Summary
Questo documento descrive in dettaglio le procedure operative e le precauzioni da prendere durante la Du-moxibustione nel trattamento della spondilite anchilosante nei topi da esperimento.
Abstract
La spondilite anchilosante (AS) è una forma di artrite progressivamente peggiorante e invalidante che colpisce principalmente lo scheletro assiale. Questa malattia coinvolge principalmente la colonna vertebrale e l'articolazione sacroiliaca. La fusione della colonna vertebrale e dell'articolazione sacroiliaca può verificarsi nella fase successiva della malattia, con conseguente rigidità spinale e cifosi, nonché difficoltà a camminare, che influisce seriamente sulla qualità del lavoro e delle attività quotidiane e impone un pesante fardello al paziente, alla famiglia e alla società. Una crescente attenzione è stata rivolta alla non-farmacoterapia come terapia alternativa per la SA. La moxibustione è un'antica tecnica terapeutica utilizzata nella Medicina Tradizionale Cinese (MTC). La terapia della du-moxibustione, un trattamento esterno unico e innovativo sviluppato sulla base della moxibustione ordinaria, ha un effetto terapeutico definito sulla SA. La du-moxibustione combina abilmente le tecniche compatibili della MTC per integrare meridiani, agopunti, fitoterapia cinese e moxibustione. Questo articolo descrive in dettaglio le procedure operative e le precauzioni da prendere durante la Du-moxibustione nei topi sperimentali per fornire una base sperimentale per lo studio del meccanismo della Du-moxibustione nel trattamento della SA.
Introduction
La spondilite anchilosante (AS) è una forma di artrite progressivamente peggiorante e invalidante che colpisce principalmente lo scheletro assiale. Secondo l'ultima indagine epidemiologica, ~0,01%-1,8% delle persone nel mondo soffre di questa condizione1, la maggior parte dei quali sono giovani maschi (il rapporto maschi/femmine è ~2-3:1)2. L'incidenza della SA nella popolazione cinese è dello 0,2%-0,4%. Questa malattia coinvolge principalmente la colonna vertebrale e l'articolazione sacroiliaca. La fusione della colonna vertebrale e dell'articolazione sacroiliaca può verificarsi nelle fasi successive della malattia, con conseguente rigidità spinale e cifosi, nonché difficoltà a camminare, che influisce seriamente sulla qualità del lavoro e delle attività della vita quotidiana e impone un pesante onere al paziente, alla famiglia e alla società1. Attualmente, non esiste una soluzione definitiva per la SA e i trattamenti forniti, sia farmacologici che non farmacologici, si concentrano principalmente sull'alleviare il dolore, rallentare la progressione della malattia e migliorare la qualità della vita. Negli ultimi anni, poiché le opzioni farmacoterapeutiche sono state molto limitate3, è stata prestata una crescente attenzione alla non farmacoterapia, che è diventata una terapia alternativa per la SA. In Cina, i pazienti spesso preferiscono un trattamento esterno costituito dalla Medicina Tradizionale Cinese (MTC), che ha effetti collaterali minori e una grande comodità durante il trattamento.
La moxibustione è un'antica tecnica terapeutica utilizzata nella MTC. La du-moxibustione è una tecnica di trattamento esterno che consiste in una "moxibustione medicata con schiuma" sul segmento della colonna vertebrale del meridiano Du. Viene utilizzato principalmente nel trattamento della SA e ha dimostrato sicurezza ed efficacia. Rispetto alla moxibustione ordinaria, la Du-moxibustione ha le caratteristiche di un'ampia area di moxibustione, un grande cono di moxa, una forte potenza di fuoco e un'alta temperatura4. Una revisione sistematica e una meta-analisi suggeriscono che la moxibustione è un trattamento complementare efficace per l'AS5. Uno studio recente ha confermato che i sintomi clinici e alcuni fattori infiammatori dei pazienti con SA sono stati migliorati dalla moxibustione6. Gli studi hanno rivelato che la du-moxibustione può aumentare il contenuto cerebrale di β-endorfine ed esercitare un effetto analgesico centrale7, sottoregolare l'espressione del gene HLA-B27 8 e ritardare il tasso di recidiva di AS. La du-moxibustione ha anche un effetto migliorativo sulla progressione della SA diminuendo l'indice infiammatorio VES (VES) e i livelli di proteina C-reattiva (CRP), peptide C-terminale del collagene di tipo I (CTX-I) e proteina Dickkopf1 (DKK1)9,10.
