Summary
이 논문은 실험용 마우스의 강직성 척추염 치료에서 Du-moxibustion 동안 취해야 할 수술 절차와 예방 조치를 자세히 설명합니다.
Abstract
강직성 척추염(AS)은 주로 축 골격에 영향을 미치는 점진적으로 악화되고 무력화되는 형태의 관절염입니다. 이 질병은 주로 척추와 천장관절을 침범한다. 말기에는 척추와 천장관절의 유합이 일어나 척추 경직과 후만증, 보행의 어려움 등이 발생할 수 있으며, 이는 업무의 질과 일상생활에 심각한 영향을 미치고 환자와 가족, 사회에 큰 부담을 줍니다. AS의 대체 요법으로 비약물 요법에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 뜸은 중국 전통 의학(TCM)에서 사용되는 고대 치료 기법입니다. 듀뜸 요법은 일반 뜸을 기반으로 개발된 독특하고 혁신적인 외부 치료법으로 AS에 확실한 치료 효과가 있습니다. Du-moxibustion은 TCM의 호환 기술을 능숙하게 결합하여 경락, 경혈, 한약 및 뜸을 통합합니다. 본 논문은 AS의 치료에서 Du-moxibustion의 메커니즘 연구를 위한 실험적 기초를 제공하기 위해 실험용 마우스에서 Du-moxibustion 동안 취해야 할 수술 절차 및 주의사항을 자세히 설명합니다.
Introduction
강직성 척추염(AS)은 주로 축 골격에 영향을 미치는 점진적으로 악화되고 무력화되는 형태의 관절염입니다. 최신 역학 조사에 따르면, 전 세계 인구의 ~0.01%-1.8%가이 질환을 앓고 있으며1, 그 중 대부분은 젊은 남성입니다(남녀 비율은 ~2-3:1)2. 중국 인구의 AS 발생률은 0.2%-0.4%입니다. 이 질병은 주로 척추와 천장관절을 침범한다. 말기에는 척추와 천장관절의 유합이 일어나 척추 경직과 후만증, 보행의 어려움 등이 발생할 수 있으며, 이는 업무의 질과 일상생활에 심각한 영향을 미치고 환자와 가족, 사회에 큰 부담을 준다1. 현재 AS에 대한 확실한 해결책은 없으며, 제공되는 약리학적 및 비약물적 치료법은 주로 통증 완화, 질병 진행 지연 및 삶의 질 향상에 중점을 둡니다. 최근 몇 년 동안 약물 요법 옵션이 매우 제한적이었기 때문에3 AS의 대체 요법이 된 비약물 요법에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 중국에서는 환자들이 종종 중국 전통 의학(TCM)으로 구성된 외부 치료를 선호하는데, 이는 부작용이 적고 치료 중 편의성이 매우 높습니다.
뜸은 한의학에서 사용되는 고대 치료 기법입니다. Du-moxibustion은 Du meridian의 척추 분절에 "거품이 있는 약용 뜸"으로 구성된 외부 치료 기술입니다. 주로 AS 치료에 사용되며 안전성과 효과를 보여주었습니다. 일반 뜸에 비해 두뜸은 넓은 뜸 면적, 큰 뜸 원뿔, 강한 화력 및 고온4의 특성을 가지고 있습니다. 체계적 문헌고찰 및 메타 분석에 따르면 뜸은 AS5에 대한 효과적인 보완 치료법이다. 최근 연구에 따르면 AS 환자의 임상 증상과 일부 염증 요인이 뜸에 의해 개선되는 것으로 확인되었다6. 연구에 따르면 듀뜸은 뇌에서 β-엔돌핀의 함량을 증가시키고 중추 진통 효과를 발휘하며7 HLA-B27 유전자의 발현을 하향 조절하고8 AS의 재발률을 지연시킬 수 있다. Du-moxibustion은 또한 염증 지수 ESR(ESR)과 C-반응성 단백질(CRP), I형 콜라겐의 C-말단 펩타이드(CTX-I) 및 Dickkopf1 단백질(DKK1)9,10의 수준을 감소시켜 AS의 진행을 개선하는 효과가 있습니다.
또 다른 임상 연구에서는 Du-moxibustion이 무질서한 T 세포 하위 집합인 Ig를 추가로 조정하고 C3를 보완하여 면역 메커니즘의 균형을 맞출 수 있음을 보여주었습니다11. 뼈 대사 측면에서 뜸은 혈청 알칼리성 인산가수분해효소(ALP)와 혈청 인(S-P)의 증가를 억제하고 혈청 칼슘(S-Ca), 골밀도(BMD) 및 골강도를 증가시킬 수 있다12. 또한, 두뜸은 여러 지점에서 척추 기능을 회복시켜 AS 환자의 피로 증상을 완화할 수 있다13. 일부 동물 연구에서는 AS를 치료하는 데 있어 뜸의 잠재적 메커니즘이 밝혀졌습니다. 한 연구에 따르면 뜸은 척추의 인대 조직 샘플에서 전반적인 건강 상태를 크게 개선하고 발 두께를 줄이며 IL-1β, PGE2, IL-6 및 TNF-α 수치를 감소시키는 것으로 나타났습니다. 대사 경로 분석은 확인된 대사 산물을 TCA 회로뿐만 아니라 지질, 아미노산, 장내 세균총 및 퓨린 대사와 연결시켰다14. 또 다른 연구에 따르면 뜸은 전염증성 사이토카인, IL-1β, TNF-α, IL-17 및 IL-6의 발현을 억제했습니다. RANKL, RANK, ALP 및 OCN의 mRNA 수준을 감소시켰습니다. AS 마우스15에서 조직병리학적 특징을 개선하였다.
