Summary
यहां, हम शारीरिक परिस्थितियों के तहत सेलुलर और उपकोशिकीय गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर थर्ड इनस्टार लार्वा से जीवित खोज दिमाग तैयार करने, विच्छेदन, माउंट करने और छवि बनाने के लिए एक वर्कफ़्लो पर चर्चा करते हैं।
Abstract
ड्रोसोफिला न्यूरल स्टेम सेल (न्यूरोब्लास्ट्स, इसके बाद एनबी) असममित विभाजन से गुजरते हैं, आत्म-नवीनीकृत न्यूरोब्लास्ट को पुनर्जीवित करते हैं, जबकि एक विभेदक गैंग्लियन मदर सेल (जीएमसी) भी बनाते हैं, जो दो न्यूरॉन्स या ग्लिया को जन्म देने के लिए एक अतिरिक्त विभाजन से गुजरेंगे। एनबी में अध्ययन ने सेल ध्रुवीयता, स्पिंडल अभिविन्यास, तंत्रिका स्टेम सेल आत्म-नवीकरण और भेदभाव के अंतर्निहित आणविक तंत्र को उजागर किया है। ये असममित कोशिका विभाजन लाइव-सेल इमेजिंग के माध्यम से आसानी से देखने योग्य होते हैं, जिससे लार्वा एनबी जीवित ऊतक में असममित कोशिका विभाजन की स्थानिक गतिशीलता की जांच के लिए आदर्श रूप से अनुकूल होते हैं। जब पोषक तत्वों के पूरक माध्यम में ठीक से विच्छेदित और चित्रित किया जाता है, तो खोज दिमाग में एनबी 12-20 घंटे के लिए मजबूत रूप से विभाजित होते हैं। पहले वर्णित विधियां तकनीकी रूप से कठिन हैं और क्षेत्र में नए लोगों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती हैं। यहां, वसा शरीर की खुराक का उपयोग करके लाइव थर्ड-इनस्टार लार्वा मस्तिष्क खोजों की तैयारी, विच्छेदन, माउंटिंग और इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। संभावित समस्याओं पर भी चर्चा की जाती है, और उदाहरण प्रदान किए जाते हैं कि इस तकनीक का उपयोग कैसे किया जा सकता है।
Introduction
असममित कोशिका विभाजन (एसीडी) वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा आरएनए, प्रोटीन और ऑर्गेनेल जैसे उपकोशिकीय घटकों को बेटी कोशिकाओं 1,2 के बीच असमान रूप से विभाजित किया जाता है। यह प्रक्रिया आमतौर पर स्टेम कोशिकाओं में देखी जाती है, जो विभिन्न विकास ता्मक भाग्य के साथ बेटी कोशिकाओं को जन्म देने के लिए एसीडी से गुजरती हैं। ड्रोसोफिला एनबी एक एनबी का उत्पादन करने के लिए असममित रूप से विभाजित होते हैं, जो इसकी स्टेमनेस को बरकरार रखता है, और एक गैंग्लियन मदर सेल (जीएमसी)। जीएमसी न्यूरॉन्स या ग्लिया3 को अलग करने के लिए आगे के विभाजन से गुजरता है। तीसरे-इनस्टार लार्वा के विकासशील दिमाग में असममित रूप से विभाजित एनबी प्रचुर मात्रा में होते हैं, जिन्हें माइक्रोस्कोपी के माध्यम से आसानी से देखा जाता है। तीसरे इनस्टार लार्वा चरण में, प्रत्येक केंद्रीय मस्तिष्क लोब 3,4,5,6 में लगभग 100 एनबी मौजूद होते हैं।
असममित कोशिका विभाजन एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है। लाइव-सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग सेल ध्रुवीयता 7,8,9,10, स्पिंडल अभिविन्यास 11,12,13, एक्टोमायोसिन कॉर्टेक्स की गतिशीलता 14,15,16,17,18, सूक्ष्मनलिका और सेंट्रोसोम जीव विज्ञान 19,20 की गतिशीलता को मापने और मापने के लिए किया गया है।, 21,22,23,24,25,26,27, और झिल्ली 10,28 और क्रोमैटिन गतिशीलता 29। एसीडी के गुणात्मक और मात्रात्मक विवरण बरकरार जीवित दिमागों में एनबी को विभाजित करने के लिए मजबूत तरीकों और प्रोटोकॉल पर भरोसा करते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल दो अलग-अलग माउंटिंग दृष्टिकोणों का उपयोग करके विवो में लाइव-सेल इमेजिंग के लिए तीसरे इनस्टार लार्वा दिमाग को तैयार करने, विच्छेदन और छवि बनाने के तरीकों को रेखांकित करता है। ये विधियां स्टेम सेल डिवीजनों की स्थानिक गतिशीलता में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के साथ-साथ अन्य मस्तिष्क कोशिकाओं में विभाजन के लिए सबसे उपयुक्त हैं, क्योंकि वे सेलुलर घटनाओं के लघु और दीर्घकालिक अवलोकनों की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, ये तकनीकें क्षेत्र में नवागंतुकों के लिए आसानी से सुलभ हैं। हम फ्लोरोसेंटली टैग किए गए सूक्ष्मनलिका और कॉर्टिकल संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने वाले लार्वा दिमाग के साथ इस दृष्टिकोण की प्रभावशीलता और अनुकूलनशीलता का प्रदर्शन करते हैं। हम अन्य अध्ययनों में आवेदन के लिए विश्लेषण और विचारों के तरीकों पर भी चर्चा करते हैं।
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Protocol
नोट: चित्रा 1 इस अध्ययन को करने के लिए आवश्यक सामग्री दिखाता है।
1. प्रयोग के लिए विचार और तैयारी
- लार्वा को भीड़भाड़ से रोकें।