Un altro studio clinico ha dimostrato che la du-moxibustione può regolare ulteriormente i sottoinsiemi di cellule T disordinate, Ig e C3 del complemento per bilanciare il meccanismo immunitario11. In termini di metabolismo osseo, la moxibustione può inibire l'aumento della fosfatasi alcalina sierica (ALP) e del fosforo sierico (S-P), aumentare il calcio sierico (S-Ca), la densità minerale ossea (BMD) e la resistenza ossea12. Inoltre, la du-moxibustione può riparare la funzione spinale in più punti per alleviare i sintomi di affaticamento nei pazienti con SA13. Alcuni studi sugli animali hanno rivelato il potenziale meccanismo della moxibustione nel trattamento della SA. Uno studio ha indicato che la moxibustione ha migliorato significativamente lo stato di salute generale, ha ridotto i livelli di spessore della zampa e ha diminuito i livelli di IL-1β, PGE2, IL-6 e TNF-α nei campioni di tessuto legamentoso della colonna vertebrale. L'analisi della via metabolica ha collegato i metaboliti identificati al ciclo del TCA, nonché al metabolismo dei lipidi, degli aminoacidi, della flora intestinale e delle purine14. Un altro studio ha dimostrato che la moxibustione sopprime l'espressione di citochine pro-infiammatorie, IL-1β, TNF-α, IL-17 e IL-6; riduzione dei livelli di mRNA di RANKL, RANK, ALP e OCN; e migliorato le caratteristiche istopatologiche nei topi AS15.
Sebbene questi studi suggeriscano che la moxibustione possa essere efficace nel trattamento della SA, sono necessarie ulteriori ricerche per confermare questi risultati e determinare il protocollo di trattamento ottimale per la moxibustione nei pazienti con AS. Il nostro team ha creato e modificato la terapia di moxibustione basata sulla teoria di base e sul funzionamento pratico della moxibustione tradizionale cinese, che è stata ampiamente eseguita e applicata nella pratica clinica cinese per oltre 35 anni. Sebbene esistano pochi studi di alta qualità sul trattamento della SA mediante Du-moxibustione, la sua indicazione nel trattamento della SA è stata supportata da prove. Tuttavia, il meccanismo di trattamento della SA con Du-moxibustione merita ulteriori studi. Lo studio sugli animali è un metodo importante per esplorare il meccanismo della Du-moxibustione nel trattamento della SA. Il funzionamento clinico della Du-moxibustione è relativamente maturo, ma raramente utilizzato nello studio del meccanismo negli esperimenti sugli animali. Questo articolo descrive in dettaglio il funzionamento e le precauzioni da prendere durante la du-moxibustione nel trattamento di topi sperimentali con SA.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Revisione Etica del Benessere Animale Sperimentale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shandong (n. SDUTCM20230831301).
1. Preparazione dell'animale
- Determinare in anticipo i gruppi sperimentali e il numero di animali per gruppo.
- Scegliere topi maschi BALb/c, alloggiarli a una temperatura costante di 22 ± 1 °C, un'umidità costante del 60 ± 5% e un ambiente leggero a ciclo diurno di 12 ore.
2. Messa a punto del modello murino AS
NOTA: Il modello AS è stato indotto con proteoglicano cartilagineo (PG), che è un metodo di modellazione classico 16,17,18,19,20,21. I topi del ceppo BALB/c sono stati ripetutamente immunizzati con PG per indurre tendinite e spondilite. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi ai materiali, ai reagenti e agli strumenti utilizzati in questo protocollo.
- Utilizzare una pipetta da 200 μL per aspirare 200 μL di PG e CFA (o IFA) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Agitare delicatamente per mescolare il liquido nella provetta da centrifuga.
- Posizionare la provetta da centrifuga nel macinino per l'omogeneizzazione e quindi incubare su ghiaccio per 4 min. Ripetere 5 volte. Impostare i seguenti parametri nella smerigliatrice per tessuti: 60 Hz, macinatura 30 s, intervallo 10 s per un totale di 6 cicli.
- Estrarre 0,2 mL di proteina PG emulsionata dalla provetta da centrifuga con una siringa da 1 mL.
- Afferra e fissa il mouse con la mano sinistra. Appoggiare il topo in posizione supina, tenendo la testa più bassa della coda per evitare danni agli organi addominali quando la siringa viene inserita.
- Sterilizzare l'addome con tamponi imbevuti di alcol usando la mano destra.
- Con la siringa nella mano destra, inserire l'ago per via sottocutanea leggermente a sinistra o a destra della linea alba ventralis nella metà inferiore dell'addome.
- Spingere l'ago per via sottocutanea di 3-5 mm parallelamente alla linea addominale centrale e poi spingere l'ago nella cavità addominale con un angolo di 45° rispetto alla pelle.
- Penetrare nel peritoneo, estrarre il tappo dell'ago e iniettare lentamente la proteina PG emulsionata.
3. Du-moxibustione
NOTA: Preparare in anticipo le tre materie prime più importanti per la Du-moxibustione (Figura 1).
- Preparare i coni di moxa. Prendi il velluto in mano, con due palmi rivolti in direzioni opposte che esercitano una forza di torsione per strofinare il velluto a forma di fuso (Figura 2)
- Tagliate lo zenzero a pezzetti e frullatelo in uno spremiagrumi (Figura 3). Filtrare la purea di zenzero attraverso una garza di cotone. Separa il succo di zenzero e il fango di zenzero dalla purea di zenzero per prepararti al passaggio successivo.
- Preparare 10 g di fango allo zenzero e 20 ml di succo di zenzero e metterli nei bicchieri di carta per un uso successivo.