이러한 연구는 뜸이 AS 치료에 효과적일 수 있음을 시사하지만, 이러한 결과를 확인하고 AS 환자의 뜸에 대한 최적의 치료 프로토콜을 결정하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 우리 팀은 35년 이상 중국 임상 실습에서 널리 수행되고 적용되어 온 중국 전통 뜸의 기본 이론과 실제 작동을 기반으로 뜸 요법을 만들고 수정했습니다. 듀뜸에 의한 AS 치료에 대한 양질의 연구는 거의 없지만, AS의 치료에 대한 적응증은 증거에 의해 뒷받침되었습니다. 그러나 Du-moxibustion으로 AS를 치료하는 메커니즘은 추가 연구가 필요합니다. 동물 연구는 AS 치료에서 Du-moxibustion의 메커니즘을 탐구하는 중요한 방법입니다. Du-moxibustion의 임상 운영은 비교적 성숙하지만 동물 실험에서 메커니즘 연구에 거의 사용되지 않습니다. 이 논문은 AS 실험 마우스의 처리에서 Du-moxibustion 동안 취해야 할 작동 및 예방 조치에 대해 자세히 설명합니다.
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Protocol
모든 동물실험은 산둥중의학대학 실험동물복지윤리심의위원회의 승인을 받았다(No. SDUTCM20230831301).
1. 동물 준비
- 실험군과 집단당 동물의 수를 미리 결정한다.
- 수컷 BALb/c 마우스를 선택하여 22 ± 1 °C의 일정한 온도, 60 ± 5%의 일정한 습도 및 12시간의 일주기 조명 환경에서 보관합니다.
2. AS 마우스 모델 구축
참고: AS 모델은 고전적인 모델링 방법 16,17,18,19,20,21인 연골 프로테오글리칸(PG)으로 유도되었습니다. BALB/c 균주 마우스를 PG로 반복적으로 면역시켜 건염 및 척추염을 유발했습니다. 이 프로토콜에 사용된 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- 200μL 피펫을 사용하여 200μL의 PG 및 CFA(또는 IFA)를 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 원심분리기 튜브에 있는 액체를 섞기 위해 부드럽게 흔듭니다.
- 균질화를 위해 원심분리기 튜브를 조직 분쇄기에 넣은 다음 얼음 위에서 4분 동안 배양합니다. 티슈 그라인더에서 다음 매개변수를 설정합니다: 60Hz, 연삭 30초, 간격 10초 동안 총 6사이클.
- 1mL 주사기로 원심분리 튜브에서 0.2mL의 유화된 PG 단백질을 추출합니다.
- 왼손으로 마우스를 잡고 고정합니다. 주사기를 삽입할 때 복부 장기가 손상되지 않도록 머리를 꼬리보다 낮게 유지하면서 마우스를 누운 자세로 눕힙니다.
- 오른손을 사용하여 알코올 면봉으로 복부를 소독합니다.
- 오른손에 주사기를 들고 바늘을 복부 하반부에 있는 복부(linea alba ventralis)의 왼쪽 또는 오른쪽으로 약간 피하 삽입합니다.
- 바늘을 복부 중간선과 평행하게 피하 3-5mm 밀어 넣은 다음 바늘을 피부에 대해 45° 각도로 복강에 밀어 넣습니다.
- 복막에 침투하여 바늘 플러그를 빼고 유화 된 PG 단백질을 천천히 주입합니다.
3. 두뜸
알림: Du-moxibustion을 위한 가장 중요한 세 가지 원료를 미리 준비하십시오(그림 1).
- 뜸 콘을 준비합니다. 두 손바닥이 반대 방향을 향하도록 벨벳을 손에 들고 비틀림 힘을 가하여 벨벳을 스핀들 모양으로 문지릅니다(그림 2)
- 생강을 작은 조각으로 자르고 착즙기에 넣어 퓌레로 만듭니다(그림 3). 생강 퓌레를 면 거즈로 걸러냅니다. 생강 퓌레에서 생강 주스와 생강 진흙을 분리하여 다음 단계를 준비합니다.
- 생강 진흙 10g과 생강즙 20mL를 준비하여 나중에 사용할 수 있도록 종이컵에 담습니다.
