الواحدة. يهدف هذا العمل إلى وضع استراتيجية بسيطة للتحليل الحيوي SERS الخالي من الملصقات بناء على مجسات نانوية نقطية Au@carbon (Au@CDs). هنا ، يتم استخدام الأقراص المدمجة المشتقة من البوليفينول كمختزل لتجميع الهياكل النانوية Au@CD الغلاف الأساسي بسرعة ، مما يسمح بأداء SERS القوي حتى عندما يكون تركيز الميثيلين الأزرق (MB) منخفضا مثل 10-9 M ، بسبب آلية تعزيز Raman التعاونية. بالنسبة للتحليل الحيوي ، يمكن أن يكون Au@CDs بمثابة مستشعر نانوي فريد من نوعه SERS لتحديد المكونات الخلوية للعينات الحيوية (مثل الخلايا السرطانية والبكتيريا). يمكن تمييز البصمات الجزيئية من الأنواع المختلفة بعد الجمع مع تحليل المكون الرئيسي. بالإضافة إلى ذلك ، Au@CDs أيضا تمكين تصوير SERS الخالي من الملصقات لتحليل ملفات تعريف التركيب داخل الخلايا. تقدم هذه الاستراتيجية تحليلا حيويا ممكنا وخاليا من الملصقات SERS ، مما يفتح آفاقا جديدة للتشخيص النانوي.
Introduction
يعد تحليل الخلية الواحدة ضروريا لدراسة الكشف عن عدم التجانس الخلوي وتقييم الحالة الشاملة للخلية. تتطلب استجابة الخلية الفورية للبيئة المكروية أيضا تحليل الخلية الواحدة1. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على التقنيات الحالية. يمكن تطبيق اكتشاف التألق على تحليل الخلية الواحدة، ولكنه محدود بسبب الحساسية المنخفضة. تنشأ تحديات أخرى من الخلفية الفلورية المعقدة للخلايا والتبييض الضوئي الفلوري تحت التشعيع طويلالأجل 2. قد يكون تشتت رامان المعزز سطحيا (SERS) مؤهلا من حيث تحليل الخلية الواحدة نظرا لمزاياه ، بما في ذلك (1) عكس معلومات البصمة الجزيئية الجوهرية والوضع الفوري ، (2) حساسية السطح العالية للغاية ، (3) الكشف المتعدد المريح ، (4) الثبات الضوئي العالي ، (5) يمكن قياس الكشف للتحليل المقارن ، (6) تجنب التألق الذاتي الخلوي مع إثارة الطول الموجي NIR ، (7) يمكن إجراء الكشف في مائي خلوي البيئة ، و (8) يمكن توجيه الكشف إلى منطقة معينة داخل الخلية3،4،5.
هناك آليتان معترف بهما على نطاق واسع لفهم SERS كظاهرة أساسية: التحسين الكهرومغناطيسي (EM) كسبب مهيمن والتحسين الكيميائي (CM). يشير EM ، في تردد معين للمجال المثير ، إلى تذبذب الإلكترونات الجماعية التي تحركها الموجات الكهرومغناطيسية عندما يتطابق تردد الضوء الساقط مع تردد الإلكترونات الحرة المتذبذبة في المعدن ، مما يؤدي إلى رنين البلازمون السطحي (SPR). عندما يحدث SPR الموضعي (LSPR) من خلال اصطدام الليزر الساقط بالجسيمات النانوية المعدنية (NPs) ، فإنه يؤدي إلى امتصاص الرنين أو تشتت الضوء الساقط. وبالتالي ، يمكن تعزيز كثافة المجال الكهرومغناطيسي السطحي ل NPs المعدنية من قبل اثنين إلى خمسة أوامر4. ومع ذلك ، فإن مفتاح التحسين الهائل في SERS ليس NP معدني واحد ، ولكن الفجوة بين اثنين من NPs ، مما يخلق نقاطا ساخنة. يتم إنشاء CM من جانبين ، بما في ذلك (1) التفاعلات بين الجزيئات المستهدفة و NPs المعدنية و (2) الجزيئات المستهدفة القادرة على نقل الإلكترونات من / إلى NPsالمعدنية 4,5. يمكن العثور على تفاصيل أكثر شمولا في مقالات المراجعة4 و 5 هذه. تم تقديم العديد من الطرق الواعدة للاستشعار الحيوي SERS والتصوير في الخلايا الحية في الأدبيات السابقة ، على سبيل المثال ، الكشف عن الخلايا المبرمج6 ، والبروتينات في العضيات7 ، و miRNAsداخل الخلايا 8 ، والأغشية الدهنية الخلوية ،9السيتوكينات10 ، والمستقلبات11 في الخلايا الحية ، وكذلك تحديد الخلايا ومراقبتها عن طريق تصوير SERS متحد البؤر2 ، 11,12,13. ومن المثير للاهتمام ، أن SERS الخالية من الملصقات تقدم الميزة الفريدة ل SERS ، والتي يمكن أن تصف الأطياف الجزيئية الداخلية5.
