Summary
In dieser Arbeit werden die Operationsverfahren und Vorsichtsmaßnahmen, die während der Du-Moxibustion bei der Behandlung von Morbus Bechterew bei experimentellen Mäusen zu treffen sind, detailliert beschrieben.
Abstract
Morbus Bechterew (AS) ist eine sich fortschreitende Form der Arthritis, die vor allem das Achsenskelett betrifft. Diese Erkrankung betrifft vor allem die Wirbelsäule und das Iliosakralgelenk. Im späteren Stadium der Erkrankung kann es zu einer Verschmelzung der Wirbelsäule und des Iliosakralgelenks kommen, die zu Wirbelsäulensteifigkeit und Kyphose sowie zu Schwierigkeiten beim Gehen führt, was die Qualität der Arbeit und der Aktivitäten des täglichen Lebens ernsthaft beeinträchtigt und eine schwere Belastung für den Patienten, die Familie und die Gesellschaft darstellt. Der nicht-pharmakotherapeutischen Behandlung von AS wird zunehmend Aufmerksamkeit geschenkt. Moxibustion ist eine uralte therapeutische Technik, die in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) verwendet wird. Die Du-Moxibustion-Therapie, eine einzigartige und innovative äußerliche Behandlung, die auf der Grundlage der gewöhnlichen Moxibustion entwickelt wurde, hat eine eindeutige therapeutische Wirkung auf AS. Du-Moxibustion kombiniert gekonnt die kompatiblen Techniken der TCM, um Meridiane, Akupunkturpunkte, chinesische Kräutermedizin und Moxibustion zu integrieren. In dieser Arbeit werden die Operationsverfahren und Vorsichtsmaßnahmen, die während der Du-Moxibustion bei Versuchsmäusen zu treffen sind, detailliert beschrieben, um eine experimentelle Grundlage für die Untersuchung des Mechanismus der Du-Moxibustion bei der Behandlung von AS zu schaffen.
Introduction
Morbus Bechterew (AS) ist eine sich fortschreitende Form der Arthritis, die vor allem das Achsenskelett betrifft. Laut der neuesten epidemiologischen Umfrage leiden ~0,01%-1,8% der Menschen auf der Welt an dieser Erkrankung1, die meisten von ihnen sind junge Männer (das Verhältnis von Männern zu Frauen beträgt ~2-3:1)2. Die Inzidenz von AS in der chinesischen Bevölkerung beträgt 0,2%-0,4%. Diese Erkrankung betrifft vor allem die Wirbelsäule und das Iliosakralgelenk. In den späteren Stadien der Erkrankung kann es zu einer Versteifung der Wirbelsäule und des Iliosakralgelenks kommen, die zu Wirbelsäulensteifigkeit und Kyphose sowie zu Schwierigkeiten beim Gehen führt, was die Qualität der Arbeit und der Aktivitäten des täglichen Lebens ernsthaft beeinträchtigt und eine schwere Belastung für den Patienten, die Familie und die Gesellschaft darstellt1. Derzeit gibt es keine endgültige Lösung für AS, und die angebotenen Behandlungen, sowohl pharmakologische als auch nicht-pharmakologische, konzentrieren sich in erster Linie auf die Linderung von Schmerzen, die Verlangsamung des Fortschreitens der Krankheit und die Verbesserung der Lebensqualität. Da die pharmakotherapeutischen Möglichkeiten in den letzten Jahren sehr begrenzt waren3, wurde der nicht-pharmakotherapeutischen Therapie, die zu einer alternativen Therapie für AS geworden ist, zunehmend Aufmerksamkeit geschenkt. In China bevorzugen Patienten oft eine äußerliche Behandlung, die aus der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) besteht, die geringe Nebenwirkungen und großen Komfort während der Behandlung hat.
Moxibustion ist eine uralte therapeutische Technik, die in der TCM verwendet wird. Du-Moxibustion ist eine äußerliche Behandlungstechnik, die aus einer "medikamentösen Moxibustion mit Schaum" am Wirbelsäulensegment des Du-Meridians besteht. Es wird hauptsächlich bei der Behandlung von AS eingesetzt und hat sich als sicher und wirksam erwiesen. Im Vergleich zur gewöhnlichen Moxibustion hat die Du-Moxibustion die Eigenschaften einer breiten Moxibustionsfläche, eines großen Moxakegels, einer starken Feuerkraft und einer hohen Temperatur4. Eine systematische Übersichtsarbeit und Metaanalyse deuten darauf hin, dass Moxibustion eine wirksame ergänzende Behandlung für AS5 ist. Eine kürzlich durchgeführte Studie bestätigte, dass die klinischen Symptome und einige Entzündungsfaktoren von AS-Patienten durch Moxibustion6 verbessert wurden. Studien haben gezeigt, dass Du-Moxibustion den Gehalt an β-Endorphin im Gehirn erhöhen und eine zentrale analgetische Wirkung ausübenkann 7, die Expression des HLA-B27-Gens 8 herunterreguliert und die Rezidivrate von AS verzögert. Die Du-Moxibustion hat auch eine lindernde Wirkung auf das Fortschreiten der AS, indem sie den Entzündungsindex ESR (BSG) und die Spiegel des C-reaktiven Proteins (CRP), des C-terminalen Peptids des Typ-I-Kollagens (CTX-I) und des Dickkopf1-Proteins (DKK1)9,10 senkt.