- TCM 분말(계피 분말, 정향 분말, 노토페리지움 분말, 안타리딘 분말 및 인공 사향의 혼합물)22 0.1g의 무게를 달고 절구에 갈아 넣습니다.
- 마우스를 동물 마취 기계의 마취 유도 상자에 넣고 2L/min의 유속으로 2-3% 이소플루란과 산소의 혼합물로 마취합니다.
- 초기에 놀람 반사가 없는지 관찰하여 마취 깊이를 평가하고 부드러운 발가락 꼬집기에 반응하여 페달 반사가 없는지 확인하여 수술 마취 수준을 확인합니다.
- 마우스가 수술면 마취에 도달한 후 상자에서 꺼내 엎드린 자세로 수술대에 고정합니다. 마우스의 입과 코를 마취제의 배출구에 맞춥니다.
- 마취 기계에 부착된 마스크를 통해 마취를 투여하고, 이를 통해 이소플루란과 산소가 비재호흡 회로를 통해 전달됩니다. 마취를 유지하고 전체 수술 절차 동안 마우스를 37°C 가열 패드에 유지하십시오. 건조를 방지하기 위해 눈에 윤활제를 바르십시오.
- 경혈을 찾아 자극 부위를 확인합니다(그림 4).
- 쥐 뒷면의 살색 피부가 보일 때까지 쥐 뒷면의 털을 면도합니다. 제모 너비가 ~1.5cm이고 길이가 일곱 번째 경추에서 꼬리 척추까지인지 확인합니다(그림 5A).
- 면도 부위에 면봉으로 준비한 생강즙을 면도 부위에 바릅니다(그림 3).
- 마우스 뒷면의 중앙선에 붓으로 TCM 가루를 골고루 뿌리고 뽕나무 종이로 덮습니다(그림 5B-D).
- 생강 진흙으로 길이 6cm, 너비 1.5cm, 두께 3mm의 사다리꼴 생강 기둥을 만듭니다. 뽕나무 종이에 생강 기둥을 고정합니다(그림 5E).
- 생강 기둥의 정중선 위에 홈을 만들고(그림 3) 생강 기둥에 뜸쑥 콘을 놓습니다.
- 뜸 원뿔에 불을 붙이고 이전 원뿔이 타버린 후 새 뜸 원뿔을 놓습니다. 마우스가 타는 것을 방지하기 위해 생강 기둥의 견고성을 확인하여 총 3개의 원뿔을 태웁니다(그림 5F).
- 뜸쑥 콘을 태운 후 생강과 TCM 가루를 닦아내고 마우스 뒷면을 청소합니다. 이 시점에서 마취를 중단하십시오.
- 쥐가 음식과 물에 제한 없이 접근할 수 있는 새 케이지에서 의식을 되찾을 수 있도록 합니다. 회복 과정을 돕기 위해 가열된 패드에 케이지를 놓습니다. 동물이 충분한 의식을 회복할 때까지 관찰하십시오.
- 마우스가 완전히 회복되면 일반 하우징으로 되돌리기 전에 오른쪽 반사의 존재를 확인하십시오.
알림: 수술 중에는 약한 호흡을 피하기 위해 쥐의 정신 상태를 모니터링해야 합니다. 화상을 입지 않도록 하되 쥐를 따뜻하게 유지하고 발톱과 꼬리에 멍이 들지 않도록 하십시오.
4. 관절염 지수(AI) 평가
- AI 점수를 모델링 전, 모델링 후, 처리 후의 세 번 평가합니다. 평가 기준은 다음과 같습니다 : 0, 발적이나 부종이 없습니다. 1, 몇 개의 발가락에 약간의 발적 또는 부기; 2, 대부분의 발가락 관절과 발가락의 발적과 부기; 3, 발과 발목 관절 아래의 심각한 발적 및 부종; 4, 발과 발목 관절의 발적 및 부종23.
- 최대값 16으로 네 발 모두의 AI 점수를 계산합니다.
5. 로타로드 테스트
알림: 회전 테스트는 마우스가 회전 드럼에서 보내는 시간을 기록하여 운동 조정과 균형을 평가하는 데 사용됩니다. 이 실험은 20분 간격으로 3번의 시행으로 구성되었습니다. 공식 테스트 데이터는 세 번째 실험에서 기록되었으며, 처음 두 번은 훈련 연습으로 사용되었습니다.
- 마우스를 300초24에 걸쳐 4에서 40rpm까지 연속 가속도로 회전하는 회전 드럼 위에 놓는다.
- 대기 시간(마우스가 로드에서 떨어질 때까지의 시간)을 측정합니다. 패딩이 떨어질 때 부상을 방지하기 위해 패딩을 제공하십시오.
6. 오픈 필드 테스트(OFT)
알림: OFT는 병리학적 행동을 식별하기 위해 자율 운동 상태를 평가하는 데 사용됩니다. 4 개의 정사각형 오픈 필드 경기장 (50cm x 50cm x 40cm)을 함께 배치하여 장치를 형성했습니다. 상자의 바닥은 9개의 동일한 사각형으로 나뉘어져 있습니다.
