Summary
Her diskuterer vi en arbejdsgang til at forberede, dissekere, montere og afbilde levende explant hjerner fra Drosophila melanogaster tredje instar larver for at observere den cellulære og subcellulære dynamik under fysiologiske forhold.
Abstract
Drosophila neurale stamceller (neuroblaster, NB'er i det følgende) gennemgår asymmetriske opdelinger, regenererer den selvfornyende neuroblast, samtidig med at der dannes en differentierende ganglionmodercelle (GMC), som vil gennemgå en yderligere opdeling for at give anledning til to neuroner eller glia. Undersøgelser i NB'er har afdækket de molekylære mekanismer, der ligger til grund for cellepolaritet, spindelorientering, neurale stamcellers selvfornyelse og differentiering. Disse asymmetriske celledelinger kan let observeres via levende cellebilleddannelse, hvilket gør larve-NB'er ideelle til at undersøge den rumlige temporale dynamik i asymmetrisk celledeling i levende væv. Når NB'er i eksplantathjerner dissekeres korrekt og afbildes i næringsstofsuppleret medium, deler de sig robust i 12-20 timer. Tidligere beskrevne metoder er teknisk vanskelige og kan være udfordrende for dem, der er nye på området. Her beskrives en protokol til forberedelse, dissektion, montering og billeddannelse af levende tredje-instar larvehjerneeksplanter ved hjælp af fedtkropstilskud. Potentielle problemer diskuteres også, og der gives eksempler på, hvordan denne teknik kan bruges.
Introduction
Asymmetrisk celledeling (ACD) er den proces, hvorved subcellulære komponenter såsom RNA, proteiner og organeller fordeles ujævnt mellem datterceller 1,2. Denne proces ses almindeligvis i stamceller, som gennemgår ACD for at give anledning til datterceller med forskellige udviklingsmæssige skæbner. Drosophila NB'er deler sig asymmetrisk for at producere en NB, som bevarer sin stamme, og en ganglionmodercelle (GMC). GMC gennemgår yderligere opdelinger for at producere differentierende neuroner eller glia3. Asymmetrisk delende NB'er er rigelige i de udviklende hjerner hos tredjestjernelarver, som let observeres via mikroskopi. På det tredje stjernelarvestadie er der omkring 100 NB'er til stede i hver central hjernelap 3,4,5,6.
Asymmetrisk celledeling er en meget dynamisk proces. Live-celle imaging protokoller er blevet brugt til at måle og kvantificere dynamikken i cellepolaritet 7,8,9,10, spindel orientering 11,12,13, dynamikken i actomyosin cortex 14,15,16,17,18, mikrotubuli og centrosombiologi 19,20,21,22,23,24,25,26,27 og membran 10,28 og kromatin dynamik 29. Kvalitative og kvantitative beskrivelser af ACD er afhængige af robuste metoder og protokoller til billedopdeling af NB'er i intakte levende hjerner. Følgende protokol skitserer metoder til at forberede, dissekere og afbilde tredje stjernelarvehjerner til levende cellebilleddannelse in vivo ved hjælp af to forskellige monteringsmetoder. Disse metoder er bedst egnet til forskere, der er interesseret i den rumlige temporale dynamik i stamcelledelinger samt opdelinger i andre hjerneceller, da de giver mulighed for kort- og langsigtede observationer af cellulære begivenheder. Derudover er disse teknikker let tilgængelige for nybegyndere på området. Vi demonstrerer effektiviteten og tilpasningsevnen af denne tilgang med larvehjerner, der udtrykker fluorescerende mærkede mikrotubuli og kortikale fusionsproteiner. Vi diskuterer desuden analysemetoder og overvejelser til anvendelse i andre undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Figur 1 viser de materialer, der kræves for at udføre denne undersøgelse.
1. Overvejelser og forberedelser til forsøget
- Forhindre larverne i at overfylde.