Eine weitere klinische Studie zeigte, dass die Du-Moxibustion die gestörten T-Zell-Untergruppen Ig und das Komplement C3 weiter anpassen kann, um den Immunmechanismus auszugleichen11. In Bezug auf den Knochenstoffwechsel kann die Moxibustion den Anstieg der alkalischen Phosphatase (ALP) und des Serumphosphors (S-P) hemmen, das Serumkalzium (S-Ca), die Knochenmineraldichte (BMD) und die Knochenstärke erhöhen12. Darüber hinaus kann die Du-Moxibustion die Wirbelsäulenfunktion an mehreren Stellen reparieren, um Müdigkeitssymptome bei AS-Patienten zu lindern13. Einige Tierstudien haben den potenziellen Mechanismus der Moxibustion bei der Behandlung von AS aufgedeckt. Eine Studie zeigte, dass Moxibustion den allgemeinen Gesundheitszustand signifikant verbesserte, die Dicke der Pfoten reduzierte und die Konzentrationen von IL-1β, PGE2, IL-6 und TNF-α in den Bandgewebeproben der Wirbelsäule verringerte. Die Analyse des Stoffwechselwegs verknüpfte die identifizierten Metaboliten mit dem TCA-Zyklus sowie dem Lipid-, Aminosäure-, Darmflora- und Purinstoffwechsel14. Eine andere Studie zeigte, dass Moxibustion die Expression der entzündungsfördernden Zytokine IL-1β, TNF-α, IL-17 und IL-6 unterdrückte; reduzierte die mRNA-Spiegel von RANKL, RANK, ALPE und OCN; und verbesserte die histopathologischen Merkmale bei AS-Mäusen15.
Während diese Studien darauf hindeuten, dass Moxibustion bei der Behandlung von AS wirksam sein könnte, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um diese Ergebnisse zu bestätigen und das optimale Behandlungsprotokoll für Moxibustion bei Patienten mit AS zu bestimmen. Unser Team entwickelte und modifizierte die Moxibustionstherapie, die auf der grundlegenden Theorie und praktischen Anwendung der traditionellen chinesischen Moxibustion basiert, die seit über 35 Jahren in der chinesischen klinischen Praxis weit verbreitet ist und angewendet wird. Obwohl es nur wenige qualitativ hochwertige Studien zur Behandlung von AS durch Du-Moxibustion gibt, wurde ihre Indikation bei der Behandlung von AS durch Evidenz gestützt. Der Mechanismus der Behandlung von AS mit Du-Moxibustion ist jedoch weitere Studien wert. Tierversuche sind eine wichtige Methode, um den Mechanismus der Du-Moxibustion bei der Behandlung von AS zu erforschen. Die klinische Anwendung der Du-Moxibustion ist relativ ausgereift, wird aber nur selten zur Untersuchung des Mechanismus im Tierversuch eingesetzt. In dieser Arbeit werden die Funktionsweise und die Vorsichtsmaßnahmen, die während der Du-Moxibustion bei der Behandlung von AS-Versuchsmäusen zu treffen sind, detailliert beschrieben.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Experimental Animal Welfare Ethics Review Committee der Shandong University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Nr. SDUTCM20230831301).
1. Zubereitung von Tieren
- Bestimmen Sie im Vorfeld die Versuchsgruppen und die Anzahl der Tiere pro Gruppe.
- Wählen Sie männliche BALb/c-Mäuse, halten Sie sie bei einer konstanten Temperatur von 22 ± 1 °C, einer konstanten Luftfeuchtigkeit von 60 ± 5 % und einer 12-stündigen Tageslichtumgebung.
2. Etablierung des AS-Mausmodells
ANMERKUNG: Das AS-Modell wurde mit Knorpelproteoglykan (PG) induziert, was eine klassische Modellierungsmethode ist 16,17,18,19,20,21. Mäuse des BALB/c-Stammes wurden wiederholt mit PG immunisiert, um Tendinitis und Spondylitis zu induzieren. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu den Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
- Verwenden Sie eine 200-μl-Pipette, um 200 μl PG und CFA (oder IFA) in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen zu ziehen. Sanftes Schütteln, um die Flüssigkeit im Zentrifugenröhrchen zu mischen.
- Das Zentrifugenröhrchen zur Homogenisierung in den Gewebeschleifer geben und dann 4 Minuten auf Eis inkubieren. 5x wiederholen. Stellen Sie in der Gewebeschleifmaschine folgende Parameter ein: 60 Hz, Schleifen 30 s, Intervall 10 s für insgesamt 6 Zyklen.
- Extrahieren Sie 0,2 ml emulgiertes PG-Protein mit einer 1-ml-Spritze aus dem Zentrifugenröhrchen.
- Greife die Maus und fixiere sie mit der linken Hand. Legen Sie die Maus in Rückenlage und halten Sie den Kopf tiefer als den Schwanz, um eine Schädigung der Bauchorgane beim Einführen der Spritze zu vermeiden.
- Sterilisieren Sie den Bauch mit Alkoholtupfern mit der rechten Hand.
- Mit der Spritze in der rechten Hand die Nadel subkutan leicht links oder rechts von der Linea alba ventralis in die untere Bauchhälfte einführen.
- Schieben Sie die Nadel 3-5 mm subkutan parallel zur Mittelbauchlinie und stoßen Sie dann die Nadel im 45°-Winkel zur Haut in die Bauchhöhle.
- Penetrieren Sie das Bauchfell, ziehen Sie den Nadelstopfen zurück und injizieren Sie langsam das emulgierte PG-Protein.
3. Du-Moxibustion
HINWEIS: Bereiten Sie im Voraus die drei wichtigsten Rohstoffe für die Du-Moxibustion vor (Abbildung 1).
- Moxa-Zapfen vorbereiten. Nehmen Sie den Samt in die Hand, wobei zwei Handflächen in entgegengesetzte Richtungen zeigen und eine Drehkraft ausüben, um den Samt in eine Spindelform zu reiben (Abbildung 2)
- Den Ingwer in kleine Stücke schneiden und in einem Entsafter pürieren (Abbildung 3). Das Ingwerpüree durch Baumwollgaze filtrieren. Den Ingwersaft und den Ingwerschlamm vom Ingwerküree trennen, um den nächsten Schritt vorzubereiten.