- 실험실의 배경 소음을 65dB 미만으로 제어합니다.
- 각 시도 전에 75% 에탄올로 전체 장치를 닦으십시오.
- 모든 마우스를 테스트 1시간 전에 시험실에 두어 환경에 적응할 수 있도록 합니다.
- 정사각형 야외 경기장에 쥐를 놓고 10분 동안 탐험하게 합니다.
- 10분 동안 총 거리와 이동 속도를 기록합니다.
7. 안락사 및 검체 채취
- 마우스를 마취 유도 상자에 넣고 2L/min의 유속으로 2-3% 이소플루란과 산소의 혼합물로 마취합니다. 마우스가 페달 반사 부족으로 확인된 깊은 마취 상태에 들어가면 유지 마취를 위해 수술대로 옮깁니다.
- 자주 사용하지 않는 손으로 마우스를 잡고 고정합니다.
- 눈가를 가볍게 누르면 안구가 울혈되어 튀어나오게 됩니다.
- 머리카락으로 인한 용혈을 방지하기 위해 가위를 사용하여 쥐의 수염을 다듬습니다.
- 발가락 꼬집음에 대한 반응으로 페달 반사가 없는지 확인하여 마취 깊이를 확인합니다. 겸자를 사용하여 안구를 잡고 신속하게 제거하여 혈액이 안와에서 미세 원심분리기 튜브로 흐르도록 합니다.
알림: 심장 천자와 같은 대체 혈액 수집 방법도 사용할 수 있습니다. - 혈액 방울 속도가 느려지면 쥐의 심장 부위를 부드럽게 눌러 혈액 펌핑 속도를 높이고 더 많은 혈액을 얻습니다. 그런 다음 자궁 경부 탈구를 사용하여 쥐를 안락사시킵니다.
- 주로 사용하지 않는 손의 집게를 사용하여 발목 관절 바로 위의 다리를 잡습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 발목 관절 바로 위의 다리를 자릅니다.
8. 조직학적 분석
- 발목 표본을 4% 파라포름알데히드에 24시간 이상 담그십시오. 1개월 동안 10% EDTA(pH = 7.4)로 석회질을 제거합니다.
- 표본을 4% 파라포름알데히드에 2시간 동안 담그십시오.
- 그런 다음 에탄올 농도가 증가하는 그래디언트(70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%)에 표본을 담그십시오. 각 에탄올 농도를 1시간 동안 담그십시오.
- 표본을 크실렌에 3시간 동안 담그십시오.
- 발목 표본을 파라핀에 7시간 동안 담그십시오. 파라핀 블록은 4°C 냉장고에 따로 보관합니다.
- 반자동 파라핀 절편 기계를 사용하여 파라핀 블록을 6μm 두께로 자릅니다.
- 왁스 제거를 완료하기 위해 자일렌에 4 x 5분 동안 조각을 담그십시오.
- 에탄올 농도가 감소하는 그라데이션(100%, 100%, 95%, 75%)에 각각 2분 동안 슬라이스를 담그십시오. 증류수에 2분 동안 담그십시오.
- 헤마톡실린으로 조각을 10분 동안 얼룩을 묻히고 증류수로 5초 동안 헹굽니다.
- 슬라이스를 분화액에 30초 동안 담그고 증류수로 5초 동안 헹굽니다.
- 조각에 에오신을 1분 동안 얼룩지게 하고 증류수로 3분 동안 헹굽니다.
- 에탄올 농도가 증가하는 그라데이션(80%, 95%, 100%, 100%)에 각각 1분 동안 슬라이스를 담그십시오. 크실렌에 3 x 3분 동안 담그고 슬라이스를밀봉합니다 25.
9. 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)
- 제조업체의 지침에 따라 각 키트를 사용하여 혈장 내 IL-17 및 TNF-α 농도를 측정합니다.
10. 통계 분석
- 데이터를 평균± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현합니다.
- 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 이원 반복 측도 분산 분석(ANOVA)을 통해 유의성을 확인한 후 Bonferroni 또는 Tamhane T2의 사후 검정을 수행합니다.
- P < 0.05가 통계적으로 유의하다고 가정합니다.
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Representative Results
PG에 의해 유발된 모델 마우스는 사지와 발가락의 발적과 부종을 특징으로 하는 말초 관절염 증상을 보였고, AS의 발현과 매우 유사한 14주차에 점차적으로 축성 관절염이 발생했다. 따라서, AS 마우스 모델은 마지막 주사 후 14주에 관절염 지수(AI)가 3점 이상이면 성공한 것으로 간주되었다22. 쥐의 발이 부어오른 것처럼 보이면 일주일에 한 번 총 3회 두뜸 치료를 실시하였다. 치료 후 쥐는 이소플루란 심부 마취 하에 자궁경부 탈구로 안락사시키고 혈액을 채취하여 발목을 절제했습니다.