नोट: खोज लार्वा दिमाग की गुणवत्ता सीधे विच्छेदन से पहले लार्वा के स्वास्थ्य और गुणवत्ता से संबंधित है। लार्वा जो भीड़भाड़ से कुपोषित होते हैं, वे आम तौर पर कम गुणवत्ता वाले दिमाग पैदाकरेंगे।- सुनिश्चित करें कि कुपोषण से बचने के लिए प्रति भोजन कैप डिश में 20-30 से अधिक लार्वा मौजूद न हों। इनके उदाहरण चित्र 2 में देखे जा सकते हैं।
- उपयोग करने से पहले श्नाइडर के माध्यम को फ़िल्टर और एलिकोट करें।
- प्रत्येक विच्छेदन के लिए, 1% गोजातीय विकास सीरम (बीजीएस) के साथ श्नाइडर के कीट माध्यम को पूरक करके ताजा इमेजिंग और विच्छेदन माध्यम तैयार करें। विच्छेदन और इमेजिंग माध्यम की 5 एमएल की मात्रा आमतौर पर एक इमेजिंग प्रयोग के लिए पर्याप्त होती है।
- उपयोग करने से पहले पूरक माध्यम को कमरे के तापमान (आरटी) पर गर्म करें।
- एकत्र की जाने वाली फिल्म की लंबाई पर विचार करें, और इमेजिंग माध्यम के पूरक, बढ़ते दृष्टिकोण और माइक्रोस्कोप की अधिग्रहण सेटिंग्स को कारक बनाने के लिए इसका उपयोग करें।
नोट: इष्टतम परिस्थितियों में, केवल बीजीएस के साथ पूरक दिमाग में एनबी 3 घंटे से ऊपर की ओर मजबूती से विभाजित होंगे।- लंबी फिल्मों की आवश्यकता वाले प्रयोगों का संचालन करते समय 4 घंटे से अधिक समय तक विभाजन का समर्थन करने के लिए इमेजिंग माध्यम में लार्वा वसा शरीर के ऊतकों को जोड़कर इमेजिंग माध्यम को पूरक करें।
नोट: वसा शरीर माइटोजन का स्राव करते हैं जो एनबी प्रसार31 का समर्थन करते हैं, और 10 लार्वा से पूरे वसा शरीर चार से पांच दिमागों का समर्थन करने के लिए पर्याप्त हैं। इसके अलावा, झिल्ली-बाध्य स्लाइड के साथ चित्रित किए गए नमूनों को 10 घंटे13,32 से अधिक के लिए विभाजित दिखाया गया है, जबकि मल्टी-वेल स्लाइड के साथ चित्रित नमूने आमतौर पर कम बार विभाजित होते हैं (अप्रकाशित अवलोकन)। - वैकल्पिक रूप से, लंबी फिल्मों के लिए एक अधिक जटिल इमेजिंग माध्यम लागू करें, जैसा कि पहलेवर्णित है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए एक्सपोजर समय, लेजर पावर और नमूना आवृत्ति को समायोजित करके फोटोडैमेज को कम करें।
- लंबी फिल्मों की आवश्यकता वाले प्रयोगों का संचालन करते समय 4 घंटे से अधिक समय तक विभाजन का समर्थन करने के लिए इमेजिंग माध्यम में लार्वा वसा शरीर के ऊतकों को जोड़कर इमेजिंग माध्यम को पूरक करें।
2. लार्वा मंचन और संग्रह (चित्रा 2)।
- वांछित जीनोटाइप के साथ संतान पैदा करने के लिए 1-5 दिन की मादा कुंवारी मक्खियों को 1-7 दिन के वयस्क नर मक्खियों के साथ पार करें। इष्टतम उपज के लिए, 5-10 पुरुषों के साथ 10-15 महिला कुंवारियों को पार करें। इन मक्खियों को भोजन टोपी (चित्रा 2 ए-सी) के साथ एक मक्खी पिंजरे में जमा करें, और 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- रोजाना खाने की टोपी को स्वैप करें। यह भोजन की टोपी को लार्वा के साथ भीड़भाड़ होने से रोकता है, जो विच्छेदित दिमाग की गुणवत्ता को कम करता है।
- यदि भोजन की टोपी लार्वा में काफी ढकी हुई है (यानी, >30), तो इस भोजन कैप को आधे में विभाजित करें, और एक आधे को ताजा भोजन टोपी के साथ बदलें जिसे आधे में भी काटा गया है। वैकल्पिक रूप से, भोजन की सीमाओं को अधिक लगातार आधार पर स्वैप करें (यानी, हर 24 घंटे के बजाय हर 12 घंटे)। अधिक आबादी वाले भोजन कैप के उदाहरण चित्रा 2 ई, एफ में देखे जा सकते हैं।
- लार्वा को 25 डिग्री सेल्सियस पर लार्वा के साथ भोजन की टोपी को तब तक सेएं जब तक कि लार्वा वांछित आयु तक न पहुंच जाए।
3. लार्वा वसा शरीर विच्छेदन (चित्रा 3)।
नोट: यह प्रोटोकॉल 3-वेल विच्छेदन डिश का उपयोग करके विच्छेदन का वर्णन करता है।
- पिपेट ~ 400 μL विच्छेदन और इमेजिंग माध्यम एक 3-अच्छी तरह से विच्छेदन डिश के प्रत्येक कुएं में।
- 10 72-96 घंटे पुराने जंगली प्रकार के लार्वा को धीरे-धीरे विच्छेदन बल के साथ पकड़कर धोएं और उन्हें सबसे नीचे के कुएं में विच्छेदन घोल में डुबोएं जब तक कि सभी खाद्य कण बह न जाएं। कुल्ला करने के बाद, साफ लार्वा को बीच के कुएं में ले जाएं।
- चिमटी के एक सेट का उपयोग करके, लार्वा को मुंह के हुक से पकड़ें। चिमटी के दूसरे सेट के साथ, लार्वा के छल्ली के एक तरफ टूट जाएं।
- इस टूटने से वसा शरीर लार्वा से बाहर फैल जाएगा। वसा शरीर ऑफ-व्हाइट और अर्ध-पारभासी होते हैं और इसमें जाली जैसी संरचना होती है (चित्रा 3 आई)। वसा शरीर भी खुद से और विच्छेदन चिमटी से चिपके रहेंगे। एक बार पहचाने जाने के बाद, प्रत्येक लार्वा से जितना संभव हो उतना वसा शरीर एकत्र करें, और इसे आरटी विच्छेदन माध्यम के 400 μL के साथ सबसे ऊपर के कुएं में स्थानांतरित करें।