تتمثل إحدى المشكلات الرئيسية ل SERS الخالية من الملصقات في الركيزة العقلانية والموثوقة. ركائز SERS النموذجية هي NPs المعدنية النبيلة بسبب قدرتها الممتازة على تشتيت الكثير من الضوء14. في الوقت الحاضر ، يتم إيلاء المزيد والمزيد من الاهتمام للمركبات النانوية بسبب خصائصها الفيزيائية والكيميائية الرائعة والتوافق الحيوي. والأهم من ذلك ، يمكن أن تظهر المركبات النانوية نشاطا أفضل ل SERS بسبب EM الشديد الناجم عن النقاط الساخنة على الهجينة النانوية والتعزيز الكيميائي الإضافي الناشئ عن المواد غير المعدنية الأخرى15. على سبيل المثال ، استخدم Fei et al. النقاط الكمومية MoS2(QDs) كمخفضات لتجميع المركبات النانوية AuNP@MoS 2 QD لتصوير SERS القريب من الأشعة تحت الحمراء (NIR) الخالي من الملصقات لخلية سرطان الثدي 4T1 للفأر (خلايا 4T1) 16. أيضا ، قام Li et al. بتصنيع ركيزة 2D SERS تتكون من صفائح Au NPs و 2D hafnium ditelluride النانوية لقياسات SERS الخالية من الملصقات للبكتيريا المسببة للأمراض المنقولة بالغذاء17. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام نقاط الكربون (CDs) ، مانحة جيدة للإلكترون ، كمختزلات بدون مختزلات أو تشعيع آخر لتجميع مجسات نانوية نقطية Au@carbon (Au@CDs) 18 ، والتي تم الإبلاغ عنها لتكون مواد فعالة لتعزيز نشاط SERS بناء على تأثير نقل الشحنة (CT) بين نوى Au وأغلفة الأقراص المضغوطة 19,20. أكثر من ذلك ، يتم التعرف على الأقراص المدمجة كعامل تغطية ومثبت لمنع Au NPs من تجميع21. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يفتح المزيد من الاحتمالات للتفاعلات مع التحليلات ، حيث يمكن أن يوفر عددا كبيرا من المواقع الملزمة والنشطة20. بالاستفادة مما سبق ، طور Jin et al. طريقة سريعة ويمكن التحكم فيها لتصنيع NPs Ag@CD بخصائص SERS الفريدة والأنشطة التحفيزية الممتازة لمراقبة التفاعلات التحفيزية غير المتجانسة في الوقت الفعلي18.