Du-moxibustion이 운동 조정 및 자율 운동에 미치는 영향
소 PG 유도 AS는 Du 자오선에서 Du-moxibustion이 운동 조정에 미치는 영향을 관찰하기 위한 모델로 채택되었습니다. 처음에는 관절 부종 점수를 사용하여 모델의 성공 여부를 평가하고, rotarod 테스트와 OFT를 사용하여 운동 협응 및 자율 운동 운동을 평가했습니다.
AI의 평가는 말초 관절염의 중증도를 결정했습니다. 모델링 후, 양원 반복 측정 ANOVA는 모델 및 Du-moxibustion 그룹의 관절 부종 점수가 Du-moxibustion 이전의 대조군에 비해 유의하게 증가했음을 밝혔습니다(P < 0.01; 그림 6A). 두뜸 치료는 두뜸 치료 후 모델군에 비해 관절 부종 점수가 감소했다(P< 0.05; 그림 6A).
로타로드 테스트는 운동 협응력과 균형을 평가하기 위해 사용되었습니다. 이원 반복 측도 분산 분석에서는 시간 경과에 따른 유의한 차이(F=13.928, P=0.000 < 0.05)와 시간 및 그룹의 상호 작용 효과(F=12.583, P=0.000 < 0.05)가 나타났습니다. 모델링 후 대조군의 지연 시간은 모델링 전과 다르지 않았습니다. 그러나 모델링 후 모델군과 두뜸군의 잠복시간은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(P < 0.01; 도 6B), 모델군과 두뜸군 간에 유의한 차이는 없었다(P > 0.05; 그림 6B). 처리 후 듀뜸 투여군의 잠복기는 모델군에 비해 유의하게 증가하였다(P < 0.05; 그림 6B). 이러한 결과는 Du-moxibustion이 AS 마우스의 운동 협응을 개선하는 데 효과적임을 나타냅니다.
OFT는 자율 신경 운동을 감지하기 위해 수행되었습니다. 매개변수는 소프트웨어를 사용하여 자동으로 수집 및 분석되었습니다(그림 6C-E). 이 연구에서는 총 거리와 평균 속도가 주로 관찰되었습니다. 모델링 전 그룹 간의 총 거리와 평균 속도에는 유의한 차이가 없었다(P > 0.05; 그림 6C,D). 모델링 후 총 거리와 평균 속도는 대조군에 비해 유의하게 감소했다(P < 0.05; 그림 6C,D). 처리 후 두뜜기 투여군의 총 거리와 평균 속도는 모델군에 비해 유의하게 증가하였다(P < 0.05; 그림 6C,D). 이러한 결과는 Du-moxibustion이 AS 마우스의 자율 운동 개선에 효과적임을 나타냅니다.
Du-moxibustion이 발목 관절 병리학에 미치는 영향
발목 관절의 병리학적 변화를 관찰하기 위해 HE 염색을 사용했습니다. 대조군에서는 활막 구조의 손상, 활막의 울혈, 명백한 염증 세포 침윤 및 괴사가 없었습니다. 그러나 모델군에서는 염증성 세포 침윤 및 조직 부종 외에도 관절강 내에서 활막 증식 및 침윤이 관찰되었습니다. AI 평가와 결합하여 AS 모델이 성공적으로 확립되었음을 입증했습니다. 모델 그룹과 비교했을 때, Du-moxibustion 그룹의 마우스의 활막은 더 온전했고, 간질성 부종은 감소했으며, 관절 연골은 비교적 온전했습니다(그림 7).
Du-moxibustion이 혈장 IL-17 및 TNF-α 수준에 미치는 영향
혈장에서 IL-17 및 TNF-α를 측정하기 위해 ELISA를 수행했습니다. 모델군의 혈장 IL-17 및 TNF-α 수치는 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(P < 0.01; 그림 6F,G). 듀뜸은 혈장 IL-17 및 TNF-α 수치를 감소시켰다(P < 0.05; 그림 6F,G).