- Bereiten Sie 10 g Ingwerschlamm und 20 ml Ingwersaft vor und geben Sie sie zur späteren Verwendung in Pappbecher.
- Wiegen Sie 0,1 g TCM-Pulver (eine Mischung aus Zimtpulver, Nelkenpulver, Notopterygiumpulver, Antharidinpulver und künstlichem Moschus)22 ab und mahlen Sie es in einem Mörser.
- Legen Sie die Mäuse in die Anästhesie-Induktionsbox des Tieranästhesiegeräts und betäuben Sie sie mit einem Gemisch aus 2-3% Isofluran und Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 2 L/min.
- Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie zunächst das Fehlen eines Schreckreflexes beobachten, und überprüfen Sie das Niveau der chirurgischen Anästhesie, indem Sie das Fehlen eines Pedalreflexes als Reaktion auf ein leichtes Einklemmen der Zehen überprüfen.
- Nachdem die Maus die chirurgische Anästhesie erreicht hat, nehmen Sie sie aus der Schachtel und fixieren Sie sie in Bauchlage auf dem Operationstisch. Richten Sie Mund und Nase der Maus auf den Auslass des Anästhetikums aus.
- Die Anästhesie erfolgt über eine an der Anästhesiemaschine befestigte Maske, durch die Isofluran und Sauerstoff über einen Kreislauf ohne Rückatmung abgegeben werden. Halten Sie die Anästhesie aufrecht und halten Sie die Maus während des gesamten Operationsvorgangs auf einem 37 °C heißen Heizkissen. Tragen Sie Gleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Lokalisieren Sie die Akupunkturpunkte und identifizieren Sie den Stimulationsbereich (Abbildung 4).
- Rasieren Sie die Haare auf dem Rücken der Maus, bis die fleischfarbene Haut auf dem Rücken der Maus zu sehen ist. Stellen Sie sicher, dass die Breite der Haarentfernung ~1,5 cm beträgt und die Länge vom siebten Halswirbel bis zum Schwanzwirbel reicht (Abbildung 5A).
- Tragen Sie den vorbereiteten Ingwersaft mit einer Wattegaze auf die rasierte Stelle auf (Abbildung 3).
- Streuen Sie das TCM-Pulver gleichmäßig mit einem Schreibpinsel auf die Mittellinie der Rückseite der Maus und decken Sie es mit Maulbeerpapier ab (Abbildung 5B-D).
- Eine trapezförmige Ingwersäule von 6 cm Länge, 1,5 cm Breite und 3 mm Dicke aus Ingwerschlamm herstellen. Befestigen Sie die Ingwersäule auf dem Maulbeerpapier (Abbildung 5E).
- Machen Sie eine Rille über der Mittellinie der Ingwersäule (Abbildung 3) und legen Sie den Moxakegel auf die Ingwersäule.
- Zünde den Moxakegel an und setze einen neuen Moxakegel auf, nachdem der vorherige ausgebrannt ist. Prüfen Sie die Festigkeit der Ingwersäule, um ein Anbrennen der Maus zu vermeiden, und verbrennen Sie insgesamt drei Zapfen (Abbildung 5F).
- Nach dem Abbrennen der Moxa-Zapfen den Ingwer und das TCM-Pulver abwischen und den Rücken der Maus reinigen. Beenden Sie die Anästhesie an dieser Stelle.
- Erlauben Sie der Maus, in einem neuen Käfig mit uneingeschränktem Zugang zu Futter und Wasser wieder zu Bewusstsein zu kommen. Stellen Sie den Käfig auf ein beheiztes Pad, um den Erholungsprozess zu unterstützen. Beobachte das Tier, bis es wieder zu Bewusstsein kommt.
- Sobald sich die Maus vollständig erholt hat, überprüfen Sie das Vorhandensein des Aufrichtungsreflexes, bevor Sie sie wieder in ihr normales Gehäuse zurückbringen.
HINWEIS: Während der Operation ist es notwendig, den psychischen Zustand der Mäuse zu überwachen, um eine schwache Atmung zu vermeiden. Vermeiden Sie Verbrühungen, aber halten Sie die Mäuse warm und vermeiden Sie Blutergüsse an Krallen und Schwanz.
4. Bewertung des Arthritis-Index (AI)
- Bewerten Sie den KI-Score dreimal: vor der Modellierung, nach der Modellierung und nach der Behandlung. Die Beurteilungsmaßstäbe lauten wie folgt: 0, keine Rötung oder Schwellung; 1, leichte Rötung oder Schwellung in einigen Zehen; 2, Rötung und Schwellung in den meisten Zehengelenken und Zehen; 3, schwere Rötung und Schwellung in den Füßen und unterhalb des Sprunggelenks; und 4, Rötung und Schwellung in den Füßen und im Sprunggelenk23.
- Berechne die KI-Werte aller vier Pfoten mit einem Maximalwert von 16.
5. Rotarod-Test
HINWEIS: Der Rotarod-Test wird verwendet, um die motorische Koordination und das Gleichgewicht zu beurteilen, indem die Zeit aufgezeichnet wird, die die Mäuse auf der rotierenden Trommel verbringen. Dieses Experiment bestand aus drei Versuchen im Abstand von 20 Minuten. Die offiziellen Testdaten wurden aus dem dritten Versuch aufgezeichnet, wobei die ersten beiden als Trainingsübungen dienten.
- Setzen Sie die Mäuse auf rotierende Trommeln, die sich unter kontinuierlicher Beschleunigung von 4 bis 40 U/min über 300 s24 drehen.