هنا ، تم عرض طريقة سهلة ومنخفضة التكلفة لتصنيع ركائز SERS ذات القشرة الأساسية Au@CD لتحديد المكونات الخلوية والتصوير الحيوي للخلايا الحية SERS الخالية من الملصقات ، وكذلك للكشف عن الإشريكية القولونية (E. coli) والمكورات العنقودية الذهبية (S. aureus) والتمييز بينهما ، مما يبشر بالخير للتشخيص المبكر للمرض وفهم أفضل للعمليات الخلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تلفيق Au@CDs
ملاحظة: يوضح الشكل 1 إجراء تصنيع Au@CDs.
- تحضير محلول CD باستخدام حامض الستريك (CA) وحمض الغال (GA) عبر إجراء معالجة حرارية مائية نموذجي18. أضف 100 ميكرولتر من 3.0 مجم مل -1 من محلول القرص المضغوط المحضر إلى 200 ميكرولتر من 10 مللي مول من حمض الكلوروريك (HAuCl4) (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثوان حتى يتم إنتاج معلق أرجواني.
- قم بطرد مركزي للتعليق الأرجواني عند 4000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام ماصة إذا كان من الصعب إزالة الغرويات Au@CD.
- أعد تعليق Au@CDs ب 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات (مقاومة 18.2 متر مكعب) لغسل الأقراص المضغوطة الزائدة.
- كرر الخطوة 1.2 واحصل على NPs ذات الغلاف الأساسي ، وأعيد تشتيتها في 100 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ، واحفظه عند 4 درجات مئوية. يمكن تخزين NPs لمدة 1 شهر.
2. توصيف Au@CDs
- المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)
- اترك القرص المضغوط وعينات Au@CD طوال الليل عند -80 درجة مئوية لتجف بالتجميد من محلول مجمد وسحقها بعد التجفيد إلى مسحوق.
- تفريق عينات المسحوق التي تم الحصول عليها في الماء منزوع الأيونات بشكل كاف عن طريق صوتنة ، بقوة 100 ٪ ، لمدة 5 دقائق.
- قم بإسقاط بضع قطرات من تعليق العينة على شبكة TEM مغلفة بالنحاس مغطاة بغشاء كربوني مزركش ، والتقط الصور بعد التجفيف باستخدام مجهر إلكتروني ناقل بجهد تسارع 200 كيلو فولت (انظر جدول المواد).
- التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FT-IR)
- كرر الخطوة 2.1.1 للحصول على عينات الطاقة ، وقم بطحن بعض جزيئات KBr المجففة مسبقا إلى مساحيق في هاون ، وأضف قليلا من العينة ، واخلطها مع مساحيق KBr في وقت واحد لتوصيف الأشعة تحت الحمراء16.
- مطيافية امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المرئية القريبة من الأشعة تحت الحمراء (UV-vis-NIR)
- قم بإعداد تعليق الأقراص المدمجة Au@CDs بتركيز مناسب للتأكد من أن الامتصاص أقل من واحد وإجراء توصيف الأشعة فوق البنفسجية مقابل NIR16.
- رامان سبكترا
- قم بتشغيل ليزر أشباه الموصلات 785 نانومتر ، بقوة ليزر تبلغ 10 ميجاوات وتكبير اعتراض يبلغ 20 ضعفا. اضبط مدة التعرض على 5 ثوان وعدد التراكمات على ثلاثة.
- أضف حجما متساويا من عينات Au@CDs المحضرة إلى 5 ميكرولتر من محلول الميثيلين الأزرق (MB) واخلطه جيدا.
- ضع قطرة من التعليق على الركيزة النحاسية لجمع أطياف SERS.
3. ثقافة الخلية
- زراعة خلايا سرطان الرئة الظهارية البشرية (خلايا A549 ، تمر في المختبر) في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين واحتضانها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- قم بزرع الخلايا في 96 لوحة بئر (1 × 105 خلايا / بئر) ومعالجتها Au@CDs بتركيزات مختلفة في حدود 20-100 ميكرومتر. استخدم مجموعة فحص CCK-8 لقياس صلاحية الخلية (انظر جدول المواد). يتم استخدام ثلاث نسخ مكررة مستقلة في كل علاج.