BEMÆRK: Kvaliteten af explant larvehjerner er direkte relateret til larvernes sundhed og kvalitet før dissektion. Larver, der er underernærede fra overbelægning, vil generelt give hjerner af lavere kvalitet30.- Sørg for, at der ikke er mere end 20-30 larver til stede pr. måltidshætteskål for at undgå underernæring. Eksempler herpå kan ses i figur 2.
- Filtrer og alikvote Schneiders medium før brug.
- For hver dissektion fremstilles frisk billeddannelse og dissektionsmedium ved at supplere aliquoteret Schneiders insektmedium med 1% bovint vækstserum (BGS). Et volumen på 5 ml dissektion og billeddannelsesmedium er normalt tilstrækkeligt til et billeddannelseseksperiment.
- Opvarm det supplerede medium til stuetemperatur (RT) før brug.
- Overvej længden af filmen, der skal indsamles, og brug det til at faktorisere tilskuddet af billedmediet, monteringsmetoden og mikroskopets erhvervelsesindstillinger.
BEMÆRK: Under optimale forhold vil NB'er i hjerner suppleret med kun BGS dele sig robust i op til 3 timer.- Suppler billedmediet ved at tilføje larvefedt kropsvæv til billedmediet for at understøtte opdelinger forbi 4 timer, når der udføres eksperimenter, der kræver længere film.
BEMÆRK: Fedtlegemer udskiller mitogener, der understøtter NB-proliferation31, og hele fedtlegemer fra 10 larver er tilstrækkelige til at understøtte fire til fem hjerner. Endvidere har prøver afbildet med et membranbundet dias vist sig at dele sig i over 10 timer13,32, mens prøver afbildet med et multibrøndsglas normalt deler sig sjældnere (upublicerede observationer). - Alternativt kan du implementere et mere komplekst billedmedium til længere film, som beskrevet tidligere33. Minimer fotoskader ved at justere eksponeringstid, lasereffekt og samplingfrekvens for de bedste resultater.
- Suppler billedmediet ved at tilføje larvefedt kropsvæv til billedmediet for at understøtte opdelinger forbi 4 timer, når der udføres eksperimenter, der kræver længere film.
2. Larver iscenesættelse og indsamling (figur 2)
- Kryds 1-5 dage gamle jomfruelige hunfluer med 1-7 dage gamle voksne hanfluer for at producere afkom med den ønskede genotype. For optimalt udbytte krydses 10-15 kvindelige jomfruer med 5-10 mænd. Disse fluer anbringes i et fluebur med en måltidshætte (figur 2A-C), og de inkuberes ved 25 °C.
- Skift måltidshætten dagligt. Dette forhindrer måltidshætterne i at blive overfyldte med larver, hvilket reducerer kvaliteten af de dissekerede hjerner.
- Hvis måltidshætten er signifikant dækket af larver (dvs. >30), skal du dele denne måltidshætte i to og erstatte den ene halvdel med en frisk måltidshætte, der også er skåret i halvdelen. Alternativt kan du udskifte måltidshætterne hyppigere (dvs. hver 12. time i stedet for hver 24. time). Eksempler på overbefolkede måltidshætter kan ses i figur 2E, F.
- Måltidshætten inkuberes med larver ved 25 °C, indtil larverne når den ønskede alder.
3. Larvefedt kropsdissektion (figur 3)
BEMÆRK: Denne protokol beskriver dissektioner ved hjælp af en 3-brønds dissektionsskål.
- Pipette ~400 μL dissektion og billeddannelsesmedium pipetteres ind i hvert hul i en 3-brønds dissektionsskål.
- Vask ti 72-96 timer gamle velfodrede vildtypelarver ved forsigtigt at holde dem med dissektionspincet og dyppe dem ind og ud af dissektionsopløsningen i den nederste brønd, indtil alle madpartikler er vasket af. Efter skylning flyttes de rene larver til midterbrønden.
- Brug en pincet til at holde larven ved mundkrogene. Med det andet sæt pincet skal du bryde den ene side af larvens neglebånd.
