Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج الموائع الدقيقة لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر الذي يتضمن الأمعاء المعوية البشرية حديثي الولادة وميكروبيوم عسر الهضم

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذجا في المختبر لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) ، والذي يمكن استخدامه للدراسات الميكانيكية في التسبب في المرض. يتميز بشريحة الموائع الدقيقة المصنفة بمعوية معوية مشتقة من الأمعاء الوليدية البشرية والخلايا البطانية والميكروبيوم المعوي لحديثي الولادة المصاب ب NEC الشديد.

Abstract

التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) هو مرض معوي شديد ومميت يصعب دراسته بسبب التسبب في المرض المعقد ، والذي لا يزال غير مفهوم بشكل كامل. تشمل الفيزيولوجيا المرضية ل NEC تعطيل الوصلات المعوية الضيقة ، وزيادة نفاذية حاجز الأمعاء ، وموت الخلايا الظهارية ، و dysbiosis الميكروبي ، والالتهاب غير المنظم. تشمل الأدوات التقليدية لدراسة NEC النماذج الحيوانية وخطوط الخلايا والكائنات العضوية المعوية البشرية أو الفأر. في حين أن الدراسات التي تستخدم هذه الأنظمة النموذجية قد حسنت فهم المجال للفيزيولوجيا المرضية للمرض ، فإن قدرتها على تلخيص تعقيد NEC البشري محدودة. تم الآن تطوير نموذج محسن في المختبر من NEC باستخدام تقنية الموائع الدقيقة ، يسمى NEC-on-a-chip. يتكون نموذج NEC-on-a-chip من جهاز ميكروفلويديك مبذر بمعوية معوية مشتقة من حديثي الولادة الخدج ، وتمت زراعته بشكل مشترك مع الخلايا البطانية البشرية والميكروبيوم من رضيع مصاب ب NEC شديد. هذا النموذج هو أداة قيمة للدراسات الميكانيكية في الفيزيولوجيا المرضية ل NEC ومورد جديد لاختبار اكتشاف الأدوية للأمراض المعوية الوليدية. في هذه المخطوطة ، سيتم تقديم وصف تفصيلي لنموذج NEC-on-a-chip.

Introduction

يؤثر التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) على الخدج ، مع حدوث ما يصل إلى 10٪ في أولئك الذين يولدون بوزن < 1500 جم1. الفيزيولوجيا المرضية ل NEC معقدة وتشمل تلف ظهارة الأمعاء ، وتعطيل الوصلات المعوية الضيقة ، وزيادة نفاذية حاجز الأمعاء ، وعدم التنظيم المناعي ، وموت الخلايا الظهارية 2,3. لا يزال فهمنا للآليات التي ينطوي عليها التسبب في NEC غير مكتمل ، وعلى الرغم من عقود من البحث ، لا توجد حتى الآن علاجات مستهدفة فعالة.

يتمثل أحد العوائق الكبيرة التي تحول دون تقدم أبحاث NEC في التوافر المحدود وصغر حجم الأنسجة المعوية الأولية المعزولة عن الأطفال الرضع. غالبا ما تكون الأنسجة المعوية التي يتم استئصالها من الرضع المصابين ب NEC نخرية ومتضررة بشدة ، مما يعقد الدراسات حول الآليات التي تسبق ظهور المرض. على سبيل المثال ، تغمر الأمعاء الدقيقة للرضع المصابين ب NEC بالخلايا المناعية ، كما لوحظ انخفاض عدد الخلايا الجذعية المعوية ، وانخفاض تكاثر الخلايا الظهارية ، وزيادة موت الخلايا المبرمجللخلايا الظهارية 4،5،6،7. هذا يؤدي إلى صعوبات في زراعة الخلايا الظهارية المعوية من هذه العينات وفي عزل الحمض النووي الريبي والبروتينات ، والتي يمكن أن تتحلل في هذه البيئة الالتهابية المعادية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن عملية المرض متقدمة بالفعل عند الرضع الذين يعانون من NEC الجراحي ، فإن الدراسات الميكانيكية في العوامل التي تحفز المرض غير مجدية. وقد أدت هذه القيود إلى الاعتماد على النماذج الحيوانية للدراسات الميكانيكية ل NEC.