- لإجراء تجارب SERS ، تابع اتباع الخطوات أدناه:
- ضع رقاقة ياقوت معقمة (انظر جدول المواد) في ألواح 12 بئرا ثم بذر الخلايا في بئر واحدة مع 1 مل من الوسط. احتضان الألواح في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2طوال الليل للوصول إلى التقاء 70٪ -80٪.
- أضف Au@CDs إلى البئر الفردي واحتضانه لمدة 4-6 ساعات.
ملاحظة: قبل الحضانة ، اختبر استقرار الركائز ، وخاصة مرحلة الحل NPs. هذه المواد عرضة للتحلل من خلال عمليات الذوبان والتجميع والترسيب أثناء التخزين والاستخدام ، مما قد يقلل من خسائر EM ويقلل من نشاط SERS. والأهم من ذلك ، بالنسبة للامتصاص الخلوي ، يمكن أن يتأثر إلى حد كبير بحجم NPs22. - أثناء الحضانة ، ستدخل الركائز الخلايا من خلال امتصاص الخلايا الداخلية. بعد الحضانة ، راقب الخلايا تحت المجهر الضوئي حتى يتم رؤية بعض الجسيمات السوداء داخل الخلايا.
ملاحظة: إذا كانت شدة SERS ضعيفة ، فحاول تحسين تركيز Au@CD أو إطالة وقت الحضانة. - قم بإزالة الوسط ، واشطف رقائق الياقوت برفق بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وقم بغمسها في برنامج تلفزيوني لاكتشاف SERS16.
4. تجارب SERS الخلوية
- افتح الكمبيوتر ، وقم بتشغيل مطياف Raman ، وابدأ تشغيل البرنامج ثم قم بتشغيل ليزر 785 نانومتر (انظر جدول المواد).
- انقر فوق قياس جديد وابدأ عملية اكتساب طيفية جديدة. معايرة17 مع رقائق السيليكون قبل قياس العينة.
- التقط عدسة موضوعية بمعدل 20 ضعفا لضمان ملاحظة صورة خلوية واضحة ، ثم قم بتغيير العدسة الشيئية إلى 50x. اضبط طاقة الليزر من الأقل إلى الأعلى ووقت التعرض المناسب والتراكمات.
ملاحظة: قبل قياس SERS ، تحقق من طاقة الليزر المناسبة لمنع تلف الخلايا الذي لا رجعة فيه وتأكد من اتساق معلمات الاستحواذ. ترتبط شدة SERS بقوة الليزر وحجم البقعة والتراكم ووقت التعرض. - اختر نقطة من الخلايا لقياسها وانقر فوق تشغيل. يتم قياس كل خلية ب 20 نقطة ، ويتم قياس 10 خلايا لأخذ المتوسط.
ملاحظة: المكونات داخل الخلايا معقدة ، مما يؤدي إلى تباين واسع في الأطياف. لذلك ، خذ أطيافا في مناطق خلوية مماثلة وخذ أكبر عدد ممكن من الأطياف. - احفظ الأطياف.
- انقر فوق الحصول على صورة New Streamline ، ثم انقر فوق مراجعة الفيديو ، وحدد النطاق المراد تصويره ، وانقر فوق موافق. اضبط المعلمات: انسيابية حافة 785 نانومتر ، مركز 1200 سم -1 ، مدة التعرض 5 ثوان ، عدد التراكمات ثلاثة ، وطاقة الليزر إلى 50٪.
- انقر فوق تصوير جديد من المعيشة ، واختر إشارة إلى خط الأساس ، واضبط النطاق من الحد الأول 625 إلى الحد الثاني 1700 ، ثم انقر فوق إعداد المنطقة. ثم اضبط الخطوات المناسبة ، وانقر فوق تطبيق وموافق. أخيرا ، انقر فوق تشغيل لبدء إجراء تصوير SERS.