4. लार्वा मस्तिष्क विच्छेदन (चित्रा 3)।
- प्रयोगात्मक लार्वा को खाद्य अवशेषों से मुक्त करने के लिए ऊपर के रूप में विच्छेदन और इमेजिंग माध्यम में धोएं। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, विच्छेदन समाधान में अविच्छेदित लार्वा को संग्रहीत करने से बचें। इससे लार्वा "डूब" जाएगा और विच्छेदित दिमाग की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ेगा।
- चिमटी के एक सेट का उपयोग करके, लार्वा को मुंह के हुक से पकड़ें। चिमटी के एक अन्य सेट का उपयोग करके, पीछे की तरफ से लार्वा के लगभग 1/3 हिस्से को धीरे से काट लें / चीर लें (चित्रा 3 ए)। यह पाचन तंत्र, वसा निकायों, संयोजी ऊतक और तंत्रिका तंत्र के तत्वों को लार्वा के टूटे हुए पक्ष से "फटने" का कारण बनेगा (चित्रा 3 बी)।
- चिमटी के एक सेट का उपयोग करके, लार्वा को मुंह के हुक से पकड़ें। चिमटी के दूसरे सेट के साथ, मुंह के हुक की ओर छल्ली को धीरे से ब्रश करें, जबकि मुंह के हुक को पकड़ने वाले चिमटी के साथ अंदर की ओर "धक्का" दें जब तक कि पूरा लार्वा अंदर न हो जाए। यह गति एक सोक को "अंदर से बाहर" मोड़ने के समान है (चित्रा 3 सी, डी)।
- लार्वा को उल्टा करें ताकि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और अन्य ऊतक छल्ली से जुड़े होने के दौरान बाहर की ओर हों। इस चरण में, आकस्मिक निष्कासन से बचने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का पता लगाएं। चिमटी का उपयोग करके, धीरे-धीरे सभी गैर-सीएनएस ऊतक को हटा दें, केवल सीएनएस और मस्तिष्क को छल्ली से जुड़ा छोड़ दें (चित्रा 3 ई)।
- मस्तिष्क अक्षीय कनेक्शन के माध्यम से छल्ली से जुड़ा होगा। माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके, मस्तिष्क को छल्ली से मुक्त करने के लिए इन अक्षीय कनेक्शनों को काट दें। ऐसा करने के लिए, पहले धीरे से मस्तिष्क लोब (चित्रा 3 एफ) के नीचे काट लें। वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड के नीचे कनेक्शन के साथ दोहराएं।
नोट: यह कदम चिमटी के साथ किया जा सकता है यदि माइक्रोडिसेक्शन कैंची उपलब्ध नहीं है। यह सुनिश्चित करने के लिए चिमटी का उपयोग करते समय विशेष ध्यान रखें कि छल्ली से हटाने के दौरान मस्तिष्क के ऊतक अधिक खिंचाव वाले नहीं हैं क्योंकि यांत्रिक तनाव मस्तिष्क के स्वास्थ्य को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा। - विच्छेदित मस्तिष्क को विच्छेदन और इमेजिंग माध्यम के साथ एक कुएं में स्थानांतरित करें। 3 घंटे से अधिक समय तक इमेजिंग प्रयोगों के लिए, ऊपर वर्णित वसा निकायों के साथ पूरक विच्छेदन और इमेजिंग माध्यम का उपयोग करें। विच्छेदन समय 20 मिनट से कम रखने के लिए लार्वा को बैचों में विच्छेदित करें।
5. माउंटिंग और इमेजिंग (चित्रा 4)।
- झिल्ली-बाध्य स्लाइड के साथ इमेजिंग के लिए34:
- विच्छेदन पकवान के अंतिम कुएं में विच्छेदित दिमाग और पृथक वसा शरीर दोनों को इकट्ठा करें।
- स्लाइड के पीछे एक गैस-पारगम्य झिल्ली रखकर स्लाइड के आधे हिस्से को इकट्ठा करें, और विभाजित रिंग को केंद्र में दबाएं, इसे जगह में रखें (चित्रा 4 ए-सी)।
- 200 μL माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, झिल्ली में ~ 130-140 μL विच्छेदन और इमेजिंग माध्यम में 10 विच्छेदित दिमाग और जितना संभव हो उतना वसा शरीर (ऊपर देखें) स्थानांतरित करें। गैस-पारगम्य झिल्ली (चित्रा 4 डी, ई) के केंद्र में नमूने के साथ माध्यम जमा करना सुनिश्चित करें।
- एनबी की आबादी के लिए दिमाग को चित्रित करने और माइक्रोस्कोप के प्रकार के लिए उपयोग किया जा रहा है (चित्रा 4 ई)। नमूने को यथासंभव माइक्रोस्कोप के उद्देश्य के करीब रखें। उदाहरण के लिए, केंद्रीय मस्तिष्क लोब में एनबी की छवि बनाने के लिए, दिमाग को इस तरह से उन्मुख करें कि मस्तिष्क लोब उद्देश्य के सबसे करीब हैं (चित्रा 4 एच)।
- एक बार जब दिमाग उन्मुख हो जाता है, तो धीरे से झिल्ली पर समाधान के शीर्ष पर एक ग्लास कवरस्लिप रखें। यह मस्तिष्क और वसा निकायों वाले समाधान को झिल्ली की संपूर्णता में फैलाने का कारण होगा (चित्रा 4 एफ)।
- कवरस्लिप किनारे के करीब एक प्रयोगशाला ऊतक को पकड़कर अत्यधिक घोल को धब्बा दें। समाधान की इष्टतम मात्रा तब प्राप्त होती है जब दिमाग स्क्वैश किए बिना कवरस्लिप को छूता है। यदि इस चरण में पुन: अभिविन्यास की आवश्यकता होती है, तो दिमाग को स्थानांतरित करने के लिए कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