그림 1: Du-moxibustion에 필요한 원료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 뜸 원뿔 만들기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 생강수를 준비하고 사다리꼴 생강 기둥을 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 마우스에서 GV14 및 GV2의 위치. (A) GV14는 제7 경추의 아가시 돌기에 위치합니다. GV2는 틈새 천골관에 위치하고 있습니다. (B) 마우스의 Du moxibustion의 개략도. (C) Du moxibustion의 자극 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 마우스에서 Du-moxibustion의 작동 절차. (A) 머리를 면도하고 엎드린 자세에서 생강즙을 쥐에 바릅니다. (나,씨) TCM 파우더를 골고루 뿌린다. (D) 뽕나무 종이로 가루를 덮습니다. (E) 생강 기둥을 뽕나무 종이에 단단히 고정합니다. (F) 생강 기둥에 뜸쑥 콘을 놓습니다. 그런 다음 불을 붙입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: Du-moxibustion이 운동 협응, 자율 운동, IL-17 및 TNF-α 수치에 미치는 영향. (A) 마우스의 관절 부종 점수. (B) 로타로드 테스트의 대기 시간. (씨-E) OFT의 총 거리, 평균 속도 및 트랙 다이어그램. (F) 혈장 내 IL-17 수치. (G) 혈장 내 TNF-α 수준. 값은 SEM± 평균(n = 6)으로 표현됩니다. ##대조군 대비 P < 0.01, #P < 0.05; $$모델 그룹 대비 P < 0.01, $P < 0.05. 약어: IL = 인터루킨; TNF = 종양 괴사 인자; OFT = 오픈 필드 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 발목 관절의 HE 염색. (A) 대조군에서 염증성 침윤 없이 관절강이 매끄러웠다. (B) 모델군에서는 관절강에서 활막 증식과 침윤이 관찰되었다. (C) Du-moxibustion 그룹에서는 마우스의 관절강이 매끄럽고 부종이 완화되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. 약어: HE = 헤마톡실린-에오신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
AS는 임상적으로 등, 요추 및 관절 부종 통증으로 나타나며, 심한 경우 척추 기형 및 관절 경직이 발생할 수 있다26. 조기 진단과 치료는 삶의 질을 향상시키고, 장애율을 낮추며, AS 환자의 예후를 개선할 수 있습니다. 중국 전통 의학(TCM)에 따르면 AS는 신장과 두경락의 양(陽)이 결핍되어 내부에 냉악이 축적되어 발생하는 것으로 알려져 있습니다. TCM은 경락의 개념에 기초한 뜸이 신체 표면을 따뜻하게 하는 기를 생성할 수 있다는 견해를 가지고 있습니다. 이 기(氣)는 경락(經絡)과 경혈(綠金)을 따라 아래쪽으로 이동한다. 황디(黃帝)의 내경(內慧 )(매우 고전적이고 중요한 한의학의 걸작)에는 "병든 두경락(頭淸經)을 치료한다"고 기록되어 있다. AS는 Du meridian에 위치하기 때문에 Du meridian을 자극하는 것이 치료 포인트로 사용됩니다. Du 자오선은 Yang Qi가 절정에 도달하는 Yang 채널의 바다로 간주됩니다. Du 경락의 뜸은 Yang qi를 보충하고 Du 경락의 효과를 활성화하며 신장 양의 온난화 효과를 조정하여 서양 의학의 면역 조절 기능을 향상시킬 수 있습니다.
서양 의학의 관점에서 척수는 신경 정보를 전달하는 데 중요한 역할을합니다. 척추신경근의 출입에 작용하는 뜸은 신경전달물질의 조절을 통해 신경계의 기능과 조절기전에 영향을 미칠 수 있습니다. 1990년대에 듀뜸이 쥐의 시상하부에서 β-엔돌핀 함량을 증가시켜 중추 진통 효과를 나타낸다는 사실이 입증되었다7. 또한 내막염은 AS의 흔한 합병증으로, 지속적인 통증과 근육 경직을 특징으로 하며, 심할 경우 관절과 신체의 움직임에 영향을 미칠 수 있습니다. 임상적으로 검증된 한의학적 치료 방법인 Du-moxibustion은 AS 치료에서 염증을 효과적으로 완화하고 조직 복구를 촉진하며 엔테지티스를 개선할 수 있습니다.
구체적으로, 침술과 뜸의 효과는 주로 다음과 같은 측면에서 반영됩니다. 첫째, 혈액 순환과 염증 흡수를 촉진한다. 듀뜸은 온열 효과를 통해 척추 주변 조직의 혈액순환과 신진대사를 자극하고 염증의 흡수와 조직 복구를 촉진하여 힘줄 부착 염증의 염증과 통증의 정도를 감소시킵니다. 둘째, 근육과 인대 긴장을 개선한다. 듀뜸의 자극 효과는 척추 주위의 근육 긴장을 개선하고 경화된 연조직을 이완시키며 척추 관절의 활동을 촉진하고 근육 긴장과 인대 스트레칭으로 인한 통증과 뻣뻣함을 줄일 수 있습니다. 요약하면, 보조 요법인 듀뜸은 척추 부위에 작용하여 신체의 신경계, 면역계, 순환계의 활동을 종합적으로 조절하여 신체 전체의 균형을 맞출 수 있습니다.