5. الثقافة البكتيرية وقياسات SERS
- تمييع الثقافات الليلية للإشريكية القولونية والمكورات العنقودية الذهبية (1: 100) في 5 مل من وسط Luria-Bertani (LB) الجديد (انظر جدول المواد). بعد النمو عند 37 درجة مئوية إلى A600 0.4 إلى 0.6 ، قم بطرد مركزي للثقافة عند 5000 × جم لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا.
- أعد تعليق الكريات في 1 مل من PBS متبوعا بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق 5,000 × جم (في درجة حرارة الغرفة) مرتين.
- امزج المزرعة البكتيرية مع Au@CDs وراقب الخليط مباشرة تحت منصة SERS.
6. تحليل البيانات
- قم بتنعيم الأطياف وتصحيح خط الأساس.
- قم بإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA)16 باستخدام البيانات المعالجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 تصنيع Au@CDs. تم إعداد الأقراص المدمجة من CA و GA عبر عملية حرارية مائية نموذجية18. تم تصنيع Au@CDs بسرعة عن طريق تقليل HAuCl4 بواسطة أقراص مضغوطة في وسط مائي في درجة حرارة الغرفة. يمكن ملاحظة حجم وشكل الأقراص المدمجة Au@CDs بواسطة TEM و TEM23 عالي الدقة (HR). الأقراص المدمجة المحضرة أحادية التشتت بأحجام صغيرة تبلغ حوالي 2-6 نانومتر (الشكل 2 أ). نواة Au الكروية مغلفة بطبقة من غلاف CD تبلغ حوالي 2.1 نانومتر (الشكل 2B ، C والشكل التكميلي 1).
لتأكيد هياكل الأقراص المدمجة Au@CDs ، تم تسجيل أطياف FT-IR لتحليل المجموعات الوظيفية العضوية (الشكل 2D). يمكن تعيين النطاق عند 3,000-3,600 / 2,500-2,800 سم -1 و 1,251 / 1,629 سم -1 و 1,471 سم -1 إلى اهتزاز تمدد O-H ، واهتزاز تمدد C = O ، واهتزاز تمدد C-O ،على التوالي 24,25. أيضا ، يرتبط الشريط الاهتزازي الممتد عند 1741 سم -1 ب C-C 24. يوجد أيضا عدد قليل من هذه المجموعات الوظيفية من GA و CA في الأقراص المدمجة و Au@CDs ، مما يشير إلى التوليف الناجح ل NPs. أطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للأشعة المضغوطة لها ذروة مميزة عند 265 نانومتر ، مما يشير إلى بنية عطرية معزولة في نوى الكربون26 ، والتي تختفي عند الاختزال. يظهر طيف Au@CDs ذروة مميزة عند 545 نانومتر ، والتي ترتبط بنطاق امتصاص SPR لنواة Au ، مما يشير إلى تصنيع البنية النانوية المركبة (الشكل 2E).
كما هو موضح في الشكل 3A ، B ، حتى عندما يكون تركيز MB منخفضا يصل إلى 10-9 M ، Au@CDs إظهار أداء SERS ممتاز مقارنة ب Au NPs. يمكن حساب عامل التحسين (EF) من خلال المعادلة التالية16 ، حيث يشير I SERS و I 0 إلى شدة رامان لطيف SERS ورامان العادي ، على التوالي ، ويشير C SERS و C0 إلى تركيزات جزيئات الركيزة المستخدمة في قياسات SERSو Raman ، على التوالي. بأخذ 1,620 سم -1 من ميغابايت للحساب ، فإن EF ل Au@CDs هو ما يقرب من 2.1 × 105 ، وهو أقوى بثلاث مرات تقريبا من تلك الموجودة في Au NPs (6.8 × 104).