- पेंटब्रश के साथ कवरस्लिप के किनारों के साथ पिघली हुई पेट्रोलियम जेली लगाकर कवरस्लिप को स्थिर करें। जेली को जमने दें (चित्रा 4 जी)।
- मल्टी-वेल इमेजिंग स्लाइड के साथ इमेजिंग के लिए (चित्रा 4):
- मल्टी-वेल स्लाइड के एक कुएं में इमेजिंग माध्यम के 400 μL जोड़ें (यहां किए गए प्रयोग में, एक चैंबर 8-वेल माइक्रो[μ]-स्लाइड का उपयोग किया गया था; चित्रा 4आई)। पहले से विच्छेदित वसा निकायों को इस कुएं में स्थानांतरित करें (चरण 3.4 देखें)।
- कुएं के केंद्र के पास एक क्लस्टर में 10 दिमाग तक जमा करें (चित्रा 4 जे)।
- एनबी की आबादी के लिए दिमाग को चित्रित करने और माइक्रोस्कोप के प्रकार के लिए उपयोग किया जा रहा है, जैसा कि चरण 5.1.4 (चित्रा 4 के) में वर्णित है। नमूने व्यवस्थित करें ताकि वे एक दूसरे के करीब हों। यह नमूने के बीच चरण को स्थानांतरित करने की दूरी को कम करेगा, जो अधिग्रहण के दौरान नमूना बहाव को कम करता है।
- एक बार जब दिमाग कुएं में उन्मुख हो जाता है, तो दिमाग को 2-5 मिनट के लिए बसने की अनुमति दें। यह परिवहन / इमेजिंग के दौरान उनकी स्थिरता को बढ़ाता है। इस समय के दौरान अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप तैयार करें।
- स्लाइड कवर के साथ μ-स्लाइड को कवर करें, और इसे माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करें। फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए सबसे कम लेजर पावर और एक्सपोज़र समय के साथ अधिग्रहण शुरू करें।
6. डेटा प्रोसेसिंग और प्रबंधन सर्वोत्तम प्रथाएं
- उपलब्ध विश्लेषण सॉफ्टवेयर के अनुसार आवश्यकतानुसार डेटा को संसाधित करें।
- यहाँ दिखाए गए उदाहरण के लिए, अधिग्रहीत डेटा को स्लाइडबुक सॉफ़्टवेयर के साथ स्लाइडबुक छवि फ़ाइल (.sld) के रूप में सहेजें.
- Imaris फ़ाइल कनवर्टर का उपयोग करके Imaris के मालिकाना फ़ाइल प्रकार (.ims) में कनवर्ट करने के लिए, एक अलग विंडो में Imaरिस फ़ाइल कनवर्टर खोलें। क्लिक करें और .sld फ़ाइलों को Imaris फ़ाइल कनवर्टर के "इनपुट" अनुभाग में खींचें।
- कनवर्ट की गई फ़ाइलों के लिए वांछित आउटपुट स्थान निर्धारित करें, और "सभी प्रारंभ करें" पर क्लिक करें।
- रूपांतरण के बाद, Imaरिस सॉफ़्टवेयर में डेटा देखें और एनोटेट करें.
नोट: छवि विश्लेषण के लिए विकल्प का उपयोग इमारिस के स्थान पर किया जा सकता है, जैसे कि फिजी (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), आइविया (https://www.aivia-software.com/), वोलोसिटी (https://www.volocity4d.com/), या अन्य।
- उचित रिकॉर्ड-रखरखाव के लिए जितना संभव हो उतना मूल डेटा बनाए रखें। उदाहरण के लिए, यदि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर एक फ़ाइल स्वरूप में सहेजा गया है, लेकिन विश्लेषण के लिए एक अलग स्वरूप में परिवर्तित हो गया है, तो डेटा के अधिग्रहित संस्करण को बनाए रखें।
- डेटा विश्लेषण के लिए, नमूना और अधिग्रहण सेटिंग्स के बारे में जितना संभव हो उतने विवरणों का रिकॉर्ड बनाए रखें। बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी में विच्छेदित लार्वा का जीनोटाइप, विच्छेदन से पहले लार्वा की उम्र, भोजन टोपी की स्थिति जिसमें उन्हें पाला गया था, इमेजिंग के दौरान उपयोग की जाने वाली लेजर शक्ति, एक्सपोजर समय, अधिग्रहण की लंबाई और अस्थायी संकल्प शामिल हैं।
7. सेल चक्र की लंबाई का उदाहरण परिमाणीकरण (चित्रा 5)।
नोट: इस उदाहरण में, ध्रुवीयता मार्कर पिन (पिन:: ईजीएफपी16) और सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन बृहस्पति25 (चेरी:: बृहस्पति13) को व्यक्त करने वाले लार्वा को चित्रित किया गया था। बाद का विश्लेषण इमरिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था।
- पसंद के छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फिल्म खोलें। विभाजित एनबी की पहचान करने के लिए फिल्म की लंबाई के माध्यम से स्क्रॉल करें, और उन्हें भविष्य के संदर्भ के लिए लेबल करें। विभाजित एनबी को उनके विशिष्ट माइटोटिक स्पिंडल (चित्रा 5 सी-ई) द्वारा पहचानें।
- सेल चक्र की लंबाई निर्धारित करने के लिए एक संदर्भ सेल चक्र चरण की पहचान करें। इस उदाहरण में, मेटाफ़ेज़ का उपयोग संदर्भ के रूप में किया जाता है।
- मैन्युअल रूप से क्रमिक मेटाफ़ेज़ के बीच फ़्रेम की संख्या निर्धारित करें, और एक सेल चक्र को पूरा करने में लगने वाले समय को निर्धारित करने के लिए इसे मिनटों या घंटों में परिवर्तित करें।