- Pesare 0,1 g di polvere di MTC (una miscela di cannella in polvere, chiodi di garofano in polvere, notopterigium in polvere, polvere di antaridina e muschio artificiale)22 e macinarla in un mortaio.
- Posizionare i topi nella scatola di induzione dell'anestesia della macchina per anestesia animale e anestetizzarli con una miscela di isoflurano al 2-3% e ossigeno a una portata di 2 L/min.
- Valutare la profondità dell'anestesia osservando inizialmente l'assenza di un riflesso di trasalimento e verificare il livello di anestesia chirurgica controllando l'assenza di un riflesso del pedale in risposta a un leggero pizzicamento delle dita dei piedi.
- Dopo che il topo ha raggiunto l'anestesia piana chirurgica, estrarlo dalla scatola e fissarlo sul tavolo operatorio in posizione prona. Allineare la bocca e il naso del topo con l'uscita dell'anestetico.
- Somministrare l'anestesia tramite una maschera collegata alla macchina per anestesia, attraverso la quale l'isoflurano e l'ossigeno vengono erogati tramite un circuito di non respirazione. Mantenere l'anestesia e tenere il mouse su un termoforo a 37 °C durante l'intera procedura operativa. Applicare il lubrificante sugli occhi per prevenire l'essiccazione.
- Individuare i punti di agopuntura e identificare l'area di stimolazione (Figura 4).
- Radersi i peli sul dorso del mouse fino a quando non si vede la pelle color carne sul dorso del topo. Assicurarsi che la larghezza della depilazione sia ~1,5 cm e che la lunghezza vada dalla settima vertebra cervicale alla vertebra della coda (Figura 5A).
- Applicare il succo di zenzero preparato con una garza di cotone sulla zona rasata (Figura 3).
- Cospargere uniformemente la polvere di MTC con un pennello da scrittura sulla linea mediana del dorso del mouse e coprirla con carta di gelso (Figura 5B-D).
- Realizzare una colonna trapezoidale di zenzero lunga 6 cm, larga 1,5 cm e spessa 3 mm con fango di zenzero. Fissate la colonna di zenzero sulla carta di gelso (Figura 5E).
- Fai una scanalatura sopra la linea mediana della colonna di zenzero (Figura 3) e posiziona il cono di moxa sulla colonna di zenzero.
- Accendi il cono di moxa, posizionando un nuovo cono di moxa dopo che il precedente si è bruciato. Controllare la solidità della colonna di zenzero per evitare di bruciare il topo, bruciando un totale di tre coni (Figura 5F).
- Dopo aver bruciato i coni di moxa, rimuovi lo zenzero e la polvere di MTC e pulisci la parte posteriore del mouse. A questo punto interrompere l'anestesia.
- Consenti al topo di riprendere conoscenza in una nuova gabbia con accesso illimitato a cibo e acqua. Posiziona la gabbia su un cuscinetto riscaldato per aiutare il processo di recupero. Monitora l'animale fino a quando non riacquista sufficiente coscienza.
- Una volta che il mouse si è completamente ripreso, confermare la presenza del riflesso di raddrizzamento prima di riportarlo nel suo alloggiamento normale.
NOTA: Durante l'operazione, è necessario monitorare lo stato mentale dei topi per evitare una respirazione debole. Previeni le scottature, ma tieni i topi al caldo ed evita di ammaccare gli artigli e la coda.
4. Valutazione dell'indice di artrite (AI)
- Valutare il punteggio AI tre volte: prima della modellazione, dopo la modellazione e dopo il trattamento. Gli standard di valutazione sono i seguenti: 0, nessun arrossamento o gonfiore; 1, leggero arrossamento o gonfiore in alcune dita dei piedi; 2, arrossamento e gonfiore nella maggior parte delle articolazioni delle dita dei piedi e delle dita dei piedi; 3, grave arrossamento e gonfiore ai piedi e sotto l'articolazione della caviglia; e 4, arrossamento e gonfiore ai piedi e all'articolazione della caviglia23.
- Calcola i punteggi AI di tutte e quattro le zampe, con un valore massimo di 16.
5. Prova di Rotarod
NOTA: Il test rotarod viene utilizzato per valutare la coordinazione motoria e l'equilibrio registrando il tempo che i topi trascorrono sul tamburo rotante. Questo esperimento consisteva in tre prove separate da intervalli di 20 minuti. I dati ufficiali dei test sono stati registrati dalla terza prova, con le prime due che sono servite come esercizi di addestramento.
- Posizionare i mouse su tamburi rotanti che ruotano con accelerazione continua da 4 a 40 giri/min per 300 s24.
- Misura il tempo di latenza (il tempo fino a quando il mouse non cade dall'asta). Fornire un'imbottitura per evitare lesioni quando cade.
6. Test in campo aperto (OFT)
NOTA: L'OFT viene utilizzato per valutare lo stato del movimento autonomo, con l'obiettivo di identificare il comportamento patologico. Quattro arene quadrate in campo aperto (50 cm x 50 cm x 40 cm) sono state posizionate insieme per formare l'apparato. Il fondo della scatola era diviso in nove quadrati uguali.