염증은 AS27의 주요 증상입니다. TNF-α는 단핵 대식세포(mononuclear macrophage)의 자극 하에서 생성되는 다중-이펙터 사이토카인(multi-effector cytokine) 및 염증 인자이다28. ALP와 콜라겐 합성의 활성은 TNF-α에 의해 억제되어 뼈 손실과 연골 파괴를 초래할 수 있다29. 최근 몇 년 동안 IL-17이 AS의 발병에 중요한 역할을 한다는 연구 결과가 발표되었으며, 이는 문헌고찰30에서 완전히 입증되었습니다. IL-17은 조골세포에 직접 작용하여 핵 전사 인자-κB(NF-κB) 수용체 활성화 리간드(RANKL)의 발현을 촉진하고 파골세포의 강력한 생성을 촉진할 수 있습니다. 동시에 IL-17은 중간엽 줄기세포(MSC)에도 영향을 미쳐 세포의 증식을 유도하고 조골세포로의 분화를 촉진한다31. Kenna32 et al.은 AS 환자의 말초 혈액 내 IL-17 수치가 건강한 대조군에 비해 거의 2배 증가했음을 발견했습니다. 이 연구는 IL-17 길항제가 TNF-α 길항제에 잘 반응하지 않는 AS 환자에게 새로운 옵션이 될 수 있음을 시사한다33. 임상 연구에 따르면 IL-17 길항제의 투여 요법이 환자의 방사선 사진 축 척추관절염 징후 및 증상을 개선하는 데 위약보다 우수했다34. 본 연구의 결과, 모델군의 TNF-α와 IL-17의 혈장 수치는 대조군보다 유의하게 높았으며, TNF-α와 IL-17의 혈장 수치는 듀뜸 처리 후 유의하게 감소한 것으로 나타났다.
Du-moxibustion 요법은 TCM의 호환 가능한 기술을 능숙하게 사용하여 경락, 경혈, 한약 및 뜸을 통합합니다. 두뜸 요법의 원료는 주로 뜸 벨벳, 생강, TCM 분말을 포함했습니다. 한의학의 관점에서 쑥 가공품인 뜸쑥 벨벳은 담보를 활성화하고 냉기를 쫓아내고 통증을 완화하는 기능이 있습니다. 생강은 외부 증상을 완화하고 감기를 쫓아내는 역할을 한다. 현대 연구에 따르면 생강은 항염증 및 진통 효과가 있다35. 시술 전에 생강즙으로 피부를 닦으면 모공을 열고 경피 침투를 촉진하는 데 도움이 될 뿐만 아니라36 TCM 분말이 피부에 밀착하는 데 도움이 됩니다. 사다리꼴 생강 기둥은 뒷면에 단단히 고정되어 뜸쑥 콘을 위한 견고한 기반을 제공합니다. 뜸 콘 연소 후 화력, 생강 및 TCM 분말의 효과가 Du meridian에서 함께 작동합니다. 이 병에서 양(陽) 결핍의 발병기전을 감안하여 두뜸(朝道)은 병(正)의 부위에 직접 작용하여 경락(經千)을 따뜻하게 하고 냉기를 분산시키며 양기(楊氣)와 정액(首進)을 보충하고 혈액순환을 촉진하며 음양(陰陽)의 균형을 잡아 병의 근원을 치료한다.
Du-moxibustion을 수행할 때 몇 가지 세부 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 두뜸의 수술 부위는 다주이점(GV14)에서 야오슈점(GV2)까지(해부학적으로 경추 7번째 가시돌기에서 척추 전체를 포함한 꼬리 척추까지)로 고정되어 있으며, 이는 AS의 발생 부위와 일치합니다(그림 4). 둘째, 생강의 습도와 농도가 중요합니다. 생강을 생강 진흙으로 가공한 후 여분의 생강즙을 짜내야 생강 진흙이 입상 느낌이 없고 사다리꼴 생강 기둥으로 만들기에 적절한 두께가 됩니다. 생강 진흙의 높은 습도와 습기는 뜸의 침투를 쉽게 방해하고 뜸 자극의 양을 감소시킬 수 있습니다. 생강 원료가 너무 건조하고 입자가 너무 크면 사다리꼴 생강 기둥을 만들기 어려워 열이 빠르게 침투하여 피부가 화상을 입을 수 있습니다. 셋째, 뜸쑥의 크기와 견고성을 고려해야 합니다. 마우스의 뜸에 사용되는 뜸 원뿔은 길이 ~ 4cm, 직경 0.5cm이며 준비시 단단해야합니다. 견고성 테스트는 원뿔이 표면에 떨어뜨린 후에도 풀리지 않는 경우입니다. 뜸쑥 콘이 충분히 작지 않으면 뜸쑥 벨벳의 양이 줄어들고 연소 시간이 짧아지며 화력이 감소합니다. 넷째, 뜸쑥에 불을 붙일 때 뜸쑥의 머리, 중간, 꼬리에 고운 향을 피워 뜸쑥을 천천히 태워 썰물과 썰물의 영양 효과를 얻어야 합니다. 다섯째, 사향은 뜸의 약용 분말의 중요한 성분입니다. 뜸 후 둘째 날에는 Du meridian에 작은 진주처럼 맑은 물집이 생겨야 합니다.