- फिल्म का अस्थायी रिज़ॉल्यूशन लेकर और इसे मेटाफ़ेज़ के बीच फ्रेम की संख्या से गुणा करके ऐसा करें। उदाहरण के लिए, यदि फिल्म का अस्थायी रिज़ॉल्यूशन हर 5 मिनट में एक फ्रेम है, और फ्रेम 13 और फ्रेम 35 में मेटाफ़ेज़ देखे जाते हैं, तो इन मेटाफ़ेज़ के बीच का समय 110 मिनट ([35 − 13] × 5) होगा।
- किसी भी उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ डेटा प्लॉट करें। यहां दिखाए गए डेटा को प्रिज्म सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्लॉट किया गया था।
8. सेल स्पिंडल संरेखण का उदाहरण परिमाणीकरण (चित्रा 5)।
नोट: इस उदाहरण में, विश्लेषण इमारिस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के किया जाता है।
- इमरिस या पसंद के किसी अन्य सॉफ़्टवेयर में चलचित्र फ़ाइल खोलें। विभाजित एनबी की पहचान करने के लिए फिल्म की लंबाई के माध्यम से स्क्रॉल करें, और उन्हें भविष्य के संदर्भ के लिए लेबल करें।
- एपिकल और बेसल सेंट्रोसोम ( एम द्वारा दर्शाया गया) का उपयोग करके स्पिंडल ध्रुवों द्वारा गठित वेक्टर का निर्धारण करें:
जहां एक्स, ए, और एजेड एपिकल सेंट्रोसोम के निर्देशांक हैं, और बीएक्स, बाय और बीजेड बेसल सेंट्रोसोम के निर्देशांक हैं। इसी तरह, डिवीजन वेक्टर (एन द्वारा दर्शाया गया) की धुरी एपिकल पिन के मध्य बिंदु से बनती है:: ईजीएफपी अर्धचंद्र और बेसल कॉर्टेक्स:
जहां एक्स, ए, और एजेड पिंस के मध्य बिंदु के निर्देशांक हैं:: ईजीएफपी अर्धचंद्र, और बीएक्स, बाय और बीजेड बेसल कॉर्टेक्स के मध्य बिंदु के निर्देशांक हैं। - वैक्टर m और n का परिमाण ज्ञात कीजिये:
m का परिमाण:
n का परिमाण:
- m और n का डॉट उत्पाद (k द्वारा दर्शाया गया) ज्ञात कीजिये:
- डॉट उत्पाद k और वेक्टर परिमाण m और n का उपयोग करके, वैक्टर के बीच का कोण निर्धारित करें:
- पसंद के सॉफ्टवेयर में डेटा प्लॉट करें। यहां दिखाए गए डेटा को माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल में तैयार किया गया था और प्रिज्म में विज़ुअलाइज़ किया गया था।
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Representative Results
पिंस व्यक्त करने वाले केंद्रीय मस्तिष्क लोब एनबी का विच्छेदन और इमेजिंग:: ईजीएफपी और चेरी:: बृहस्पति
इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए, यूएएस-संचालित चेरी को व्यक्त करने वाले लार्वा:: बृहस्पति13 और अंतर्जात रूप से टैग किए गए पिन:: ईजीएफपी16 (डब्ल्यू; वोरगल 4, यूएएस-चेरी:: बृहस्पति / पिन:: ईजीएफपी / टीएम 6 बी, टीबी) को मल्टी-वेल इमेजिंग स्लाइड (चित्रा 5 सी, डी) का उपयोग करके वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके 4 घंटे के लिए चित्रित किया गया था। यूएएस-संचालित चेरी को व्यक्त करने वाले लार्वा से अतिरिक्त डेटा लिया गया था:: बृहस्पति13 और अंतर्जात रूप से टैग किए गए मिरांडा:: ईजीएफपी (डब्ल्यू; वोरगल 4, यूएएस-चेरी:: ज़ीउस / यूएएस-मिरांडा:: जीएफपी / टीएम 6 बी), जिन्हें झिल्ली-बाध्य स्लाइड (चित्रा 5 ई, एफ) का उपयोग करके 10 घंटे के लिए चित्रित किया गया था। लार्वा को पिंजरों में पाला गया था जैसा कि इस प्रोटोकॉल के खंड 1 में वर्णित है। 72-96 घंटे की उम्र तक पहुंचने पर, लार्वा को विच्छेदित किया गया (चित्रा 3), लगाया गया (चित्रा 4), और चित्रित किया गया। यहां किए गए प्रयोगों के लिए, 100 एमएस एक्सपोजर समय के साथ 10% लेजर पावर पर 561 एनएम लेजर का उपयोग किया गया था, और 100 एमएस एक्सपोजर समय के साथ 15% लेजर पावर पर 488 एनएम लेजर का उपयोग किया गया था। जेड-स्टैक्स (41 μm) को 1 μm चरण आकार के साथ अधिग्रहित किया गया था। एक इंटेलिजेंट इमेजिंग इनोवेशन (3आई) स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल सिस्टम पर आरटी में हर 5 मिनट में छवियां प्राप्त की गईं, जिसमें एक योकोगावा सीएसयू-डब्ल्यू 1 स्पिनिंग डिस्क यूनिट और दो प्राइम 95 बी वैज्ञानिक सीएमओएस कैमरे शामिल थे। इमेजिंग के लिए एक निकोन एक्लिप्स टीआई माइक्रोस्कोप पर लगाए गए 60x/1.4NA तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया गया था। लाइव इमेजिंग वोक्सेल 0.22 μm x 0.22 μm x 0.75 μm (60x/1.4NA स्पिनिंग डिस्क) थे।
पिछली रिपोर्ट16 के अनुरूप, पिंस ने माइटोसिस के दौरान एनबी को विभाजित करने में एक स्पष्ट एपिकल अर्धचंद्र का गठन किया, और माइटोटिक स्पिंडल लगातार इस एपिकल अर्धचंद्र (चित्रा 5 सी) के साथ संरेखित हुए। सेल चक्र की लंबाई अलग-अलग एनबी (चित्रा 5 डी, एफ) के क्रमिक मेटाफेज के बीच के समय को मापकर निर्धारित की गई थी।