- Controllare il rumore di fondo del laboratorio al di sotto di 65 dB.
- Pulire l'intero apparecchio con etanolo al 75% prima di ogni prova.
- Posizionare tutti i topi nella sala di prova 1 ora prima del test per consentire loro di adattarsi al loro ambiente.
- Metti i topi nelle arene quadrate in campo aperto e lascia che esplorino per 10 minuti.
- Registra la distanza totale e la velocità di movimento per 10 minuti.
7. Eutanasia e raccolta di campioni
- Posizionare il topo nella scatola di induzione dell'anestesia e anestetizzarlo con una miscela di isoflurano al 2-3% e ossigeno a una portata di 2 L/min. Una volta che il topo entra in uno stato di anestesia profonda confermato da una mancanza di riflesso del pedale, trasferirlo sul tavolo operatorio per l'anestesia di mantenimento.
- Afferra e fissa il mouse con la mano non dominante.
- Premere leggermente sul contorno occhi per congestionare e sporgere i bulbi oculari.
- Usa le forbici per tagliare i baffi del topo per prevenire l'emolisi causata dai peli.
- Confermare la profondità dell'anestesia controllando l'assenza di un riflesso del pedale in risposta a un pizzicamento del dito del piede. Usa una pinza per afferrare il bulbo oculare e rimuoverlo rapidamente, consentendo al sangue di fluire in una provetta da microcentrifuga dall'orbita oculare.
NOTA: È possibile utilizzare anche metodi alternativi di raccolta del sangue, come la puntura cardiaca. - Quando la velocità di gocciolamento del sangue rallenta, premere delicatamente sull'area cardiaca del topo per accelerare il pompaggio del sangue e ottenere più sangue. Quindi, sopprimere il topo usando la lussazione cervicale.
- Tieni la gamba appena sopra l'articolazione della caviglia usando le pinze nella mano non dominante. Quindi, taglia la gamba appena sopra l'articolazione della caviglia usando le forbici.
8. Analisi istologica
- Immergere i campioni di caviglia in paraformaldeide al 4% per più di 24 ore. Decalcificare in EDTA al 10% (pH = 7,4) per 1 mese.
- Immergere i campioni in paraformaldeide al 4% per 2 ore.
- Quindi, immergere i campioni in un gradiente di concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%). Immergere ogni concentrazione di etanolo per 1 ora.
- Immergere i campioni in xilene per 3 ore.
- Immergere i campioni di caviglia in paraffina per 7 ore. Mettere da parte i blocchi di paraffina in frigorifero a 4 °C.
- Affettare i blocchi di paraffina fino a uno spessore di 6 μm utilizzando una sezionatrice semiautomatica per paraffina.
- Immergere le fette per 4 x 5 minuti nello xilene per completare la deceratura.
- Immergere le fette in un gradiente di concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 100%, 95%, 75%) per 2 minuti ciascuna. Immergere in acqua distillata per 2 min.
- Colorare le fette con ematossilina per 10 minuti e risciacquare con acqua distillata per 5 secondi.
- Immergere le fette per 30 secondi nel liquido di differenziazione e risciacquare con acqua distillata per 5 secondi.
- Colorare le fette con eosina per 1 minuto e sciacquare con acqua distillata per 3 minuti.
- Immergere le fette in un gradiente di concentrazioni crescenti di etanolo (80%, 95%, 100%, 100%) per 1 minuto ciascuna. Immergere nello xilene per 3 x 3 minuti e sigillare le fette25.
9. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
- Misurare le concentrazioni plasmatiche di IL-17 e TNF-α utilizzando i rispettivi kit secondo le istruzioni del produttore.
10. Analisi statistica
- Esprimere i dati come media ± errore standard della media (SEM).
- Determinare la significatività attraverso l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) o l'ANOVA a misure ripetute a due vie, seguite dai test post hoc di Bonferroni o Tamhane T2.
- Si consideri statisticamente significativo P < 0,05.
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Representative Results
I topi modello indotti da PG hanno sviluppato sintomi di artrite periferica, caratterizzata da arrossamento e gonfiore delle estremità e delle dita dei piedi, e hanno gradualmente sviluppato l'artrite assiale già alla settimana 14, che è molto simile alla manifestazione dell'AS. Pertanto, il modello murino AS è stato considerato efficace se l'indice di artrite (AI) era superiore a 3 punti a 14 settimane dopo l'ultima iniezione22. Quando le zampe dei topi apparivano gonfie, il trattamento Du-moxibustione è stato effettuato una volta alla settimana per un totale di 3 volte. Dopo il trattamento, i topi sono stati soppressi mediante lussazione cervicale in anestesia profonda con isoflurano, il loro sangue è stato raccolto e le caviglie sono state asportate.
Effetti della Du-moxibustione sulla coodinazione motoria e sul movimento autonomo
L'AS indotta da PG bovina è stata adottata come modello per osservare l'effetto della Du-moxibustione al meridiano Du sulla coordinazione motoria. Inizialmente, il punteggio di gonfiore articolare è stato utilizzato per valutare se il modello avesse successo e la coordinazione motoria e il movimento autonomo sono stati valutati utilizzando il test rotarod e l'OFT.