تم إنشاء نماذج حيوانية من NEC للفئران والجرذان والخنازير والأرانب وقردة البابون5،8،9،11. تتمثل قوة النماذج الحيوانية في أن المرض المعوي الشبيه ب NEC ناتج عن عوامل مرتبطة بظهور NEC في البشر ، بما في ذلك ميكروبيوم dysbiotic ، ونوبات متكررة من نقص الأكسجة ، وغياب حليب الثدي يغذي5،8،10،11. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستجابة الالتهابية والتغيرات المرضية التي لوحظت خلال NEC التجريبية توازي المرض البشري5،9،12. في حين أن هذه النماذج تحاكي العديد من ميزات NEC البشرية ، إلا أن هناك اختلافات متأصلة بين الفيزيولوجيا المرضية ل NEC في الحيوانات والبشر. على سبيل المثال ، يتم تحفيز نموذج الفئران من NEC في الفئران المولودة على المدى الكامل ، وعلى الرغم من أن نموها المعوي غير مكتمل ، إلا أن الفيزيولوجيا المرضية ل NEC مختلفة بطبيعتها في هذا السياق السريري. يشبه التعبير الجيني المعوي للفئران عند الولادة الجنين البشري القابل للحياة مسبقا ولا يقترب من حديث الولادة المبتسر من 22-24 أسبوعا من الحمل حتى اليوم 14 (P14) 13. هذا يربك نموذج الفئران NEC لأنه لا يمكن إحداث إصابة معوية بشكل عام في الفئران بعد P10. بالإضافة إلى ذلك ، تفتقر سلالات الفئران الفطرية إلى التنوع المناعي14 والتنوع الميكروبيولوجي لحديثي الولادةمن البشر 15 ، والذي يعمل كعامل مربك آخر. وبالتالي ، فإن زيادة دمج العينات البشرية الأولية في أبحاث NEC يحسن الأهمية السريرية للدراسات في هذا المجال.

استخدمت الدراسات حول آليات NEC في المختبر تقليديا خطوط الخلايا أحادية النمط المشتقة من خلايا سرطان الأمعاء البالغة ، مثل سرطان القولون والمستقيم الغدي (Caco2) وسرطان القولون الغدي البشري (HT-29)الخلايا 16. هذه النماذج مريحة ولكنها محدودة في الأهمية الفسيولوجية بسبب نموها من الخلايا السرطانية البالغة ، والبنية غير المستقطبة ، والتغيرات الظاهرية المتعلقة بالمقاطع المتكررة في الثقافة. تعمل الأمعاء المعوية على تحسين تلك النماذج حيث يمكن زراعتها من خبايا الأنسجة المعوية ، وتمييزها إلى جميع الأنواع الفرعية الظهارية المعوية ، وتشكيل بنية ثلاثية الأبعاد (3D) تشبه الزغابات17،18،19،20. في الآونة الأخيرة ، تم دمج المعوية المعوية مع تقنية الموائع الدقيقة لتطوير نموذج الأمعاء الدقيقة على رقاقة وتوفير نظام نموذج أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في المختبر 21.

تم إدخال أجهزة الموائع الدقيقة الأولية للجهاز على رقاقة في أوائلعام 2000 22،23،24. كان أول نموذج للعضو على رقاقة هو الرئة البشرية التي تتنفس على رقاقة25. تبع ذلك العديد من نماذج العضو الواحد مثل الأمعاء21 والكبد 26 والكلى 27 ونخاع العظام 28 والحاجز الدموي الدماغي 29 والقلب30. تم استخدام نماذج الأعضاء على الرقاقة هذه لدراسة الأمراض الحادة والمزمنة والنادرة ، بما في ذلك متلازمة الإشعاع الحاد ،31 ومرض الانسداد الرئوي المزمن ،32 والأمراض التنكسية العصبية 33. تسمح الطبيعة المستقطبة للخلايا الموجودة على هذه الرقائق ووجود مقصورتين خلويتين مفصولتين بغشاء مسامي بنمذجة العمليات الفسيولوجية المعقدة مثل التروية وتدرجات التركيز الكيميائي للخلايا المناعية34,35. وبالتالي توفر أنظمة الموائع الدقيقة هذه أداة جديدة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية وآليات الأمراض البشرية.