उन नमूनों में जिन्हें वसा शरीर के पूरक के बिना 4 घंटे के लिए एक बहु-अच्छी इमेजिंग स्लाइड पर चित्रित किया गया था, सेल चक्र की लंबाई बढ़ती इमेजिंग समय (चित्रा 5 सी, डी) के साथ बढ़ गई। जिन नमूनों को झिल्ली-बाध्य स्लाइड पर वसा शरीर-पूरक माध्यम में चित्रित किया गया था, उनमें कोशिका चक्र की लंबाई में वृद्धि नहीं दिखाई दी (चित्रा 5 ई, एफ)। इसके अलावा, चार डिवीजनों वाले एनबी को 10 एच झिल्ली-बाध्य स्लाइड (चित्रा 5 डी बनाम चित्रा 5 एफ) पर देखा गया था।
अंत में, विभाजन अक्ष और माइटोटिक स्पिंडल के बीच का कोण जीएफपी-टैग किए गए पिन का उपयोग करके एक संदर्भ के रूप में निर्धारित किया गया था ( चित्रा 5 जी में दिखाया गया योजनाबद्ध)। विभाजन अक्ष को माइटोसिस में पिन द्वारा गठित एपिकल अर्धचंद्र के मध्य बिंदु की पहचान करके और कोशिका को आधे में विभाजित करके निर्धारित किया गया था (चित्रा 5 जी, लाल डैश्ड लाइन)। जैसा कि पहले वर्णित किया गया है, जंगली प्रकार के एनबी ने माइटोटिक स्पिंडल प्रदर्शित किए जो विभाजन अक्ष से 30 डिग्री से अधिक उन्मुख नहीं थे (लोयर और जानुशके36 और चित्रा 5 एच)।
चित्र 1: सामग्री । (ए) विच्छेदन माइक्रोस्कोप। (बी) वांछित जीनोटाइप की मक्खियों वाले संग्रह पिंजरे और बढ़ते लार्वा के साथ एक भोजन टोपी। (सी) विच्छेदन और इमेजिंग माध्यम, 5 एमएल। (डी) तीन अलग-अलग संग्रहों से लार्वा के साथ भोजन कैप। (E, E') माइक्रोडिसेक्शन उपकरण, बाएं से दाएं: माइक्रोडिसेक्शन कैंची, फोर्स। (F, F') विच्छेदन पकवान। (छ) नमूनों की इमेजिंग के लिए एक 8-अच्छी μ-स्लाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
(ए) नर और मादा मक्खियों के साथ दो शीशियां, एक खाली भ्रूण संग्रह पिंजरा, और एक ताजा भोजन टोपी। (बी) नई भोजन टोपी (बाएं) के साथ भ्रूण संग्रह पिंजरे का निचला हिस्सा और मक्खियों के साथ पिंजरे का शीर्ष (दाएं)। (सी) पूरी तरह से इकट्ठे फ्लाई पिंजरे। (डी) विच्छेदन के लिए लार्वा के साथ एक अच्छी तरह से मंचित भोजन टोपी का एक उदाहरण। ध्यान दें कि भोजन लार्वा से परेशान है, लेकिन अति-परेशान नहीं है। (E, F) 4 दिन पुराने, भीड़भाड़ वाले भोजन कैप के दो उदाहरण। ध्यान दें कि उस भोजन में अब सूप जैसी स्थिरता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: विच्छेदन । (ए) तीसरे इनस्टार लार्वा का पृष्ठीय दृश्य। लार्वा के पीछे के छोर पर लाल रेखा दर्शाती है कि पहला कट कहां किया जाना चाहिए। (बी) पीछे के छोर को हटाने के बाद लार्वा का पृष्ठीय दृश्य। (सी) लार्वा को उलटा करने के तरीके को दर्शाने वाला आरेख। बल के एक सेट का उपयोग करके, लार्वा को छल्ली से पकड़ें जहां पहला कट बनाया गया था। अन्य बल का उपयोग करके, इनवर्ट करने के लिए लार्वा के पूर्ववर्ती छोर में दबाएं। काले तीर बल की दिशा को दर्शाते हैं, जिसमें एक पूर्ववर्ती पक्ष से लार्वा में "धक्का" देता है और दूसरा कटा हुआ पीछे के छोर को पूर्ववर्ती छोर की ओर ले जाता है। छोटा लाल तीर वसा शरीर के एक कार्टून को दर्शाता है। (डी) वसा निकायों और पाचन तंत्र के साथ एक उल्टे लार्वा का दृश्य अभी भी जुड़ा हुआ है। (ई) गैर-सीएनएस ऊतक के साथ एक उल्टे लार्वा का दृश्य हटा दिया गया। लाल धराशायी रेखा अभी भी जुड़े मस्तिष्क को रेखांकित करती है। (एफ) योजनाबद्ध दिखा रहा है कि छल्ली से मस्तिष्क को कैसे हटाया जाए। लाल डैश्ड लाइन मस्तिष्क को उल्टे छल्ली से मुक्त करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन कैंची से काटने के मार्ग को इंगित करती है, और काले तीर छल्ली से मस्तिष्क को हटाने को दर्शाते हैं। (जी) उल्टे मस्तिष्क का एक दृश्य जो अभी भी वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (वीएनसी) के तहत अक्षीय कनेक्शन की एक छोटी संख्या द्वारा छल्ली से जुड़ा हुआ है। (एच) एक पृथक लार्वा मस्तिष्क। मस्तिष्क के लोब ों को धराशायी नारंगी रेखाओं के साथ रेखांकित किया जाता है। (I) पृथक वसा निकाय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: माउंटिंग और इमेजिंग। (ए) झिल्ली-बद्ध धातु स्लाइड को इकट्ठा करने के लिए घटकों का दृश्य। (बी) झिल्ली-बाध्य स्लाइड के घटकों और उनके संयोजन का योजनाबद्ध। (सी) धातु स्लाइड में डाली गई झिल्ली का साइड व्यू, विभाजित धातु की अंगूठी द्वारा रखा जाता है। (डी) कवरस्लिप के बिना इकट्ठे इमेजिंग स्लाइड का शीर्ष दृश्य। वसा शरीर और विच्छेदित दिमाग वाले विच्छेदन और इमेजिंग माध्यम को झिल्ली पर रखा गया है। (ई) मध्यम की बूंद में वसा शरीर और दिमाग को देखते हुए ज़ूम-इन करें। (एफ) ग्लास कवरस्लिप