يمكن اكتشاف بعض القمم المميزة ، مثل 770 سم -1 (الانحناء داخل المستوى ل C-H) ، و 1,398 سم -1 (التمدد المتماثل ل C-N) ، و 1,625 سم -1 (تمدد حلقة C-C) ، وهو ما يتوافق مع الأدبيات المبلغ عنها27. في الوقت نفسه ، تم الكشف عن 10-5 M إلى 10-9 M من MB ، مع أخذ نطاق SERS عند 1620 سم -1 للقياس الكمي ؛ يتم تعريف العلاقة الخطية على أنها y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922) (الشكل 3B). بالإضافة إلى الحساسية ، تعد قابلية التكاثر والاستقرار طويل الأجل مؤشرين مهمين لركائز SERS. لذلك ، تم الحصول على أطياف SERS على 20 نقطة بشكل عشوائي ، مما يدل على تشابه كبير فيما بينها (الشكل 3C ، D) ؛ تم جمع أربعة أطياف خلال شهر واحد ، ولا تزال القمم المميزة ل MB مكتشفة بعد شهر واحد من وضعها عند 4 درجات مئوية ، وأظهر متوسط نشاط SERS عند 950 سم -1 و 1185 سم -1 و 1620 سم -1 درجة من الاضمحلال تبلغ حوالي 5.43٪ و 11.44٪ و 13.94٪ على التوالي (الشكل 3E) ، مما يشير إلى قابلية التكاثر الجيدة والاستقرار طويل الأجل للركائز Au@CD.
في قياسات SERS للخلية الحالية ، أولا ، تم اختبار السمية الخلوية ل NPs. Au@CDs (20-100 ميكرومتر) بالكاد أظهر السمية الخلوية لخلايا A549 (الشكل 3F). تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى الإمكانات العالية لتطبيق Au@CDs على قياسات SERS الخالية من الملصقات في الخلايا الحية. كما هو موضح في الشكل 4 ، توفر ركيزة SERS المجمعة Au@CD تخطيطا متكاملا ل SERS للمكونات الخلوية من 800 إلى 1700 سم -1. وقد لوحظ أن مجاميع NP Au@CD تظهر إشارات SERS واضحة بدون خلفية ضوضاء في رسم خرائط SERS لخلايا A549 (الشكل 4B). يظهر الشكل 4C ثلاثة أطياف من نقاط خلايا مختلفة ، مما يدل على عدم تجانس المكونات في مناطق السيتوبلازم المختلفة وتفوق Au@CDs كمجسات SERS لتحليل الخلية الواحدة. يوضح الشكل 4A متوسط طيف خلايا A549 ، ويمكن ملاحظة معلومات خلوية وفيرة. وترد في الجدول 1 تخصيصات الذروة المميزة التفصيلية.
بالإضافة إلى ذلك ، Au@CDs أيضا إظهار قدرة جيدة على اكتشاف وتمييز سلالتين بكتيريتين. الأطياف التي تم الحصول عليها تشبه إلى حد كبير الأدبيات المنشورة ل E. coli و S. aureus ، مثل الفينيل ألانين عند 1030 سم -1 والتنفس الحلقي للحمض النووي عند 741 سم -1 (الشكل 5A ، B) ، والذي يتحقق من موثوقية قياسات SERS28. وترد في الجدول 2 تخصيصات الذروة المميزة التفصيلية28،29،30،31. يميز نموذج PCA أيضا بشكل جيد (الشكل 5C ، D).