많은 임상 연구에서 AS 4,5,6 치료에서 Du-moxibustion의 확실한 효능이 확인되었습니다. 그러나 동물 실험에서의 작용 메커니즘에 대한 연구는 더디게 진행되고 있습니다. 연구와 혁신을 통해 Du-moxibustion 운영에 대한 수년간의 경험을 통해 쥐 실험에서 Du-moxibustion의 사용을 조사하게 되었습니다. 이 논문은 실험용 마우스에서 AS 처리에서 Du-moxibustion의 수술 절차 및 주의 사항을 자세히 설명합니다. 또한, AS 마우스에서 운동 협응 및 TNF-α 및 IL-17의 혈장 수준에 대한 뜸의 효과가 관찰되었습니다. 이 연구는 AS 치료에서 Du-moxibustion의 메커니즘 연구를 위한 가장 기본적인 실험 기초를 제공했습니다. 이 연구에는 여전히 몇 가지 한계가 있습니다. 예를 들어, 향후 연구에서는 가장 효과적인 조합 계획을 얻기 위해 위약 뜸, 용량, 범위 및 치료 시간과 같은 다양한 매개변수의 평가에 주의를 기울일 것입니다. 이후 연구에서는 이미징 방법을 사용하여 보다 직관적인 방식으로 치료 결과를 평가할 수 있습니다.
Du-moxibustion 요법의 적용 전망은 유망합니다. 거버너 베슬(Governor Vessel)로 알려진 두 경락(Du meridian)은 몸 전체의 기(氣)와 혈액의 흐름을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 중국 전통 요법인 뜸은 특정 경혈에 쑥을 태워 경락을 자극하고 신체의 자가 치유 메커니즘을 촉진하는 것입니다. 침술과 비교하여 Du-moxibustion은 신체 표면에 작용하는 다양한 기술의 조합으로 편안함과 강력하고 광범위한 작용의 특성을 가지고 있습니다. 또한, 두뜸 요법은 등과 척추 부위에 초점을 맞춰 두경락의 경로를 표적으로 삼습니다. 신체의 면역 체계를 강화하고 혈액 순환을 개선하며 다양한 신체적, 정신적 상태를 완화할 수 있습니다. 이 치료법은 근골격계 질환, 신경 질환, 부인과 질환 및 정신 건강 문제와 같은 질병을 치료하는 데 효과가 있음이 입증되었습니다. 연구와 기술의 발전으로 Du-moxibustion 요법의 적용은 더욱 확대될 것으로 예상됩니다. 향후 연구에서는 통증 관리, 스트레스 감소, 소화 장애 및 호흡기 질환과 같은 분야에서 그 잠재력을 탐구할 수 있습니다. 전통 지식과 현대 과학적 이해의 결합은 Du-moxibustion 요법을 주류 의료 관행에 더 잘 통합할 수 있습니다. 결론적으로, Du-moxibustion 요법은 다양한 의료 분야로의 적용 및 통합에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 추가 연구, 임상 시험 및 한의학 종사자와 현대 의료 전문가 간의 협력은 잠재력을 최대한 발휘하는 데 필수적입니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No.82174491)의 일반 프로그램 (No.82174491)과 Qilu School of Traditional Chinese Medicine Academic School Inheritance Project (No. Lu Weihan [2020]132). 실험 조건을 제공해 주신 Shandong University of Traditional Chinese Medicine의 Laboratory Animal Center에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% EDTA | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| alcohol pads | HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China | ||
| anesthesia machine | Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK | ||
| centrifuge tubes | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| complete Frech's adjuvant (CFA) | aladdin,Shanghai, China | F393378 | |
| cotton ball | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cotton gauze | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cutting board | self-preparation | ||
| decorin from bovine articular cartilage | Sigma-Aldrich, MO, USA | D8428 | |
| depilatory cream | Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China | ||
| electronic scale | Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| Eppendorf tube | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| eye lubricant | Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China | ||
| ginger | self-preparation | ||
| GraphPad Prism 7 software | GraphPad Software,Boston, USA | ||
| hair clipper | Super human Group CO LTD, Jinhua, China | ||
| heating pads | Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China | ||
| incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | aladdin,Shanghai, China | F393371 | |
| injection syringe | Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China | ||
| isoflurane | Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China | R510-22-10 | |
| joss stick | Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China | ||
| juicer | Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| knife | self-preparation | ||
| lighter | Zhejiang tiger-lighter Co. LTD | ||
| mortar | Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China | ||
| Mouse IL-17 ELISA Kit | absin, Shanghai, China | abs520009-96T | |
| Mouse TNF-α ELISA Kit | Wuhan Sanying, Wuhan, China | KE10002 | |
| mulberry paper | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China | ||
| OFT | Xinruan,Shanghai, China | XR-XZ301 | |
| paper cup | self-preparation | ||
| pipettes | OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK | ||
| refined moxa velvet | self-preparation | ||
| rotarod | Xinruan,Shanghai, China | XR-6C | |
| scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder | Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD | ||
| scissors | Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China | ||
| semi-automatic paraffin sectioning machine | Leica Camera AG, Watznach, Germany | ||
| SPSS 25.0 software | International Business Machines Corporation, NewYork, UAS | ||
| TCM powder | self-preparation | ||
| tips | Biosharp, Labgic, Beijing, China | ||
| writing brush | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China |
References
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