जोड़ने के बाद धातु स्लाइड का शीर्ष दृश्य। (जी) पिघली हुई पेट्रोलियम जेली के साथ स्लाइड पर लगाए गए ग्लास कवरस्लिप के साथ इकट्ठी स्लाइड का शीर्ष दृश्य। पेट्रोलियम जेली के साथ कवरस्लिप के किनारों को कवर करना भी माध्यम के वाष्पीकरण को रोकता है। (एच) एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर अवलोकन के लिए उन्मुख दिमाग के साथ इकट्ठे झिल्ली स्लाइड का योजनाबद्ध। नीले घेरे केंद्रीय मस्तिष्क लोब और वीएनसी में एनबी को दर्शाते हैं। (I) एक खाली मल्टी-वेल स्लाइड का दृश्य। (जे) मल्टी-वेल इमेजिंग स्लाइड के एक कुएं का ज़ूम-इन दृश्य। (के) एक मल्टी-वेल स्लाइड के साथ उल्टे माइक्रोस्कोप पर केंद्रीय मस्तिष्क लोब की इमेजिंग के लिए मस्तिष्क अभिविन्यास दिखाने वाला योजनाबद्ध। नीले घेरे केंद्रीय मस्तिष्क लोब और वीएनसी में एनबी को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: सेल चक्र की लंबाई का परिमाणीकरण । (ए) एक तीसरे इनस्टार लार्वा मस्तिष्क का आरेख, मस्तिष्क लोब, ऑप्टिक लोब (ओएल, डार्क ग्रे), वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (वीएनसी), एनबी (गहरा नीला), जीएमसी (हल्का नीला), और केंद्रीय मस्तिष्क लोब और वीएनसी के भीतर न्यूरॉन्स (बैंगनी) को उजागर करता है। (बी) एनबी और जीएमसी डिवीजनों का योजनाबद्ध। (सी) सफेद (एमटी, यूएएस-चेरी:: बृहस्पति) और एपिकल पिन (पिन: ईजीएफपी इन ग्रीन) में लेबल किए गए सूक्ष्मनलिकाएं के साथ एक जंगली-प्रकार एनबी की छवि श्रृंखला को 4 घंटे के लिए वसा शरीर पूरक के बिना एक मल्टी-वेल स्लाइड में चित्रित किया गया है। विलय की गई छवियां और सेल चक्र समय के साथ संबंधित वंश वृक्ष नीचे दिखाए गए हैं। स्केल बार = 10 μm. (D) वसा निकायों के बिना एक बहु-वेल स्लाइड पर चित्रित नमूनों में पहले, दूसरे और तीसरे विभाजन के लिए सेल चक्र की लंबाई (मेटाफ़ेज़ - मेटाफ़ेज़) का परिमाणीकरण। (ई) सफेद (एमटी, यूएएस-चेरी:: बृहस्पति) में लेबल किए गए सूक्ष्मनलिकाएं के साथ एक जंगली-प्रकार एनबी की छवि श्रृंखला को नीचे दिखाए गए संबंधित वंश वृक्ष और कोशिका चक्र समय के साथ 10 घंटे के लिए वसा शरीर पूरकता के साथ झिल्ली-बद्ध स्लाइड के साथ चित्रित किया गया है। स्केल बार = 10 μm. (F) वसा निकायों के साथ झिल्ली-बद्ध स्लाइड पर चित्रित नमूनों में पहले, दूसरे, तीसरे और चौथे विभाजन के लिए सेल चक्र की लंबाई (मेटाफ़ेज़ - मेटाफ़ेज़) का परिमाणीकरण। (जी) स्पिंडल अक्ष (नारंगी डैश्ड लाइन) और डिवीजन अक्ष (3, लाल डैश्ड लाइन) के बीच का कोण कैसे निर्धारित किया गया था। (एच) वसा निकायों के बिना एक बहु-अच्छी स्लाइड का उपयोग करके चित्रित 10 कोशिकाओं से मात्रा का परिमाणीकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर लार्वा से जीवित खोज दिमाग की इमेजिंग के लिए एक दृष्टिकोण को रेखांकित करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सही प्रयोगात्मक परिस्थितियों में 12-20 घंटे के लिए खोज दिमाग को देखने की अनुमति देता है। नमूने की तैयारी और वांछित प्रयोगों के डिजाइन पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, विच्छेदित ऊतक की गुणवत्ता निर्धारित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक लार्वा का स्वास्थ्य है। उच्चतम गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि लार्वा संग्रह से पहले अच्छी तरह से खिलाया जाता है। अस्वास्थ्यकर लार्वा आमतौर पर भीड़भाड़ से उत्पन्न होता है। इसे संबोधित करने के लिए, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि भीड़भाड़ को कम से कम किया जाए, या तो फसल की आवृत्ति बढ़ाकर या एक खाली पकवान के साथ ताजा रखे गए अंडे के साथ व्यंजनों को विभाजित करके।
इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण तत्व मस्तिष्क के ऊतकों को अलग करने के लिए विच्छेदन की विधि है। मस्तिष्क और उनके भीतर एनबी बाहरी कारकों के प्रति बेहद संवेदनशील हैं, जैसे कि विच्छेदन माध्यम का तापमान और विच्छेदन की आक्रामकता। मध्यम जो बहुत ठंडा है, सूक्ष्मनलिकाएं डीपॉलीमराइज करेगा। इसी तरह, एक विच्छेदन जो मस्तिष्क को फैलाता है या तोड़ता है, एनबी की गुणवत्ता पर हानिकारक प्रभाव डालेगा। इसे रोकने के लिए, किसी को सीधे मस्तिष्क के ऊतकों को खींचने से बचना चाहिए और इसके बजाय छल्ली या अन्य ऊतक पर विच्छेदन उपकरण को लंगर डालना चाहिए। माइक्रोडिसेक्शन कैंची इस संबंध में बहुत सहायता करती है, क्योंकि वे मस्तिष्क के ऊतकों पर न्यूनतम रूप से खींचते हैं। यदि कैंची उपलब्ध नहीं है, तो चिमटी