- Dette brud vil få fedtlegemerne til at spilde ud af larven. De fede legemer er offwhite og halvgennemsigtige og vil have en gitterlignende struktur (figur 3I). De fede kroppe vil også have tendens til at klæbe til sig selv og dissektionspincetten. Når den er identificeret, skal du samle så meget fedtlegeme fra hver larve som muligt og overføre det med tangen til den øverste brønd med 400 μL RT-dissektionsmedium.
4. Larvehjernedissektion (figur 3)
- Vask forsøgslarverne i dissektion og billeddannelsesmedium som ovenfor for at frigøre dem for madrester. For de bedste resultater skal du undgå at opbevare ikke-dissekerede larver i dissektionsopløsningen. Dette vil få larverne til at "drukne" og vil påvirke kvaliteten af de dissekerede hjerner negativt.
- Brug en pincet til at holde larven ved mundkrogene. Brug et andet sæt pincet til forsigtigt at klippe/rive ca. 1/3 af larven af fra den bageste side (figur 3A). Dette vil medføre, at elementer i fordøjelseskanalen, fedtlegemer, bindevæv og nervesystem "brister" ud af larvens bristede side (figur 3B).
- Brug en pincet til at holde larven ved mundkrogene. Med det andet sæt pincet børstes neglebåndet forsigtigt mod mundkrogene, mens du "skubber" indad med pincetten, der holder mundkrogene, indtil hele larven er vendt indvendigt ud. Denne bevægelse svarer til at dreje en sok "indefra og ud" (figur 3C, D).
- Vend larven, så centralnervesystemet og andre væv vender udad, mens de stadig er forbundet med neglebåndet. På dette trin skal du lokalisere centralnervesystemet (CNS) for at undgå utilsigtet fjernelse. Brug pincet til forsigtigt at fjerne alt ikke-CNS-væv, så kun CNS og hjernen er fastgjort til neglebåndet (figur 3E).
- Hjernen vil blive fastgjort til neglebåndet via aksonale forbindelser. Brug mikrodissektionssaks til at klippe disse aksonale forbindelser for at frigøre hjernen fra neglebåndet. For at gøre dette skal du først forsigtigt skære under hjernelapperne (figur 3F). Gentag med forbindelserne under den ventrale nerveledning.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres med pincet, hvis mikrodissektionssaks ikke er tilgængelig. Vær særlig forsigtig, når du bruger pincet for at sikre, at hjernevævet ikke overbelastes under fjernelse fra neglebåndet, fordi mekanisk stress vil påvirke hjernens sundhed negativt. - Overfør den dissekerede hjerne til en brønd med dissektion og billeddannelsesmedium. Til billeddannelseseksperimenter, der er længere end 3 timer, skal der anvendes dissektion og billeddannelsesmedium suppleret med fedtlegemer som beskrevet ovenfor. Disseker larverne i portioner for at holde dissektionstiden under 20 min.
5. Montering og billeddannelse (figur 4)
- Til billeddannelse med et membranbundet dias34:
- Saml både dissekerede hjerner og isolerede fedtlegemer i den sidste brønd i dissektionsskålen.
- Saml halvdelen af objektglasset ved at placere en gasgennemtrængelig membran over bagsiden af objektglasset, og tryk splitringen ind i midten og hold den på plads (figur 4A-C).
- Brug en 200 μL mikropipette til at overføre op til 10 dissekerede hjerner og så meget fedtlegeme som muligt (se ovenfor) i ~130-140 μL dissektion og billeddannelsesmedium til membranen. Sørg for at deponere mediet med prøverne i midten af den gasgennemtrængelige membran (figur 4D, E).
- Orienter hjernen for populationen af NB'er, der skal afbildes, og for den type mikroskop, der anvendes (figur 4E). Placer prøven så tæt på mikroskopets mål som muligt. For eksempel, for at afbilde NB'er i de centrale hjernelapper, orienter hjernen således, at hjernelapperne er tættest på målet (figur 4H).
- Når hjernen er orienteret, skal du forsigtigt placere et glasdæksel oven på opløsningen på membranen. Dette vil medføre, at opløsningen, der indeholder hjerner og fedtlegemer, spredes over hele membranen (figur 4F).