تم وصف نموذج الأمعاء الدقيقة على رقاقة بواسطة Kasendra et al. في عام 2018 ، الذين استخدموا عينات خزعة معوية صغيرة للأطفال (تتراوح أعمارهم بين 10 و 14 عاما) متباينة إلى معوية ومستزرعة على جهاز الموائع الدقيقة21. كما تم دمج الخلايا البطانية الوعائية ، وتدفق الوسائط المستمر ، والتمدد / الاسترخاء في هذا النموذج. لاحظوا تمايز النوع الفرعي الظهاري المعوي ، وتشكيل محاور تشبه الزغابات 3D ، وإنتاج المخاط ، وأنماط التعبير الجيني المعوي الصغير21. تم تطبيق نموذج الموائع الدقيقة هذا على أمراض حديثي الولادة مع تطوير نظام NEC-on-a-chip ، والذي يتضمن الأمعاء المعوية لحديثي الولادة والخلايا البطانية والميكروبيوم من حديث الولادة مع NEC36. يلخص NEC-on-a-chip العديد من السمات الهامة ل NEC البشري ، بما في ذلك التعبير الجيني الالتهابي ، وفقدان الخلايا الظهارية المتخصصة ، وانخفاض وظيفة حاجز الأمعاء36. وبالتالي ، فإن هذا النموذج له العديد من التطبيقات في دراسة NEC ، بما في ذلك الدراسات الميكانيكية واكتشاف الأدوية. في هذه المخطوطة ، يتم توفير بروتوكول مفصل لأداء نموذج NEC-on-a-chip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم اشتقاق Enteroids من عينات معوية صغيرة من الأطفال الخدج (المولودين في 22 إلى 36 أسبوعا من الحمل) تم الحصول عليها في وقت الجراحة ل NEC أو غيرها من الحالات المعوية ذات المسببات غير الالتهابية. تم جمع جميع العينات ومعالجتها بعد الموافقة المستنيرة والموافقة من مجالس المراجعة المؤسسية في جامعة واشنطن في سانت لويس (أرقام بروتوكول IRB 201706182 و 201804040) وجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل (رقم بروتوكول IRB 21-3134).