La valutazione dell'IA ha determinato la gravità dell'artrite periferica. Dopo la modellazione, l'ANOVA a misure ripetute a due vie ha rivelato che i punteggi di gonfiore articolare nel modello e nei gruppi Du-moxibustione sono significativamente aumentati rispetto a quelli nel gruppo di controllo prima della Du-moxibustione (P < 0,01; Figura 6A). Il trattamento con Du-moxibustione ha ridotto i punteggi di gonfiore articolare rispetto a quelli del gruppo modello dopo il trattamento con Du-moxibustione (P < 0,05; Figura 6A).
Il test rotarod è stato utilizzato per valutare la coordinazione motoria e l'equilibrio. L'ANOVA a misure ripetute a due vie ha rivelato differenze significative nel tempo (F = 13,928, P = 0,000 < 0,05) e gli effetti di interazione del tempo e del gruppo (F = 12,583, P = 0,000 < 0,05). Dopo la modellazione, il tempo di latenza del gruppo di controllo non era diverso da quello precedente alla modellazione. Tuttavia, dopo la modellazione, i tempi di latenza del modello e dei gruppi Du-moxibustione sono diminuiti significativamente rispetto a quelli del gruppo di controllo (P < 0,01; Figura 6B) e non ci sono state differenze significative tra il gruppo modello e il gruppo Du-moxibustione (P > 0,05; Figura 6B). Dopo il trattamento, il tempo di latenza del gruppo Du-moxibustione è aumentato significativamente rispetto a quello del gruppo modello (P < 0,05; Figura 6B). Questi risultati hanno indicato che la du-moxibustione era efficace nel migliorare la coordinazione motoria nei topi AS.
L'OFT è stato eseguito per rilevare il movimento autonomo. I parametri sono stati raccolti e analizzati automaticamente utilizzando il software (Figura 6C-E); La distanza totale e la velocità media sono state osservate principalmente in questo studio. Non c'era alcuna differenza significativa nella distanza totale e nella velocità media tra i gruppi prima della modellazione (P > 0,05; Figura 6C,D). Dopo la modellazione, la distanza totale e la velocità media si sono ridotte significativamente rispetto al gruppo di controllo (P < 0,05; Figura 6C,D). Dopo il trattamento, la distanza totale e la velocità media del gruppo Du-moxibustione sono aumentate significativamente rispetto a quelle del gruppo modello (P < 0,05; Figura 6C,D). Questi risultati hanno indicato che la du-moxibustione era efficace nel migliorare il movimento autonomo nei topi AS.
Effetti della Du-moxibustione sulla patologia dell'articolazione della caviglia
La colorazione HE è stata utilizzata per osservare i cambiamenti patologici nell'articolazione della caviglia. Nel gruppo di controllo, non c'è stato alcun danno alla struttura della sinovia, nessuna congestione nella sinovia e nessuna evidente infiltrazione e necrosi delle cellule infiammatorie. Tuttavia, nel gruppo modello, sono state osservate iperplasia e infiltrazione di sinovia nella cavità articolare, oltre all'infiltrazione di cellule infiammatorie e all'edema tissutale. In combinazione con la valutazione dell'IA, è stato dimostrato che il modello AS è stato stabilito con successo. Rispetto al gruppo modello, la sinovia dei topi nel gruppo Du-moxibustione era più intatta, l'edema interstiziale era ridotto e la cartilagine articolare era relativamente intatta (Figura 7).
Effetti della Du-moxibustione sui livelli plasmatici di IL-17 e TNF-α
L'ELISA è stato eseguito per misurare IL-17 e TNF-α nel plasma. I livelli plasmatici di IL-17 e TNF-α del gruppo modello sono risultati significativamente aumentati rispetto a quelli del gruppo di controllo (P < 0,01; Figura 6F,G). La du-moxibustione ha ridotto i livelli plasmatici di IL-17 e TNF-α (P < 0,05; Figura 6F,G).