- Blot overdreven opløsning ved at holde et laboratorievæv tæt på dækselkanten. Den optimale mængde opløsning opnås, når hjernen rører ved dækslet uden at blive mast. Hvis omorientering er påkrævet på dette trin, skal du forsigtigt flytte dækslet for at bevæge hjernen.
- Immobiliser dækselsedlen ved at påføre smeltet vaselin langs kanterne af dækselsedlen med en pensel. Lad geléen størkne (figur 4G).
- For billeddannelse med et billeddias med flere brønde (figur 4):
- Der tilsættes 400 μL billedsubstrat til en brønd i et multibrøndsglas (i eksperimentet, der udføres her, blev der anvendt et kammer med 8-brønds mikro[μ]-dias; Figur 4I). Overfør de tidligere dissekerede fedtlegemer til denne brønd (se trin 3.4).
- Afsæt op til 10 hjerner i en klynge nær midten af brønden (figur 4J).
- Orienter hjernen for populationen af NB'er, der skal afbildes, og for den type mikroskop, der anvendes, som beskrevet i trin 5.1.4 (figur 4K). Arranger prøverne, så de er tæt på hinanden. Dette minimerer den afstand, som trinnet skal bevæge sig mellem prøverne, hvilket reducerer prøvedrift under erhvervelsen.
- Når hjernen er orienteret i brønden, skal du lade hjernen slå sig ned i 2-5 min. Dette øger deres stabilitet under transport/billeddannelse. Forbered mikroskopet til erhvervelse i løbet af denne tid.
- Dæk μ-diaset med diasdækslet, og overfør det til mikroskopet. Begynd anskaffelsen med den lavest mulige lasereffekt og eksponeringstid for at minimere fotoblegning.
6. Bedste praksis for databehandling og -styring
- Behandl dataene efter behov i henhold til den tilgængelige analysesoftware.
- I det eksempel, der vises her, skal du gemme de erhvervede data med SlideBook-softwaren som en SlideBook-billedfil (.sld).
- Hvis du vil konvertere til Imaris' proprietære filtype (.ims) ved hjælp af Imaris File Converter, skal du åbne Imaris File Converter i et separat vindue. Klik på og træk .sld-filerne ind i afsnittet "input" i Imaris File Converter.
- Bestem den ønskede outputplacering for de konverterede filer, og klik på "Start alle."
- Efter konvertering skal du se og kommentere dataene i Imaris-softwaren.
BEMÆRK: Alternativer til billedanalyse kan bruges i stedet for Imaris, såsom Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) eller andre.
- Opbevar så mange af de originale data som muligt for korrekt registrering. Hvis anskaffelsessoftwaren f.eks. gemmes i ét filformat, men konverteres til et andet format til analyse, skal du beholde den erhvervede version af dataene.
- Til dataanalyse skal du vedligeholde en registrering af så mange detaljer som muligt om eksempel- og anskaffelsesindstillingerne. Nøgleoplysninger, der skal opbevares, inkluderer genotypen af de dissekerede larver, larvernes alder før dissektion, tilstanden af den måltidshætte, de blev opdrættet i, laserkraften, der blev brugt under billeddannelsen, eksponeringstiden, længden af erhvervelsen og den tidsmæssige opløsning.
7. Eksempel på kvantificering af cellecykluslængde (figur 5)
BEMÆRK: I dette eksempel blev larver, der udtrykker polaritetsmarkøren Pins (Pins::EGFP16) og det mikrotubulusbindende protein Jupiter25 (kirsebær::Jupiter13) afbildet. Den efterfølgende analyse blev udført ved hjælp af Imaris-software.
- Åbn filmen ved hjælp af den valgte billedanalysesoftware. Rul gennem filmens længde for at identificere delende NB'er, og mærk dem til fremtidig reference. Identificer de delende NB'er ved deres særskilte mitotiske spindler (figur 5C-E).
- Identificer et referencecellecyklustrin for at bestemme cellecykluslængden. I dette eksempel bruges metafase som reference.