- Messen Sie die Latenzzeit (die Zeit, bis die Maus von der Stange fällt). Stellen Sie eine Polsterung bereit, um Verletzungen zu vermeiden, wenn es herunterfällt.
6. Freifeldtest (OFT)
HINWEIS: Die OFT wird verwendet, um den Zustand der autonomen Bewegung zu bewerten, mit dem Ziel, pathologisches Verhalten zu identifizieren. Vier quadratische Freifeldarenen (50 cm x 50 cm x 40 cm) wurden zu der Apparatur zusammengefügt. Der Boden der Schachtel war in neun gleiche Quadrate unterteilt.
- Kontrollieren Sie die Hintergrundgeräusche des Labors auf unter 65 dB.
- Wischen Sie das gesamte Gerät vor jedem Versuch mit 75%igem Ethanol ab.
- Platzieren Sie alle Mäuse 1 Stunde vor dem Test im Testraum, damit sie sich an ihre Umgebung anpassen können.
- Setzen Sie die Mäuse in die quadratischen Freilandarenen und lassen Sie sie 10 Minuten lang erkunden.
- Zeichnen Sie die Gesamtstrecke und die Bewegungsgeschwindigkeit 10 Minuten lang auf.
7. Euthanasie und Probenentnahme
- Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionsbox und betäuben Sie sie mit einer Mischung aus 2-3% Isofluran und Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 2 l/min. Sobald die Maus in einen Zustand tiefer Anästhesie eintritt, der durch einen fehlenden Pedalreflex bestätigt wird, wird sie zur Erhaltungsanästhesie auf den Operationstisch verlegt.
- Greife und fixiere die Maus mit der nicht-dominanten Hand.
- Drücken Sie leicht auf die Augenpartie, damit die Augäpfel verstopfen und hervortreten.
- Verwenden Sie eine Schere, um die Schnurrhaare der Maus zu kürzen, um eine durch Haare verursachte Hämolyse zu verhindern.
- Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie auf das Fehlen eines Pedalreflexes als Reaktion auf ein Einklemmen der Zehen prüfen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Augapfel zu fassen und schnell zu entfernen, so dass das Blut aus der Augenhöhle in ein Mikrozentrifugenröhrchen fließen kann.
HINWEIS: Alternative Blutentnahmemethoden, wie z. B. eine Herzpunktion, können ebenfalls verwendet werden. - Wenn sich die Bluttropfrate verlangsamt, drücken Sie sanft auf den Herzbereich der Maus, um das Blutpumpen zu beschleunigen und mehr Blut zu erhalten. Euthanasieren Sie die Maus dann mit Hilfe einer zervikalen Luxation.
- Halten Sie das Bein mit einer Pinzette in der nicht-dominanten Hand knapp über dem Sprunggelenk. Schneiden Sie dann das Bein knapp über dem Sprunggelenk mit einer Schere ab.
8. Histologische Analyse
- Tauchen Sie die Knöchelproben länger als 24 Stunden in 4%iges Paraformaldehyd. 1 Monat lang in 10% EDTA (pH = 7,4) entkalken.
- Die Proben werden 2 h lang in 4%igem Paraformaldehyd eingeweicht.
- Weichen Sie die Proben dann in einem Gradienten steigender Ethanolkonzentrationen (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %, 100 %) ein. Jede Ethanolkonzentration 1 h lang einweichen.
- Die Proben werden 3 h lang in Xylol eingeweicht.
- Tauchen Sie die Knöchelproben für 7 Stunden in Paraffin. Paraffinblöcke im Kühlschrank bei 4 °C beiseite stellen.
- Schneiden Sie Paraffinblöcke mit einer halbautomatischen Paraffinschneidemaschine auf eine Dicke von 6 μm.
- Die Scheiben 4 x 5 min in Xylol einweichen, um das Entwachsen abzuschließen.
- Die Scheiben werden jeweils 2 Minuten lang in einem Gradienten abnehmender Ethanolkonzentrationen (100 %, 100 %, 95 %, 75 %) eingeweicht. 2 Min. in destilliertem Wasser einweichen.
- Die Scheiben 10 Minuten lang mit Hämatoxylin färben und 5 Sekunden lang mit destilliertem Wasser abspülen.
- Die Scheiben 30 s in der Differenzierungsflüssigkeit einweichen und 5 s mit destilliertem Wasser abspülen.
- Die Scheiben 1 Minute lang mit Eosin färben und 3 Minuten mit destilliertem Wasser abspülen.
- Die Scheiben werden in einem Gradienten steigender Ethanolkonzentrationen (80 %, 95 %, 100 %, 100 %) für jeweils 1 Minute eingeweicht. 3 x 3 min in Xylol einweichen und die Scheiben25 verschließen.
9. Enzymgebundener Immunosorbent-Assay (ELISA)
- Messen Sie die IL-17- und TNF-α-Konzentrationen im Plasma mit den entsprechenden Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
10. Statistische Analyse
- Drücken Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus.
- Bestimmen Sie die Signifikanz durch eine unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) oder eine ANOVA, gefolgt von den Post-hoc-Tests von Bonferroni oder Tamhane T2.
- Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.
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Representative Results
PG-induzierte Modellmäuse entwickelten Symptome einer peripheren Arthritis, die durch Rötung und Schwellung der Extremitäten und Zehen gekennzeichnet ist, und entwickelten bereits in Woche 14 allmählich eine axiale Arthritis, die der Manifestation von AS sehr ähnlich ist. Daher wurde das AS-Mausmodell als erfolgreich angesehen, wenn der Arthritis-Index (AI) 14 Wochen nach der letzten Injektion über 3 Punkten lag22. Wenn die Pfoten der Mäuse geschwollen erschienen, wurde die Du-Moxibustion-Behandlung einmal wöchentlich für insgesamt 3x durchgeführt. Nach der Behandlung wurden die Mäuse unter Isofluran-Tiefenanästhesie durch Zervixluxation euthanasiert, ihr Blut wurde entnommen und die Knöchel wurden herausgeschnitten.