1. عزل وطلاء الخبايا من الأمعاء الدقيقة لحديثي الولادة البشرية لإنشاء المعوية

  1. الإعداد الإعلامي
    1. قم بإعداد جميع الوسائط المطلوبة كما هو موضح في الجدول 1. تأكد من استخدام تقنية التعقيم لإعداد جميع الوسائط. قم بتصفية تعقيم الوسائط باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. غسل وفرم الأنسجة المعوية
    1. ضع هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا على الثلج ليذوب. الحصول على الأنسجة المعوية البشرية من غرفة العمليات. ضع العينة على الفور في 5 مل من وسائط غسيل الأنسجة المثلجة لتعطيل البروتياز الداخلي.
    2. اغسل محتويات الأمعاء بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (D-PBS) باستخدام حقنة سعة 10 مل مزودة بطرف ماصة P1000 مشذب. نقل الأنسجة المعوية إلى طبق 35 ملم يحتوي على 5 مل من D-PBS الجليد البارد.
    3. قطع الأنسجة المعوية طوليا لفضح التجويف ، وتقطيعه إلى قطع صغيرة باستخدام مقص ناعم. شطف الأنسجة المعوية عن طريق التقليب بلطف في D-PBS في طبق زراعة الأنسجة.
    4. انقل شظايا الأنسجة إلى طبق نظيف مقاس 35 مم. اللحم المفروم مع مقص غرامة. الحجم الأمثل هو 0.5 سم2 لكل قطعة. يجب أن تمر الأنسجة المعوية عبر طرف ماصة مشذب سعة 1 مل.
  3. انفصال الأنسجة المعوية
    1. أضف 1 مل من كولاجيناز I المسخن مسبقا إلى الأنسجة. امزج الأنسجة مع كولاجيناز عن طريق سحب 10-15 مرة ، وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    2. قم بتأمين الأنبوب أفقيا على شاكر مضبوط عند 50 دورة في الدقيقة. يرج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. بعد الحضانة ، قم بإزالة الأنابيب من شاكر ، وأعد تعليق المحلول عن طريق سحب 10-15 مرة. اختياري: قم بإزالة حصة صغيرة للتحقق من وجود خبايا مفردة باستخدام مجهر تباين الطور.
  4. عزل الخبايا المعوية
    1. قم بتصفية الخبايا من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل على الجليد. اغسل المصفاة ب 9 مل من وسائط غسيل الأنسجة الباردة المثلجة. انقل الراشح إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية برفق. سيكون هناك ما يقرب من 200 ميكرولتر من الوسائط المتبقية في الأنبوب. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسائط غسيل الأنسجة الباردة الثلجية.
    3. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسائط غسيل الأنسجة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخبايا. بعناية وبشكل كامل نضح طاف قدر الإمكان باستخدام ماصة. ضع الأنبوب على الثلج.
  5. تصفيح الخبايا المعوية
    1. أعد تعليق الحبيبات في هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا (20 ميكرولتر / بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 48 بئرا) باستخدام طرف ماصة مبرد مسبقا لعمل تعليق متجانس للخبايا بينما يظل الأنبوب على الجليد. تجنب صنع الفقاعات عند الماصة. احتفظ بالأنبوب على الثلج حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
      ملاحظة: سوف يتبلمر هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا عند درجات حرارة أعلى من 8 درجات مئوية. عادة ما يتم طلاء الخبايا المعزولة من قطعة من الأنسجة المعوية بطول 0.5 سم -1 سم في 10 آبار من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 48 بئرا.
    2. قم بلوحة تعليق هيدروجيل مصفوفة القبو / الخلية في لوحة زراعة الأنسجة ذات 48 بئرا التي تم تسخينها مسبقا. قم بتسخين اللوحة للمساعدة في تصلب المصفوفة. ضع التعليق في وسط البئر. تجنب الفقاعات عند الطلاء.
    3. احتضان الألواح لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لبلمرة المصفوفة. من الضروري أن يتبلمر هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا بالكامل قبل إضافة الوسائط.
    4. بعد بلمرة المصفوفة ، أضف 300 ميكرولتر من الوسائط المكيفة L-WRN المسخنة مسبقا بنسبة 50٪ إلى كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2.
    5. قم بتغيير الوسائط كل 2 إلى 3 أيام. استبدل بوسائط مكيفة L-WRN دافئة بنسبة 50٪. مرور كل 7 إلى 10 أيام. تمر المعوية عندما تكون متقاربة بنسبة 50٪ -90٪ وتظهر تكوين برعم.
      ملاحظة: قد تحتاج الوسائط إلى التغيير بشكل متكرر إذا أصبحت صفراء. يعتمد تواتر المرور على كثافة الأمعاء ومعدل نمو خلايا مريض معين. سوف تحتاج إلى مرور المعوية إذا تحولت مراكزها إلى الظلام في المظهر.
  6. تمرير المعوية
    1. نضح الوسائط برفق من الآبار. اغسل الآبار بعناية باستخدام 500 ميكرولتر من D-PBS الدافئ. احرص على عدم إزعاج المصفوفة.
    2. أضف 250 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا الباردة إلى كل بئر. خدش الجزء السفلي من كل بئر بطرف ماصة جديد لتعطيل هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا. احتضان الطبق على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    3. فصل المعوية عن طريق ماصة قوية (~ 25-50 مرة مع ماصة P200) وإضافة 500 ميكرولتر من وسائط غسل الأنسجة.
    4. انقل معلق المعوي إلى أنبوب سعة 15 مل وأضف 5 مل إضافية من وسائط غسيل الأنسجة الباردة. ماصة بلطف لتشكيل حل متجانس.
    5. أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الأمعاء. ضع الأنبوب على الثلج ونضح المادة الطافية تماما قدر الإمكان. سيكون هناك ما يقرب من 30-60 ميكرولتر المتبقية في الأنبوب.
      ملاحظة: إذا كانت هناك صعوبات في تفتيت المعويات باستخدام الماصة ، فيمكن استخدام 0.25٪ من التربسين-EDTA أو كاشف التفكك الأنزيمي لتسهيل هذه العملية.
    6. أعد تعليق المعويات في الحجم المتبقي من وسائط الغسيل باستخدام ماصة P200. تجنب تكوين الفقاعات أثناء الماصة.
    7. أضف 20 ميكرولتر من هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا لكل بئر جديد من صفيحة بئر 48 إلى التعليق المعوي. قم بتقسيم المعوية 1: 3 أو 1: 4 أو 1: 5 ، اعتمادا على كثافتها.
    8. أضف التعليق إلى لوحة 48 بئرا تم تسخينها مسبقا. احتضن اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لترسيخ المصفوفة.
    9. بعد البلمرة ، أضف 300 ميكرولتر من الوسائط المكيفة L-WRN التي تم تسخينها مسبقا بنسبة 50٪ إلى كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2.