- Bestem manuelt antallet af billeder mellem successive metafaser, og konverter det til minutter eller timer for at bestemme den tid, det tager at fuldføre en cellecyklus.
- Gør dette ved at tage filmens tidsmæssige opløsning og gange den med antallet af billeder mellem metafaser. Hvis filmens tidsmæssige opløsning f.eks. er et billede hvert 5. minut, og metafaser observeres i billede 13 og billede 35, vil tiden mellem disse metafaser være 110 min ([35 − 13] × 5).
- Plot dataene med enhver passende software. De data, der vises her, blev plottet ved hjælp af PRISM-software.
8. Eksempel på kvantificering af cellespindeljustering (figur 5)
BEMÆRK: I dette eksempel udføres analysen ved hjælp af Imaris-software.
- Åbn filmfilen i Imaris eller en anden software efter eget valg. Rul gennem filmens længde for at identificere delende NB'er, og mærk dem til fremtidig reference.
- Bestem vektoren dannet af spindelpolerne ved hjælp af de apikale og basale centrosomer (repræsenteret af m) som følger:
hvor Ax, Ay, og Az er koordinaterne for det apikale centrosom, og Bx, By og Bz er koordinaterne for det basale centrosom. På samme måde dannes aksen af divisionsvektoren (repræsenteret af n) af midtpunktet af de apikale stifter::EGFP halvmåne og basalbarken:
hvor Ax, Ay, og Az er koordinaterne for midtpunktet af stifterne::EGFP halvmåne, og Bx, By og Bz er koordinaterne for midtpunktet af basalbarken. - Bestem størrelsen af vektorerne m og n:
Størrelsesorden af m:
Størrelsesorden af n:
- Bestem prikproduktet (repræsenteret ved k) af m og n:
- Brug prikproduktet k og vektorstørrelserne m og n til at bestemme vinklen mellem vektorerne:
- Plot dataene i den valgte software. De data, der vises her, er udarbejdet i Microsoft Excel og visualiseret i PRISM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissektion og billeddannelse af central hjernelap NB'er, der udtrykker stifter::EGFP og kirsebær::Jupiter
For at fremvise denne protokol, larver, der udtrykker UAS-drevet kirsebær::Jupiter13 og endogent tagget Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-kirsebær::jupiter/CyO; Pins:: EGFP / TM6B, Tb) blev afbildet i 4 timer ved hjælp af den beskrevne protokol ved hjælp af multi-well imaging dias (figur 5C, D). Yderligere data blev taget fra larver, der udtrykker UAS-drevet kirsebær::Jupiter13 og endogent mærket Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-kirsebær::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), som blev afbildet i 10 timer ved hjælp af et membranbundet objektglas (figur 5E,F). Larverne blev opdrættet i bure som beskrevet i afsnit 1 i denne protokol. Efter at have nået 72-96 timer blev larverne dissekeret (figur 3), monteret (figur 4) og afbildet. Til de eksperimenter, der blev udført her, blev en 561 nm laser brugt ved 10% lasereffekt med 100 ms eksponeringstid, og en 488 nm laser blev brugt ved 15% lasereffekt med 100 ms eksponeringstid. Z-stakke (41 μm) blev erhvervet med en trinstørrelse på 1 μm. Billeder blev erhvervet hvert 5. minut på RT på et Intelligent Imaging Innovations (3i) roterende skivekonfokalsystem, bestående af en Yokogawa CSU-W1 roterende diskenhed og to Prime 95B Scientific CMOS-kameraer. Et 60x/1.4NA olienedsænkningsmål monteret på et Nikon Eclipse Ti-mikroskop blev brugt til billeddannelse. Live imaging voxels var 0,22 μm x 0,22 μm x 0,75 μm (60x/1,4NA roterende disk).
I overensstemmelse med tidligere rapporter16 dannede stifterne en udtalt apikal halvmåne ved opdeling af NB'er under mitose, og de mitotiske spindler justerede konsekvent til denne apikale halvmåne (figur 5C). Cellecykluslængden blev bestemt ved at måle tiden mellem successive metafaser af de enkelte NB'er (figur 5D,F).