Auswirkungen der Du-Moxibustion auf die motorische Koodination und die autonome Bewegung
Bovine PG-induzierte AS wurde als Modell verwendet, um die Wirkung der Du-Moxibustion am Du-Meridian auf die motorische Koordination zu beobachten. Zunächst wurde der Gelenkschwellungswert verwendet, um zu beurteilen, ob das Modell erfolgreich war, und die motorische Koordination und die autonome Bewegung wurden mit dem Rotarod-Test und der OFT bewertet.
Die Auswertung der AI bestimmte den Schweregrad der peripheren Arthritis. Nach der Modellierung zeigte die ANOVA mit wiederholten Zwei-Wege-Messungen, dass die Gelenkschwellungswerte in der Modell- und Du-Moxibustion-Gruppe im Vergleich zu denen in der Kontrollgruppe vor der Du-Moxibustion signifikant anstiegen (P < 0,01; Abbildung 6A). Die Du-Moxibustion-Behandlung verringerte die Gelenkschwellungswerte im Vergleich zu denen der Modellgruppe nach der Du-Moxibustion (P < 0,05; Abbildung 6A).
Der Rotarod-Test wurde verwendet, um die motorische Koordination und das Gleichgewicht zu bewerten. Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen zeigte signifikante Unterschiede über die Zeit (F = 13,928, P = 0,000 < 0,05) und Interaktionseffekte von Zeit und Gruppe (F = 12,583, P = 0,000 < 0,05). Nach der Modellierung unterschied sich die Latenzzeit der Kontrollgruppe nicht von der vor der Modellierung. Nach der Modellierung verringerten sich jedoch die Latenzzeiten der Modell- und Du-Moxibustion-Gruppen signifikant im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe (P < 0,01; Abbildung 6B), und es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Modellgruppe und der Du-Moxibustionsgruppe (P > 0,05; Abbildung 6B). Nach der Behandlung erhöhte sich die Latenzzeit der Du-Moxibustion-Gruppe im Vergleich zur Modellgruppe signifikant (P < 0,05; Abbildung 6B). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Du-Moxibustion die motorische Koordination bei AS-Mäusen wirksam verbesserte.
OFT wurde durchgeführt, um autonome Bewegungen zu detektieren. Die Parameter wurden automatisch mit Hilfe der Software erfasst und analysiert (Abbildung 6C-E); Die Gesamtstrecke und die Durchschnittsgeschwindigkeit wurden in dieser Studie hauptsächlich beobachtet. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Gesamtdistanz und der Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen den Gruppen vor der Modellierung (P > 0,05; Abbildung 6C,D). Nach der Modellierung reduzierten sich die Gesamtstrecke und die Durchschnittsgeschwindigkeit im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant (P < 0,05; Abbildung 6C,D). Nach der Behandlung stiegen die Gesamtdistanz und die durchschnittliche Geschwindigkeit der Du-Moxibustion-Gruppe im Vergleich zu denen der Modellgruppe signifikant an (P < 0,05; Abbildung 6C,D). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Du-Moxibustion die autonome Bewegung bei AS-Mäusen wirksam verbesserte.
Auswirkungen der Du-Moxibustion auf die Pathologie des Sprunggelenks
Die HE-Färbung wurde verwendet, um die pathologischen Veränderungen im Sprunggelenk zu beobachten. In der Kontrollgruppe gab es keine Schädigung der Synoviumstruktur, keine Stauung in der Synovialis und keine offensichtliche Infiltration und Nekrose von Entzündungszellen. In der Modellgruppe wurden jedoch neben entzündlichen Zellinfiltrationen und Gewebeödemen auch Synoviumhyperplasie und Infiltrationen in der Gelenkhöhle beobachtet. In Kombination mit der KI-Evaluierung konnte nachgewiesen werden, dass das AS-Modell erfolgreich etabliert wurde. Im Vergleich zur Modellgruppe war das Synovium der Mäuse in der Du-Moxibustion-Gruppe intakter, das interstitielle Ödem war reduziert und der Gelenkknorpel war relativ intakt (Abbildung 7).
Auswirkungen der Du-Moxibustion auf die IL-17- und TNF-α-Plasmaspiegel
Es wurde ein ELISA durchgeführt, um IL-17 und TNF-α im Plasma zu messen. Die IL-17- und TNF-α-Plasmaspiegel der Modellgruppe waren im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht (P < 0,01; Abbildung 6F,G). Du-Moxibustion verringerte die IL-17- und TNF-α-Plasmaspiegel (P < 0,05; Abbildung 6F,G).