का उपयोग उदर तंत्रिका कॉर्ड और छल्ली के बीच कनेक्टिंग ऊतक को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए लार्वा दिमाग को माउंट करने के लिए दो तरीके प्रस्तुत करता है। तकनीकी दृष्टिकोण से, एक मल्टी-वेल स्लाइड में नमूने माउंट करना झिल्ली-बाध्य स्लाइड पर चढ़ने की तुलना में सरल है। हालांकि, प्रत्येक विधि विभिन्न प्रकार के प्रयोगों के लिए सबसे उपयुक्त है। यहां दिखाए गए आंकड़ों से पता चलता है कि छोटी फिल्मों (यानी, 4 घंटे से कम) या उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन वाली फिल्मों (यानी, हर 10 सेकंड में जेड-स्टैक प्राप्त करना) के लिए, एक मल्टी-वेल स्लाइड में इमेजिंग लार्वा केंद्रीय मस्तिष्क में कई विभाजनों का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त है। लंबे समय तक अधिग्रहण खिड़कियों के लिए, झिल्ली-बाध्य स्लाइड पर चढ़ना आदर्श है, क्योंकि इस तरह से तैयार किए गए नमूने पूरी फिल्म में अधिक बार विभाजित होते हैं। आम तौर पर, जंगली प्रकार के लार्वा एनबी हर 40-90 मिनट13 में एक बार विभाजित होते हैं। यद्यपि मल्टी-वेल स्लाइड का उपयोग लंबी (> 4 घंटे) फिल्मों के लिए किया जा सकता है, इस स्थिति में सेल चक्र की लंबाई में वृद्धि और एनबी के प्रसार में कमी देखी गई है (चित्रा 5 डी)। इसलिए, प्रयोगों को डिजाइन करते समय नमूनों को माउंट करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि और मापा जाने वाला डेटा का प्रकार माना जाना चाहिए।
यह प्रोटोकॉल एक कुएं या स्लाइड में कई दिमागों की इमेजिंग की सिफारिश करता है, क्योंकि इससे किसी भी प्रयोग के लिए डेटा संग्रह की दक्षता बढ़ जाती है। हालांकि, कुएं के भीतर दिमाग का अभिविन्यास और प्लेसमेंट प्रभावित करेगा कि मस्तिष्क की स्थिति के बीच चलने वाले चरण के कारण पूरी फिल्म में कितना बदलाव होता है। एक कुएं में एक केंद्रीकृत स्थान पर दिमाग को एक साथ क्लस्टर करना इस मुद्दे को कम करता है। हालांकि, मल्टी-वेल स्लाइड्स का उपयोग करके प्रयोगों में लंबी फिल्मों के दौरान कुछ बदलाव हो सकते हैं। कई मामलों में, इन लंबी फिल्मों में देखा गया स्थानांतरण न्यूनतम है और विश्लेषण के दौरान इसे ठीक किया जा सकता है। धातु स्लाइड सेटअप का उपयोग करके मस्तिष्क आंदोलन को भी रोका जा सकता है क्योंकि केशिका बल विच्छेदित दिमाग को स्थानांतरित करने से रोकते हैं।
एक मल्टी-वेल स्लाइड के साथ, तकनीकी रूप से मल्टी-वेल इमेजिंग प्रयोग करना संभव है। हालांकि, इसके लिए स्टैक आकार और अस्थायी रिज़ॉल्यूशन में समायोजन की आवश्यकता होती है ताकि माइक्रोस्कोप द्वारा पदों के बीच चलने वाले अतिरिक्त समय का हिसाब लगाया जा सके। यह बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए फायदेमंद हो सकता है, जहां कोई विभिन्न कुओं में कई जीनोटाइप की छवि बना सकता है।
ऐसे उदाहरण हैं जहां दिमाग एक प्रयोग के दौरान बहुत कम या कोई विभाजित एनबी प्रदर्शित नहीं करेगा। यह कई कारकों के कारण होने की संभावना है जो छवि बनाए जा रहे नमूने की प्रकृति, लार्वा को पालने के लिए उपयोग किए जाने वाले भोजन की गुणवत्ता, विच्छेदन की गुणवत्ता और डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली अधिग्रहण सेटिंग्स पर निर्भर करते हैं। यद्यपि इमेजिंग के लिए लार्वा दिमाग तैयार करते समय जितना संभव हो उतना ऊतक हटाने की सलाह दी जाती है, लेकिन यांत्रिक तनाव को कम करने के लिए मस्तिष्क को ओवर-प्रून करने की सलाह नहीं दी जाती है, क्योंकि यह डेटा की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, शक्तिशाली इमेजिंग लेजर के लगातार संपर्क में न्यूरोब्लास्ट स्वास्थ्य पर नकारात्मक प्रभाव पड़ेगा। इस प्रकार, इमेजिंग डेटा एकत्र करते समय लेजर पावर, एक्सपोज़र समय और इमेजिंग आवृत्ति को समायोजित करने पर विचार करना चाहिए।
नमूने बढ़ाने के लिए, वैकल्पिक तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, खोज दिमाग को एक ठोस मैट्रिक्स37 में रखा जा सकता है। विभिन्न माउंटिंग प्रोटोकॉल की उपलब्धता विभिन्न प्रकार के माइक्रोस्कोप पर लार्वा मस्तिष्क खोजों की छवि बनाने का अवसर प्रदान करती है।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई वित्तीय प्रकटीकरण नहीं है।
Acknowledgments
यह शोध R35GM148160 (सी.सी.) और एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) प्रशिक्षण अनुदान टी 32 GM007270 (आर.सी.एस.) द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
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