I prøver, der blev afbildet på et multi-well billeddannende dias i 4 timer uden fedt kropstilskud, steg cellecykluslængden med stigende billeddannelsestid (figur 5C, D). Prøver, der blev afbildet i fedt kropssuppleret medium på et membranbundet dias, viste ikke en stigning i cellecykluslængden (figur 5E, F). Desuden blev NB'er med fire divisioner observeret på det 10 timers membranbundne objektglas (figur 5D vs. figur5F).
Endelig blev vinklen mellem divisionsaksen og den mitotiske spindel bestemt ved hjælp af GFP-mærkede stifter som reference (skematisk vist i figur 5G). Divisionsaksen blev bestemt ved at identificere midtpunktet af den apikale halvmåne dannet af stifterne i mitose og skære cellen i halvdelen (figur 5G, rød stiplet linje). Som tidligere beskrevet viste vildtype-NB'erne mitotiske spindler, der ikke var orienteret mere end 30° fra divisionsaksen (Loyer og Januschke36 og figur 5H).
Figur 1: Materialer. (A) Dissektionsmikroskop. B) Opsamlingsbur indeholdende fluer af den ønskede genotype og en måltidshætte med larver i vækst. (C) Dissektion og billeddannelsesmedium, 5 ml. (D) Måltidshætter med larver fra tre forskellige samlinger. (E,E') Mikrodissektionsværktøjer, fra venstre mod højre: mikrodissektion saks, tang. (F,F') Dissektion skål. G) Et 8-brøndet μ-objektglas til billeddannelse af prøverne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempel på måltidshætter. (A) To hætteglas med han- og hunfluer, der skal krydses, et tomt embryoopsamlingsbur og en frisk måltidshætte. B) Bunden af embryonopsamlingsburet med den nye måltidshætte (venstre) og toppen af buret med fluer (højre). C) Det fuldt monterede fluebur. (D) Et eksempel på en veliscenesat måltidshætte med larver til dissektion. Bemærk, at maden forstyrres af larverne, men ikke overforstyrres. (E,F) To eksempler på 4 dage gamle, overfyldte måltidshætter. Bemærk, at den mad nu har en suppelignende konsistens til det. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dissektion . (A) Rygbillede af en tredje stjernelarve. Den røde linje på larvens bageste ende angiver, hvor det første snit skal foretages. (B) Dorsal visning af larven efter fjernelse af den bageste ende. (C) Diagram, der viser, hvordan larven vendes om. Brug et sæt tang til at holde larven ved neglebåndet nær hvor det første snit blev lavet. Brug de andre tang til at trykke ind i den forreste ende af larven for at vende. De sorte pile angiver tangens retning, hvor den ene "skubber ind" larverne fra den forreste side og den anden bevæger den afskårne bageste ende mod den forreste ende. Den mindre røde pil betegner en tegneserie af fede kroppe. (D) Udsigt over en omvendt larve med fedtlegemer og fordøjelseskanalen stadig fastgjort. (E) Visning af en omvendt larve med ikke-CNS-væv fjernet. Den røde stiplede linje skitserer den stadig vedhæftede hjerne. (F) Skematisk, der viser, hvordan man fjerner hjernen fra neglebåndet. Den røde stiplede linje angiver stien til at skære med mikrodissektionssaks for at frigøre hjernen fra den omvendte neglebånd, og de sorte pile angiver fjernelse af hjernen fra neglebåndet. (G) Et billede af den omvendte hjerne, der stadig er fastgjort til neglebåndet ved et lille antal aksonale forbindelser under den ventrale nerveledning (VNC). (H) En isoleret larvehjerne. Hjernelapperne er skitseret med stiplede orange linjer. (I) Isolerede fedtlegemer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Montering og billeddannelse. (A) Visning af komponenterne til samling af et membranbundet metalobjektglas. B) Skematisk oversigt over komponenterne i det membranbundne objektglas og deres samling. (C) Set fra siden af membranen, der er indsat i metalobjektglasset, og som holdes på plads af den delte metalring. (D) Set ovenfra af det samlede billedglas uden dæksel. Dissektions- og billeddannelsesmediet indeholdende fedtlegemer og dissekerede hjerner er blevet placeret på membranen. (E) Zoomet ind af de