Figura 1: Le materie prime necessarie per la du-moxibustione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Realizzazione di un cono di moxa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Preparare l'acqua allo zenzero e creare una colonna trapezoidale di zenzero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Posizione di GV14 e GV2 nel topo. (A) GV14 localizzato nel processo sottospinoso della settima vertebra cervicale; GV2 situato nel canale iato sacrale. (B) Diagramma schematico della moxibustione Du sul topo. (C) Area stimolata di Du moxibustione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Procedura operativa della Du-moxibustione nel topo. (A) Radersi i peli e spalmare il succo di zenzero sul topo in posizione prona. (B,C) Cospargere uniformemente la polvere di MTC. (D) Coprire la polvere con carta di gelso. (E) Fissare saldamente la colonna di zenzero sulla carta di gelso. (F) Metti un cono di moxa sulla colonna di zenzero; Quindi, accendilo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Effetti della du-moxibustione sulla coordinazione motoria, sul movimento autonomo e sui livelli di IL-17 e TNF-α. (A) I punteggi di gonfiore articolare nei topi. (B) Il tempo di latenza nel test rotarod. (C-E) Distanza totale, velocità media e diagramma della traccia di OFT. (F) Livelli plasmatici di IL-17. (G) Livelli di TNF-α nel plasma. I valori sono espressi come media ± SEM (n = 6). ##P < 0,01, #P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo; $$P < 0,01, $P < 0,05 rispetto al gruppo di modelli. Abbreviazioni: IL = interleuchina; TNF = fattore di necrosi tumorale; OFT = test in campo aperto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Colorazione HE dell'articolazione della caviglia. (A) La cavità articolare era liscia senza infiltrazioni infiammatorie nel gruppo di controllo. (B) Nel gruppo modello, sono state osservate iperplasia e infiltrazione della sinovia nella cavità articolare. (C) Nel gruppo Du-moxibustione, la cavità articolare dei topi era liscia e l'edema era alleviato. Barre di scala = 200 μm. Abbreviazione: HE = ematossilina-eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La SA si manifesta clinicamente con dolore alla schiena, lombare e articolare e nei casi più gravi possono verificarsi deformità della colonna vertebrale e rigidità articolare26. La diagnosi e il trattamento precoci possono migliorare la qualità della vita, ridurre i tassi di disabilità e migliorare la prognosi dei pazienti con AS. Secondo la medicina tradizionale cinese (MTC), si ritiene che la SA sia causata da una carenza di Yang nel rene e nel meridiano Du, nonché da un accumulo di male freddo internamente. La MTC sostiene l'idea che la moxibustione, basata sul concetto di meridiani, possa generare Qi che riscalda la superficie del corpo. Questo Qi viaggia poi verso il basso lungo i meridiani e i punti di agopuntura. Nel Canone Interno di Huangdi (un capolavoro molto classico e importante della MTC), è registrato che "il meridiano di Du malato viene trattato". Poiché l'AS si trova nel meridiano Du, la stimolazione del meridiano Du viene utilizzata come punto terapeutico. Il meridiano Du è considerato l'oceano dei canali Yang dove lo Yang Qi raggiunge il suo apice. La moxibustione sul meridiano Du può integrare il qi Yang, attivare l'effetto del meridiano Du e regolare l'effetto riscaldante dello Yang renale, cioè migliorare la funzione di regolazione immunitaria della medicina occidentale.
Dal punto di vista della medicina occidentale, il midollo spinale svolge un ruolo importante nella trasmissione delle informazioni neurali. Du moxibustione, che agisce sull'ingresso e l'uscita delle radici nervose spinali, può influenzare la funzione e il meccanismo di regolazione del sistema nervoso attraverso la regolazione dei neurotrasmettitori. Negli anni '90, è stato dimostrato che la Du-moxibustione aumenta il contenuto di β-endorfine nell'ipotalamo dei ratti, avendo così un effetto analgesico centrale7. Inoltre, l'entesite è una complicanza comune della SA, caratterizzata da dolore persistente e rigidità muscolare, che può influenzare il movimento articolare e del corpo quando è grave. Come metodo di trattamento della MTC che è stato clinicamente convalidato, la du-moxibustione può alleviare efficacemente l'infiammazione, promuovere la riparazione dei tessuti e migliorare l'entesite nel trattamento della SA.
Nello specifico, gli effetti dell'agopuntura e della moxibustione si riflettono principalmente nei seguenti aspetti. In primo luogo, favoriscono la circolazione sanguigna e l'assorbimento dell'infiammazione. La du-moxibustione stimola la circolazione sanguigna e il metabolismo nei tessuti che circondano la colonna vertebrale attraverso l'effetto riscaldante e promuove l'assorbimento dell'infiammazione e la riparazione dei tessuti, riducendo così il grado di infiammazione e il dolore dell'infiammazione dell'attacco del tendine. In secondo luogo, migliorano la tensione muscolare e legamentosa. L'effetto di stimolazione della Du-moxibustione può migliorare la tensione muscolare intorno alla colonna vertebrale, rilassare i tessuti molli induriti, promuovere l'attività delle articolazioni spinali e ridurre il dolore e la rigidità causati dalla tensione muscolare e dall'allungamento dei legamenti. In sintesi, la Du-moxibustione, come terapia aggiuntiva, può regolare in modo completo le attività del sistema nervoso, immunitario e circolatorio del corpo agendo sulla regione spinale, rendendo il corpo più equilibrato nel suo insieme.