Abbildung 1: Die Rohstoffe, die für die Du-Moxibustion benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Herstellung eines Moxakegels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ingwerwasser zubereiten und eine trapezförmige Ingwersäule herstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Lokalisation von GV14 und GV2 in der Maus. (A) GV14 befindet sich am Processus subspinous des siebten Halswirbels; GV2 befindet sich im Hiatus-Sacral-Kanal. (B) Schematische Darstellung der Du-Moxibustion auf der Maus. (C) Stimulierter Bereich der Du-Moxibustion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Operationsablauf der Du-Moxibustion bei der Maus. (A) Rasieren Sie die Haare und schmieren Sie den Ingwersaft auf die Maus in Bauchlage. (B,C) TCM-Pulver gleichmäßig streuen. (D) Decken Sie das Pulver mit Maulbeerpapier ab. (E) Befestigen Sie die Ingwersäule fest auf dem Maulbeerpapier. (F) Legen Sie eine Moxa-Tüte auf die Ingwersäule; Dann zünden Sie es an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Auswirkungen der Du-Moxibustion auf die motorische Koordination, die autonome Bewegung und die IL-17- und TNF-α-Spiegel. (A) Die Gelenkschwellung bei Mäusen. (B) Die Latenzzeit im Rotarod-Test. (C-E) Gesamtstrecke, Durchschnittsgeschwindigkeit und Streckendiagramm von OFT. (F) IL-17-Spiegel im Plasma. (G) TNF-α Konzentrationen im Plasma. Die Werte werden als Mittelwert ± REM ausgedrückt (n = 6). ##P < 0,01, #P < 0,05 gegenüber der Kontrollgruppe; $$P < 0,01, $P < 0,05 gegenüber der Modellgruppe. Abkürzungen: IL = Interleukin; TNF = Tumornekrosefaktor; OFT = offener Feldversuch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: HE-Färbung des Sprunggelenks. (A) Die Gelenkhöhle war glatt ohne entzündliche Infiltration in der Kontrollgruppe. (B) In der Modellgruppe wurden Synoviumhyperplasie und Infiltration in der Gelenkhöhle beobachtet. (C) In der Du-Moxibustion-Gruppe war die Gelenkhöhle der Mäuse glatt und das Ödem wurde gelindert. Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzung: HE = Hämatoxylin-Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
AS äußert sich klinisch als Rücken-, Lenden- und Gelenkschwellungsschmerzen, und in schweren Fällen können Wirbelsäulendeformitäten und Gelenksteifigkeit auftreten26. Eine frühzeitige Diagnose und Behandlung kann die Lebensqualität verbessern, die Behinderungsraten senken und die Prognosen von Patienten mit AS verbessern. Nach der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) wird angenommen, dass AS durch einen Mangel an Yang in der Niere und im Du-Meridian sowie durch eine Ansammlung von kaltem Übel im Inneren verursacht wird. Die TCM vertritt die Ansicht, dass Moxibustion, basierend auf dem Konzept der Meridiane, Qi erzeugen kann, das die Körperoberfläche erwärmt. Dieses Qi wandert dann entlang der Meridiane und Akupunkturpunkte nach unten. Im Inneren Kanon von Huangdi (ein sehr klassisches und wichtiges TCM-Meisterwerk) wird festgehalten, dass "der kranke Du-Meridian behandelt wird". Da sich AS im Du-Meridian befindet, wird die Stimulation des Du-Meridians als therapeutischer Punkt verwendet. Der Du-Meridian gilt als der Ozean der Yang-Kanäle, in dem das Yang Qi seinen Höhepunkt erreicht. Die Moxibustion auf dem Du-Meridian kann das Yang-Qi ergänzen, die Wirkung des Du-Meridians aktivieren und die wärmende Wirkung des Nieren-Yang regulieren, d. h. die Immunregulationsfunktion der westlichen Medizin verbessern.
Aus Sicht der westlichen Medizin spielt das Rückenmark eine wichtige Rolle bei der Übertragung neuronaler Informationen. Die Moxibustion, die auf den Ein- und Austritt von Spinalnervenwurzeln wirkt, kann die Funktion und den Regulationsmechanismus des Nervensystems durch die Regulierung von Neurotransmittern beeinflussen. In den 1990er Jahren wurde gezeigt, dass die Du-Moxibustion den Gehalt an β-Endorphinen im Hypothalamus von Ratten erhöht und damit eine zentrale analgetische Wirkung hat7. Darüber hinaus ist die Enthesitis eine häufige Komplikation der AS, die durch anhaltende Schmerzen und Muskelsteifheit gekennzeichnet ist, die bei schweren Erkrankungen die Gelenk- und Körperbewegung beeinträchtigen kann. Als klinisch validierte TCM-Behandlungsmethode kann die Du-Moxibustion Entzündungen wirksam lindern, die Gewebereparatur fördern und die Enthesitis bei der Behandlung von AS verbessern.
Konkret spiegeln sich die Wirkungen von Akupunktur und Moxibustion vor allem in den folgenden Aspekten wider. Erstens fördern sie die Durchblutung und die Aufnahme von Entzündungen. Die Du-Moxibustion regt durch die wärmende Wirkung die Durchblutung und den Stoffwechsel in den die Wirbelsäule umgebenden Geweben an und fördert die Aufnahme von Entzündungen und die Gewebereparatur, wodurch der Entzündungsgrad und die Schmerzen der Sehnenansatzentzündung reduziert werden. Zweitens verbessern sie die Muskel- und Bänderspannung. Die stimulierende Wirkung der Du-Moxibustion kann die Muskelspannung um die Wirbelsäule verbessern, die verhärteten Weichteile entspannen, die Aktivität der Wirbelsäulengelenke fördern und die Schmerzen und Steifheiten reduzieren, die durch Muskelverspannungen und Bänderdehnungen verursacht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Du-Moxibustion als Zusatztherapie die Aktivitäten des Nerven-, Immun- und Kreislaufsystems des Körpers umfassend regulieren kann, indem sie auf die Wirbelsäulenregion einwirkt und den Körper als Ganzes ausgeglichener macht.