الشكل 1: رسم تخطيطي لمسار تخليق Au@CDs. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: التوصيف التمثيلي للأقراص المدمجة و Au@CDs. (أ) صورة HRTEM للأقراص المدمجة. شريط المقياس: 10 نانومتر. (ب) صورة TEM ل Au@CDs. شريط المقياس: 100 نانومتر. (ج) صورة HRTEM لمنطقة السطح البيني ل Au@CDs. شريط المقياس: 10 نانومتر ؛ أقحم: 2 نانومتر. (د) أطياف FT-IR من GA الخام ، CA ، والأقراص المدمجة Au@CDs المعدة. (ه) أطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للأقراص المدمجة و Au NPs و Au@CDs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أنشطة SERS Au@CDs. (أ) أطياف SERS لبروميد الميثيل السائب (10-5 M، الخط الأسود) ومحلول 10-9 M MB (الخط الأزرق والخط الأخضر). (ب) أطياف SERS من بروميد الميثيل بتركيزات مختلفة (10-9-10-5 م). إدراج: العلاقة الخطية لنطاق SERS عند 1620 سم -1 من ميجابايت ، y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922). نتائج استنساخ ركيزة SERS (C) ، الرسم البياني للانحراف المعياري النسبي (RSD) (1620 سم -1 ذروة MB عند 10-7 M) (D) ، وتجارب الاستقرار طويل المدى (E). (F) صلاحية الخلايا لخلايا A549 بعد 24 ساعة من الحضانة مع تدرج تركيز Au@CD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل بصمات الأصابع وتصوير SERS الخالي من الملصقات لخلايا A549. (أ) متوسط طيف SERS لخلايا A549. (ب) الحقل الساطع ، ورسم خرائط SERS ، والصور المدمجة لخلايا A549. أشرطة المقياس: 20 ميكرومتر. (C) أطياف SERS لنقاط الخلايا المختلفة المحددة في الصورة المدمجة 1 و 2 و 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل بصمات سلالتين بكتيريتين. متوسط أطياف SERS للإشريكية القولونية (A) و S. aureus (B). 2D PCA (C) و 3D PCA (D) على التحليل التفريقي لسلالتين بكتيريتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تخصيصات قمم رامان لخلايا A549. الاختصارات: Pro = proline. HYP = هيدروكسي برولين. صور = التيروزين. Trp = تريبوتوفان ؛ Phe = فينيل ألانين ؛ أ = الأدينين. T = الثايمين. C = السيتوزين. G = الجوانين ؛ الانحناء = الانحناء ؛ str = تمتد ؛ def = تشوه ؛ تطور = التواء ؛ التنفس = التنفس. هزة = هز ؛ sym = متماثل ؛ غير متماثل = غير متماثل ؛ bk = العمود الفقري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: تخصيصات قمم رامان للإشريكية القولونية والمكورات العنقودية الذهبية. الاختصارات: صور = التيروزين. Phe = فينيل ألانين ؛ أ = الأدينين. G = الجوانين ؛ str = تمتد ؛ def = تشوه ؛ التنفس = التنفس. sym = متماثل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الشكل التكميلي 1: دراسة تشتت الضوء الديناميكي ل Au@CDs. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باختصار ، تم تصنيع Au@CDs بغلاف قرص مضغوط فائق النحافة يبلغ 2.1 نانومتر بنجاح. تظهر المركبات النانوية حساسية SERS أعلى من Au NPs النقية. أيضا ، تمتلك Au@CDs أداء ممتازا في التكاثر والاستقرار على المدى الطويل. تتضمن الأبحاث الإضافية أخذ Au@CDs كركائز لإجراء تصوير SERS لخلايا A54931 وللكشف عن سلالتين بكتيرية32. لقد ثبت أنه يمكن استخدام Au@CDs كمسبار SERS فائق الحساسية يعتمد بشكل أساسي على التحسين الكيميائي بين Au NPs والأقراص المدمجة.
هناك بعض النقاط الرئيسية أثناء قياسات SERS في البروتوكول السابق. أولا ، قبل تطبيق Au@CDs في الخلايا والعينات البكتيرية ، من الضروري ضمان تركيبة ركيزة SERS متفوقة بالإضافة إلى التركيز الصحيح ، والذي يمكن التحقق منه بواسطة جزيئات الصبغة. وبالتالي ، فإن طيف SERS غير متسق في كل نقطة خلوية لأن العينات البيولوجية معقدة وديناميكية.