fede kroppe og hjerner i dråben af medium. (F) Set ovenfra af metalobjektglasset efter montering af glasdækslet. (G) Set ovenfra af det samlede objektglas med glasdækslet fastgjort til objektglasset med smeltet vaselin. Dækning af kanterne af dæksedlen med vaselin forhindrer også fordampning af mediet. (H) Skematisk oversigt over det samlede membranglas med hjerner orienteret til observation på et omvendt mikroskop. De blå cirkler betegner NB'er i de centrale hjernelobes og VNC. (I) Visning af et tomt rutsjebane med flere brønde. (J) Zoomet billede af en brønd i multibrøndens billeddias. (K) Skematisk, der viser hjernens orientering til billeddannelse af de centrale hjernelapper på et omvendt mikroskop med et multi-brønd dias. De blå cirkler betegner NB'er i de centrale hjernelobes og VNC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kvantificering af cellecykluslængden . (A) Diagram over en tredje stjernelarvehjerne, der fremhæver hjernelapperne, synsloben (OL, mørkegrå), den ventrale nerveledning (VNC), NB'er (mørkeblå), GMC'er (lyseblå) og neuroner (lilla) i de centrale hjernelobes og VNC. (B) Skematisk oversigt over NB- og GMC-inddelinger. (C) Billedserier af en vildtype NB med mikrotubuli mærket med hvidt (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) og apikale stifter (Pins::EGFP i grønt) afbildet i et multibrøndsglas uden fedttilskud i 4 timer. Flettede billeder og det tilsvarende afstamningstræ med cellecyklustiming er vist nedenfor. Skalabjælke = 10 μm. (D) Kvantificering af cellecykluslængden (metafase - metafase) for første, anden og tredje division i prøver afbildet på et multibrøndsglas uden fedtlegemer. (E) Billedserie af en vildtype NB med mikrotubuli mærket med hvidt (MTs, UAS-Cherry::Jupiter) afbildet med et membranbundet dias med fedtkropstilskud i 10 timer med den tilsvarende afstamningstræ- og cellecyklustiming vist nedenfor. Skalabjælke = 10 μm. (F) Kvantificering af cellecykluslængde (metafase - metafase) for første, anden, tredje og fjerde division i prøver afbildet på et membranbundet dias med fedtlegemer. (G) Skematisk over, hvordan vinklen mellem spindelaksen (orange stiplet linje) og divisionsaksen (θ, rød stiplet linje) blev bestemt. (H) Kvantificering af θ fra 10 celler afbildet ved hjælp af et multibrøndsglas uden fedtlegemer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol skitserer en tilgang til billeddannelse af levende explant hjerner fra Drosophila melanogaster larver. Protokollen beskrevet her gør det muligt at observere explant-hjerner i 12-20 timer under de rigtige eksperimentelle betingelser. Der skal tages særligt hensyn til forberedelsen af prøver og udformningen af de ønskede forsøg. Som nævnt ovenfor er en af de mest kritiske faktorer, der bestemmer kvaliteten af det dissekerede væv, larvernes sundhed. For at opnå den højest mulige kvalitet skal man sikre, at larverne fodres godt inden indsamling. Usunde larver stammer oftest fra overbelægning. For at løse dette skal man sikre, at overbelægning minimeres, enten ved at øge høstfrekvensen eller ved at opdele retter med frisklagte æg med en tom skål.
Et andet kritisk element i denne protokol er dissektionsmetoden for at isolere hjernevævet. Hjernen og NB'erne i dem er ekstremt følsomme over for eksterne faktorer, såsom dissektionsmediets temperatur og selve dissektionens invasivitet. Medium, der er for koldt, vil have tendens til at depolymerisere mikrotubuli. På samme måde vil en dissektion, der strækker eller brister hjernen, have skadelige virkninger på kvaliteten af NB'erne. For at forhindre dette bør man undgå at trække direkte i hjernevævet og i stedet forankre dissektionsværktøjerne på neglebåndet eller andet væv. Mikrodissektion saks hjælper meget i denne henseende, da de minimalt trækker på hjernevævet. Hvis saks ikke er tilgængelig, kan pincet bruges til forsigtigt at fjerne forbindelsesvævet mellem den ventrale nerveledning og neglebåndet.