L'infiammazione è la principale manifestazione della SA27. Il TNF-α è una citochina multieffettore e un fattore infiammatorio prodotto sotto la stimolazione dei macrofagi mononucleati28. L'attività dell'ALP e la sintesi del collagene possono essere inibite dal TNF-α, con conseguente perdita ossea e distruzione della cartilagine29. Negli ultimi anni, gli studi hanno scoperto che l'IL-17 svolge un ruolo importante nella patogenesi della SA, che è stata pienamente dimostrata in una revisione30. IL-17 può agire direttamente sugli osteoblasti, promuovere l'espressione del ligando attivatore del recettore del fattore di trascrizione nucleare-κB (NF-κB) (RANKL) e promuovere la robusta generazione di osteoclasti. Allo stesso tempo, l'IL-17 colpisce anche le cellule staminali mesenchimali (MSC), inducendone la proliferazione e promuovendo la loro differenziazione in osteoblasti31. Kenna32 et al. hanno scoperto che il livello di IL-17 nel sangue periferico dei pazienti con SA è aumentato di quasi due volte rispetto ai controlli sani. Lo studio suggerisce che gli antagonisti dell'IL-17 possono essere una nuova opzione per i pazienti con SA che non rispondono bene agli antagonisti del TNF-α33. Uno studio clinico ha dimostrato che un regime posologico di antagonisti dell'IL-17 era superiore a un placebo per migliorare i segni e i sintomi radiografici della spondiloartrite assiale nei pazienti34. I risultati di questo studio hanno mostrato che i livelli plasmatici di TNF-α e IL-17 nel gruppo modello erano significativamente più alti di quelli nel gruppo di controllo e i livelli plasmatici di TNF-α e IL-17 erano significativamente diminuiti dopo il trattamento con Du-moxibustione.
La terapia della du-moxibustione utilizza abilmente le tecniche compatibili della MTC per integrare meridiani, agopunti, fitoterapia cinese e moxibustione. Le materie prime della terapia di Du-moxibustione includevano principalmente velluto di moxa, zenzero e polvere di MTC. Dal punto di vista della MTC, il velluto di moxa, un prodotto trasformato dell'artemisia, ha la funzione di attivare i collaterali, dissipare il freddo e alleviare il dolore. Lo zenzero svolge un ruolo nell'alleviare i sintomi esterni e dissipare il raffreddore. La ricerca moderna mostra anche che lo zenzero ha proprietà antinfiammatorie e analgesiche35. Pulire la pelle con succo di zenzero prima del trattamento aiuta ad aprire i pori e promuovere la permeazione transdermica36, oltre ad aiutare la polvere MTC ad aderire alla pelle. La colonna trapezoidale di zenzero è saldamente fissata sul retro per fornire una solida base per il cono di moxa. Dopo la combustione del cono di moxa, gli effetti della potenza di fuoco, dello zenzero e della polvere di MTC lavorano insieme sul meridiano Du. In considerazione della patogenesi della carenza di Yang in questa malattia, la Du-moxibustione agisce direttamente sul sito della malattia, riscaldando i meridiani, disperdendo il freddo, integrando Yang Qi ed essenza, promuovendo la circolazione sanguigna e bilanciando Yin e Yang per trattare la radice della malattia.
Quando si esegue la du-moxibustione, è necessario considerare diversi dettagli. In primo luogo, il sito dell'operazione di Du-moxibustione è fisso, dal punto Dazhui (GV14) al punto Yaoshu (GV2) (anatomicamente dal 7° processo spinoso della colonna vertebrale cervicale alla vertebra della coda, compresa l'intera colonna vertebrale), che è coerente con il sito di incidenza di AS (Figura 4). In secondo luogo, l'umidità e lo spessore dello zenzero sono importanti. Il succo di zenzero in eccesso deve essere spremuto dopo che lo zenzero è stato trasformato in fango di zenzero in modo che il fango di zenzero non abbia sensazione granulare e il suo spessore sia appropriato per essere trasformato nella colonna trapezoidale di zenzero. L'elevata umidità e l'umidità nel fango di zenzero possono facilmente ostacolare la penetrazione del fuoco di moxibustione e ridurre la quantità di stimolazione della moxibustione. Se la materia prima dello zenzero è troppo secca e le particelle sono troppo grandi, è difficile realizzare la colonna trapezoidale dello zenzero, portando a una rapida penetrazione del calore e alla scottatura della pelle. In terzo luogo, è necessario considerare le dimensioni e la compattezza del cono di moxa. I coni di moxa utilizzati per la moxibustione nei topi sono lunghi ~4 cm e hanno un diametro di 0,5 cm e devono essere stretti al momento della preparazione. Un test per la tenuta è quando il cono non si srotola anche dopo essere caduto su una superficie. Se il cono di moxa non è abbastanza compatto, porterà a una riduzione della quantità di velluto di moxa, a un tempo di combustione più breve e a una riduzione della potenza di fuoco. In quarto luogo, quando si accende il cono di moxa, la testa, il centro e la coda del cono di moxa devono essere accesi con incenso fine per far bruciare lentamente il cono di moxa per ottenere l'effetto nutriente del flusso e riflusso. In quinto luogo, il muschio è un ingrediente importante nella polvere medicinale della moxibustione. Il secondo giorno dopo la moxibustione, dovrebbero esserci vesciche cristalline come piccole perle sul meridiano Du.