إذا أخذت بقعة ليزر أكبر ، فسيكون طيف SERS من نقاط مختلفة أكثر تشابها. وتجدر الإشارة إلى أن طيف SERS لنفس النقطة الخلوية قد لا يكون متوافقا مع طاقة الليزر المختلفة. من المقبول جيدا أن متوسط طيف SERS للعينات البيولوجية ثابت. لذلك ، من الأهمية بمكان الحصول على طيف SERS في نفس المناطق الخلوية قدر الإمكان ثم حساب متوسط عدة مناطق خلوية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، تتأثر حساسية اكتشاف SERS داخل الخلايا بسهولة بإشارات الخلفية. تأتي إشارات خلفية رامان بشكل أساسي من ثلاثة جوانب ، بما في ذلك (1) ركيزة ، مثل الياقوت ، ورقاقة السيليكون ، وما إلى ذلك ، (2) مسبار SERS ، و (3) عينات بيولوجية. وبالتالي ، يوصى باختيار ركائز بدون ضوضاء في الخلفية كلما أمكن ذلك ، على الرغم من صعوبة ذلك.
بالمقارنة مع التحليل الطيفي التقليدي لرامان ، يمكن ل SERS تحسين شدة الإشارة بشكل كبير بعدة أوامر من الحجم33. في هذا العمل ، تم اختيار الذهب لتصنيع NPs المركبة لأنه يمتلك قدرة أفضل على تحسين الحجم والشكل ، كونه أقل سمية للخلايا وكذلك أكثر خاملة كيميائيا وقوة من الفضة34. وفي الوقت نفسه ، يمكن لقذائف الأقراص المضغوطة المتصلة بأسطح Au أن تقلل من التفاعلات بين الخلايا و NPsالمعدنية 33. في الختام ، أظهرت النتائج المذكورة أعلاه SERS الخالية من الملصقات كتقنية غير جراحية وغير مدمرة ، والتي يمكن أن توفر تركيبا كيميائيا جوهريا للتحليلات على مستوىخلية واحدة 35.
أظهرت الدراسات السابقة أنه من الضروري التحكم في بيئة ووقت الكشف المناسبين في حالة تشويه معلومات بصمات الأصابع الأصلية5. لذلك ، من الضروري التأكد من عدم وجود ضرر على الخلايا ، بهدف الحصول على أطياف موثوقة. تشمل التحديات الأخرى: (1) بالنسبة لقياسات SERS داخل الخلايا ، قد تتفاعل وحدات الاستخلاص الذاتي النشطة SERS مع المكونات داخل الخلايا مثل البروتينات أو الدهون أو الأحماض النووية4. ولذلك، ينبغي النظر في تخصيصات إشارة التوافق الحيوي وSERS؛ (2) قد يؤدي التعرض المستمر لليزر أثناء اكتشاف SERS إلى إتلاف السمية الخلوية للخلية أو العينات الحيوية ؛ و (3) كما هو موضح في الشكل 5A ، B ، لا تزال منصة SERS المحمولة بها بعض القيود - إما شدة رامان أو الإشارات التي يمكن اكتشافها ليست جيدة كما هو موضح في الشكل 4.
بالإضافة إلى ذلك ، عند دمجها مع تقنيات أخرى مثل الموائع الدقيقةللقطرات 36 ، والتعلم العميق37 ، والتعلم الآلي38 ، وتقنية تضخيم تجميع دبوس الشعرالتحفيزي 39 ، وتقنية التألق40 ، يمكن لهذه الاستراتيجيات المتكاملة تطوير تفوق SERS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32071399 و 62175071) ، وبرنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (2019050001) ، ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (2021A1515011988) ، والأساس المفتوح للمختبر الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا الإلكترونية الضوئية للطب (جامعة فوجيان نورمال) ، وزارة التعليم ، الصين (JYG2009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al.
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U.
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q.
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