Denne protokol præsenterer to metoder til at montere larvehjerner til konfokal mikroskopi. Fra et teknisk synspunkt er montering af prøver i et multibrøndsglas enklere end montering på et membranbundet dias. Hver metode er dog bedst egnet til forskellige typer eksperimenter. De data, der vises her, viser, at for kortere film (dvs. mindre end 4 timer) eller film med høj tidsmæssig opløsning (dvs. erhvervelse af en z-stak hver 10. s), er billeddannelse i et multibrøndsglas tilstrækkeligt til at observere flere divisioner i larvens centrale hjerne. For længere anskaffelsesvinduer er montering på et membranbundet dias ideelt, da prøver, der er forberedt på denne måde, deler sig oftere i løbet af filmen. Normalt deler vildtype larve NB'er sig en gang hver 40-90 min13. Selvom multibrøndsdias kan bruges til lange (> 4 timer) film, er der observeret en stigning i cellecykluslængden og et fald i prolifererende NB'er i denne tilstand (figur 5D). Derfor skal den metode, der anvendes til at montere prøver, og den type data, der skal måles, tages i betragtning ved udformningen af forsøg.
Denne protokol anbefaler billeddannelse af flere hjerner i en brønd eller dias, da dette øger effektiviteten af dataindsamling til et givet eksperiment. Imidlertid vil orienteringen og placeringen af hjernen i brønden påvirke, hvor meget forskydning der sker i løbet af filmen på grund af scenen, der bevæger sig mellem hjernepositioner. Klynge af hjernerne sammen på et centralt sted i en brønd minimerer dette problem. Der kan dog forekomme nogle skift i løbet af længere film i eksperimenter ved hjælp af multi-well dias. I mange tilfælde er forskydningen observeret i disse længere film minimal og kan korrigeres under analysen. Hjernebevægelse kan også forebygges ved hjælp af en metalglideopsætning, fordi kapillærkræfterne forhindrer de dissekerede hjerner i at skifte.
Med et multi-well dias er det teknisk muligt at udføre multi-well imaging eksperimenter. Dette kræver dog justeringer i stakstørrelsen og den tidsmæssige opløsning for at tage højde for den ekstra tid, mikroskopet bruger på at flytte mellem positioner. Dette kan være gavnligt for store genetiske screeningsforsøg, hvor man kan afbilde flere genotyper i forskellige brønde.
Der er tilfælde, hvor hjerner vil vise ringe eller ingen opdeling NB'er i løbet af et eksperiment. Dette skyldes sandsynligvis flere faktorer, der afhænger af arten af prøven, der afbildes, kvaliteten af den mad, der bruges til at opdrætte larverne, kvaliteten af dissektionen og de erhvervelsesindstillinger, der bruges til at generere dataene. Selvom det er tilrådeligt at fjerne så meget væv som muligt, når man forbereder larvehjerner til billeddannelse, anbefales det ikke at beskære hjernen for meget for at minimere mekanisk belastning, da dette kan påvirke kvaliteten af dataene negativt. Derudover vil hyppig eksponering for kraftige billeddannende lasere påvirke neuroblastsundheden negativt. Således bør man overveje at justere lasereffekt, eksponeringstid og billedfrekvens, når man indsamler billeddata.
Til montering af prøver kan der anvendes alternative metoder. For eksempel kan explant hjerner monteres i en solid matrix37. Tilgængeligheden af forskellige monteringsprotokoller giver mulighed for at afbilde larvehjerneeksplanter på en lang række mikroskoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen finansielle oplysninger at erklære.
Acknowledgments
Denne forskning støttes af R35GM148160 (CC) og et National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (RCS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C.
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