Die Entzündung ist die Hauptmanifestation von AS27. TNF-α ist ein Multi-Effektor-Zytokin und Entzündungsfaktor, der unter der Stimulation von mononukleären Makrophagen produziertwird 28. Die Aktivität von ALP und die Kollagensynthese kann durch TNF-α gehemmt werden, was zu Knochenschwund und Knorpelzerstörung führt29. In den letzten Jahren haben Studien ergeben, dass IL-17 eine wichtige Rolle in der Pathogenese der AS spielt, was in einer Übersichtsarbeit30 vollständig nachgewiesen wurde. IL-17 kann direkt auf Osteoblasten einwirken, die Expression des nukleären Transkriptionsfaktor-κB (NF-κB)-Rezeptoraktivator-Liganden (RANKL) fördern und die robuste Bildung von Osteoklasten fördern. Gleichzeitig beeinflusst IL-17 auch mesenchymale Stammzellen (MSCs), induziert deren Proliferation und fördert ihre Differenzierung zu Osteoblasten31. Kenna32 et al. fanden heraus, dass der IL-17-Spiegel im peripheren Blut von AS-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen um fast das Doppelte anstieg. Die Studie deutet darauf hin, dass IL-17-Antagonisten eine neue Option für AS-Patienten sein könnten, die nicht gut auf TNF-α-Antagonisten ansprechen33. Eine klinische Studie zeigte, dass ein Dosierungsschema von IL-17-Antagonisten einem Placebo überlegen war, um die Anzeichen und Symptome der röntgenologischen axialen Spondyloarthritis bei Patienten zu verbessern34. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Plasmaspiegel von TNF-α und IL-17 in der Modellgruppe signifikant höher waren als in der Kontrollgruppe und die Plasmaspiegel von TNF-α und IL-17 nach Du-Moxibustion-Behandlung signifikant erniedrigt waren.
Die Du-Moxibustion-Therapie nutzt gekonnt die kompatiblen Techniken der TCM, um Meridiane, Akupunkturpunkte, chinesische Kräutermedizin und Moxibustion zu integrieren. Zu den Rohstoffen der Du-Moxibustion-Therapie gehörten hauptsächlich Moxasamt, Ingwer und TCM-Pulver. Aus Sicht der TCM hat Moxasamt, ein verarbeitetes Produkt des Beifußes, die Funktion, Kollateralen zu aktivieren, Kälte zu vertreiben und Schmerzen zu lindern. Ingwer spielt eine Rolle bei der Linderung äußerer Symptome und der Vertreibung von Erkältungen. Die moderne Forschung zeigt auch, dass Ingwer entzündungshemmende und schmerzlindernde Eigenschaften hat35. Das Abwischen der Haut mit Ingwersaft vor der Behandlung hilft, die Poren zu öffnen und die transdermale Permeationzu fördern 36 sowie die Haftung des TCM-Pulvers auf der Haut zu unterstützen. Die trapezförmige Ingwersäule ist fest auf der Rückseite befestigt, um eine solide Basis für den Moxakegel zu bieten. Nach dem Abbrennen des Moxakegels wirken die Wirkungen von Feuerkraft, Ingwer und TCM-Pulver auf den Du-Meridian zusammen. In Anbetracht der Pathogenese des Yang-Mangels bei dieser Krankheit wirkt die Du-Moxibustion direkt an der Stelle der Krankheit, erwärmt die Meridiane, verteilt Kälte, ergänzt Yang Qi und Essenz, fördert die Durchblutung und gleicht Yin und Yang aus, um die Wurzel der Krankheit zu behandeln.
Bei der Durchführung der Du-Moxibustion sollten mehrere Details beachtet werden. Zunächst wird die Operationsstelle der Du-Moxibustion vom Dazhui-Punkt (GV14) bis zum Yaohu-Punkt (GV2) fixiert (anatomisch vom 7. Halswirbelfortsatz bis zum Schwanzwirbel, einschließlich der gesamten Wirbelsäule), was mit der Inzidenzstelle der AS übereinstimmt (Abbildung 4). Zweitens sind die Feuchtigkeit und die Dicke des Ingwers wichtig. Der überschüssige Ingwersaft muss nach der Verarbeitung des Ingwers zu Ingwerschlamm ausgepresst werden, damit sich der Ingwerschlamm nicht körnig anfühlt und seine Dicke für die trapezförmige Ingwersäule geeignet ist. Hohe Luftfeuchtigkeit und Feuchtigkeit im Ingwerschlamm können das Eindringen von Moxibustionsfeuer leicht behindern und die Menge der Moxibustionsstimulation reduzieren. Wenn der Ingwerrohstoff zu trocken und die Partikel zu groß sind, ist es schwierig, die trapezförmige Ingwersäule herzustellen, was zu einem schnellen Eindringen von Wärme und Verbrühungen der Haut führt. Drittens sollte die Größe und Festigkeit des Moxakegels berücksichtigt werden. Moxa-Zapfen, die für die Moxibustion bei Mäusen verwendet werden, sind ~4 cm lang und haben einen Durchmesser von 0,5 cm und sollten zum Zeitpunkt der Zubereitung eng sein. Ein Test für die Dichtheit ist, wenn sich der Kegel auch nach dem Fallen auf eine Oberfläche nicht auflöst. Wenn der Moxakegel nicht kompakt genug ist, führt dies zu einer Verringerung der Menge an Moxasamt, einer kürzeren Brenndauer und einer Verringerung der Feuerkraft. Viertens sollten beim Anzünden des Moxakegels der Kopf, die Mitte und der Schwanz des Moxakegels mit feinem Weihrauch angezündet werden, damit der Moxakegel langsam abbrennt, um die nährende Wirkung von Ebbe und Flut zu erzielen. Fünftens ist Moschus ein wichtiger Bestandteil des medizinischen Moxibustionspulvers. Am zweiten Tag nach der Moxibustion sollten kristallklare Blasen wie kleine Perlen auf dem Du-Meridian zu sehen sein.