Un gran numero di studi clinici ha confermato la certa efficacia della Du-moxibustione nel trattamento della SA 4,5,6. Tuttavia, la ricerca sul suo meccanismo d'azione negli esperimenti sugli animali progredisce lentamente. Attraverso la ricerca e l'innovazione, anni di esperienza nel funzionamento della Du-moxibustione ci hanno portato a studiarne l'utilizzo negli esperimenti sui topi. Questo articolo descrive in dettaglio le procedure operative e le precauzioni della Du-moxibustione nel trattamento della SA nei topi sperimentali. Inoltre, è stato osservato l'effetto della moxibustione sulla coordinazione motoria e sui livelli plasmatici di TNF-α e IL-17 nei topi AS. Questo studio ha fornito la base sperimentale di base per lo studio del meccanismo della Du-moxibustione nel trattamento della SA. Ci sono ancora alcune limitazioni a questo studio. Ad esempio, in studi futuri, presteremo attenzione alla valutazione di diversi parametri come la moxibustione placebo, la dose, l'intervallo e il tempo di trattamento per ottenere gli schemi di combinazione più efficaci. In studi successivi, i metodi di imaging possono essere utilizzati per valutare i risultati del trattamento in modo più intuitivo.
Le prospettive applicative della terapia di Du-moxibustione sono promettenti. Il meridiano Du, noto come Vaso Governatore, svolge un ruolo cruciale nella regolazione del flusso di Qi e sangue in tutto il corpo. La moxibustione, una terapia tradizionale cinese, prevede la combustione dell'artemisia su specifici agopunti per stimolare i meridiani e favorire il meccanismo di autoguarigione del corpo. Rispetto all'agopuntura, la du-moxibustione è una combinazione di varie tecniche che agiscono sulla superficie corporea, che ha le caratteristiche di comfort e un forte e ampio raggio d'azione. Inoltre, la terapia della Du-moxibustione si concentra sulla schiena e sull'area spinale, prendendo di mira il percorso del meridiano Du. Può migliorare il sistema immunitario del corpo, migliorare la circolazione sanguigna e alleviare varie condizioni fisiche e mentali. La terapia ha dimostrato la sua efficacia nel trattamento di malattie come disturbi muscoloscheletrici, condizioni neurologiche, disturbi ginecologici e problemi di salute mentale. Con i progressi della ricerca e della tecnologia, si prevede che l'applicazione della terapia di Du-moxibustione si espanderà ulteriormente. Studi futuri potrebbero esplorare il suo potenziale in aree come la gestione del dolore, la riduzione dello stress, i disturbi digestivi e le condizioni respiratorie. La combinazione delle conoscenze tradizionali e delle moderne conoscenze scientifiche potrebbe portare a una migliore integrazione della terapia della Du-moxibustione nelle pratiche sanitarie tradizionali. In conclusione, la terapia della du-moxibustione è molto promettente nella sua applicazione e integrazione in vari campi sanitari. Ulteriori ricerche, studi clinici e collaborazione tra i professionisti della medicina tradizionale cinese e i moderni professionisti sanitari sono essenziali per sbloccare il suo pieno potenziale.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Generale della Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (No.82174491) e dalla Qilu School of Traditional Chinese Medicine Academic School Inheritance Project (No. Lu Weihan [2020]132). Grazie al Laboratory Animal Center dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shandong per averci fornito le condizioni sperimentali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% EDTA | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| alcohol pads | HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China | ||
| anesthesia machine | Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK | ||
| centrifuge tubes | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| complete Frech's adjuvant (CFA) | aladdin,Shanghai, China | F393378 | |
| cotton ball | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cotton gauze | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cutting board | self-preparation | ||
| decorin from bovine articular cartilage | Sigma-Aldrich, MO, USA | D8428 | |
| depilatory cream | Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China | ||
| electronic scale | Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| Eppendorf tube | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| eye lubricant | Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China | ||
| ginger | self-preparation | ||
| GraphPad Prism 7 software | GraphPad Software,Boston, USA | ||
| hair clipper | Super human Group CO LTD, Jinhua, China | ||
| heating pads | Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China | ||
| incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | aladdin,Shanghai, China | F393371 | |
| injection syringe | Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China | ||
| isoflurane | Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China | R510-22-10 | |
| joss stick | Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China | ||
| juicer | Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| knife | self-preparation | ||
| lighter | Zhejiang tiger-lighter Co. LTD | ||
| mortar | Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China | ||
| Mouse IL-17 ELISA Kit | absin, Shanghai, China | abs520009-96T | |
| Mouse TNF-α ELISA Kit | Wuhan Sanying, Wuhan, China | KE10002 | |
| mulberry paper | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China | ||
| OFT | Xinruan,Shanghai, China | XR-XZ301 | |
| paper cup | self-preparation | ||
| pipettes | OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK | ||
| refined moxa velvet | self-preparation | ||
| rotarod | Xinruan,Shanghai, China | XR-6C | |
| scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder | Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD | ||
| scissors | Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China | ||
| semi-automatic paraffin sectioning machine | Leica Camera AG, Watznach, Germany | ||
| SPSS 25.0 software | International Business Machines Corporation, NewYork, UAS | ||
| TCM powder | self-preparation | ||
| tips | Biosharp, Labgic, Beijing, China | ||
| writing brush | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China |
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