Eine große Anzahl klinischer Studien hat die eindeutige Wirksamkeit der Du-Moxibustion bei der Behandlung von AS 4,5,6 bestätigt. Die Erforschung des Wirkmechanismus im Tierversuch schreitet jedoch nur langsam voran. Durch Forschung und Innovation hat uns die jahrelange Erfahrung in der Anwendung der Du-Moxibustion dazu veranlasst, ihren Einsatz in Mäuseexperimenten zu untersuchen. In dieser Arbeit werden die Operationsverfahren und Vorsichtsmaßnahmen der Du-Moxibustion bei der Behandlung von AS bei Versuchsmäusen detailliert beschrieben. Darüber hinaus wurde die Wirkung der Moxibustion auf die motorische Koordination und die Plasmaspiegel von TNF-α und IL-17 in AS-Mäusen beobachtet. Diese Studie lieferte die grundlegendste experimentelle Grundlage für die Untersuchung des Mechanismus der Du-Moxibustion bei der Behandlung von AS. Es gibt noch einige Einschränkungen für diese Studie. Zum Beispiel werden wir in zukünftigen Studien auf die Bewertung verschiedener Parameter wie Placebo-Moxibustion, Dosis, Reichweite und Behandlungszeit achten, um die effektivsten Kombinationsschemata zu erhalten. In späteren Studien können bildgebende Verfahren eingesetzt werden, um die Behandlungsergebnisse intuitiver zu bewerten.
Die Anwendungsaussichten der Du-Moxibustion-Therapie sind vielversprechend. Der Du-Meridian, bekannt als das Gouverneursgefäß, spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Qi- und Blutflusses durch den Körper. Moxibustion, eine traditionelle chinesische Therapie, beinhaltet das Verbrennen von Beifuß auf bestimmten Akupunkturpunkten, um die Meridiane zu stimulieren und den Selbstheilungsmechanismus des Körpers zu fördern. Im Vergleich zur Akupunktur ist die Du-Moxibustion eine Kombination verschiedener Techniken, die auf die Körperoberfläche einwirken, was sich durch Komfort und ein starkes und breites Wirkungsspektrum auszeichnet. Darüber hinaus konzentriert sich die Du-Moxibustion-Therapie auf den Rücken- und Wirbelsäulenbereich und zielt auf die Bahnen des Du-Meridians ab. Es kann das Immunsystem des Körpers stärken, die Durchblutung verbessern und verschiedene körperliche und geistige Beschwerden lindern. Die Therapie hat ihre Wirksamkeit bei der Behandlung von Krankheiten wie Muskel-Skelett-Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen, gynäkologischen Störungen und psychischen Problemen unter Beweis gestellt. Mit Fortschritten in Forschung und Technologie wird erwartet, dass sich die Anwendung der Du-Moxibustion-Therapie weiter ausweiten wird. Zukünftige Studien könnten sein Potenzial in Bereichen wie Schmerzbehandlung, Stressabbau, Verdauungsstörungen und Atemwegserkrankungen untersuchen. Die Kombination von traditionellem Wissen und modernem wissenschaftlichem Verständnis könnte zu einer besseren Integration der Du-Moxibustion-Therapie in die allgemeine Gesundheitspraxis führen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Du-Moxibustion-Therapie in ihrer Anwendung und Integration in verschiedene Bereiche des Gesundheitswesens sehr vielversprechend ist. Weitere Forschung, klinische Studien und die Zusammenarbeit zwischen Praktikern der traditionellen chinesischen Medizin und modernen medizinischen Fachkräften sind unerlässlich, um ihr volles Potenzial auszuschöpfen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das General Program der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82174491) und das Qilu School of Traditional Chinese Medicine Academic School Inheritance Project (No. Lu Weihan [2020]132). Vielen Dank an das Laboratory Animal Center der Shandong University of Traditional Chinese Medicine für die Bereitstellung von Versuchsbedingungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% EDTA | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| alcohol pads | HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China | ||
| anesthesia machine | Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK | ||
| centrifuge tubes | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| complete Frech's adjuvant (CFA) | aladdin,Shanghai, China | F393378 | |
| cotton ball | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cotton gauze | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cutting board | self-preparation | ||
| decorin from bovine articular cartilage | Sigma-Aldrich, MO, USA | D8428 | |
| depilatory cream | Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China | ||
| electronic scale | Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| Eppendorf tube | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| eye lubricant | Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China | ||
| ginger | self-preparation | ||
| GraphPad Prism 7 software | GraphPad Software,Boston, USA | ||
| hair clipper | Super human Group CO LTD, Jinhua, China | ||
| heating pads | Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China | ||
| incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | aladdin,Shanghai, China | F393371 | |
| injection syringe | Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China | ||
| isoflurane | Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China | R510-22-10 | |
| joss stick | Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China | ||
| juicer | Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| knife | self-preparation | ||
| lighter | Zhejiang tiger-lighter Co. LTD | ||
| mortar | Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China | ||
| Mouse IL-17 ELISA Kit | absin, Shanghai, China | abs520009-96T | |
| Mouse TNF-α ELISA Kit | Wuhan Sanying, Wuhan, China | KE10002 | |
| mulberry paper | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China | ||
| OFT | Xinruan,Shanghai, China | XR-XZ301 | |
| paper cup | self-preparation | ||
| pipettes | OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK | ||
| refined moxa velvet | self-preparation | ||
| rotarod | Xinruan,Shanghai, China | XR-6C | |
| scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder | Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD | ||
| scissors | Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China | ||
| semi-automatic paraffin sectioning machine | Leica Camera AG, Watznach, Germany | ||
| SPSS 25.0 software | International Business Machines Corporation, NewYork, UAS | ||
| TCM powder | self-preparation | ||
| tips | Biosharp, Labgic, Beijing, China | ||
| writing brush | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China |
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