2. نموذج الأمعاء الوليدية على رقاقة

ملاحظة: للحصول على تعليمات مفصلة حول التعامل مع رقائق الموائع الدقيقة واستخدام هذا الجهاز ، يرجى الاطلاع على بروتوكول زراعة شريحة الأمعاء الاثني عشر37 الخاص بالشركة المصنعة.

  1. الإعداد الإعلامي
    1. قم بإعداد جميع الوسائط المطلوبة كما هو موضح في الجدول 2. تأكد من استخدام تقنية التعقيم. قم بتصفية تعقيم الوسائط باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. اليوم (-3): إذابة وتوسيع الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المعوية البشرية (HIMECs)
    1. قم بإذابة قارورة من HIMECs واللوحة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    2. قم بتغطية قارورة 25 سم2 بمحلول طلاء قائم على الجيلاتين لمدة دقيقتين. إزالة الحل الزائد. أضف HIMECs (حوالي 0.5-1 × 10 6 خلايا) المعاد تعليقها في6 مل من وسائط HIMEC إلى القارورة. احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2.
    3. قم بتغيير وسائط HIMEC كل 48 ساعة. أضف HIMECs إلى القناة البطانية (السفلية) للرقاقة في غضون 48-72 ساعة من أن تصبح متقاربة بنسبة 100٪.
  3. اليوم (-1): تنشيط وطلاء الرقائق قبل إضافة المعوية
    1. أعد تكوين مسحوق كاشف تنشيط الرقاقة 1 (CR-1) لصنع محلول CR-1. تأكد من أن مسحوق CR-1 وكاشف تنشيط الرقاقة 2 (CR-2) في درجة حرارة الغرفة لهذه الخطوة.
      ملاحظة: احتفظ بمسحوق CR-1 ومحلول CR-1 المحضر في الخطوات التالية محميين من الضوء في جميع الأوقات. يجب أن يكون الضوء مطفأ في غطاء المحرك لهذه الخطوات.
      1. ضع الرقاقة وحامل الرقاقة في مهد الرقاقة ، ثم ضعهما في طبق زراعة الأنسجة في غطاء زراعة الخلايا. راجع بروتوكول الشركة المصنعة للحصول على التقنية المناسبة لوضع الشريحة في الناقل37.
      2. أضف 1 مل من محلول CR-2 إلى قارورة مسحوق CR-1 ثم انقل المحلول مباشرة من قارورة مسحوق CR-1 إلى أنبوب سعة 15 مل ملفوف بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء. لا تخلط المحلول مع الماصة. الهدف هو تجنب تكوين الفقاعة.
      3. أضف 1 مل آخر من محلول CR-2 إلى قارورة CR-1 ، وانقله إلى أنبوب 15 مل. كرر ما مجموعه 4 شطف وما مجموعه 4 مل من CR-2 شطف من خلال قارورة CR-1. أضف الغطاء إلى القارورة واقلبه لآخر شطف لإزالة أي مسحوق متبقي.
      4. أضف 6 مل إضافية من CR-2 إلى أنبوب 15 مل يحتوي على CR-1 لحجم نهائي قدره 10 مل (0.5 مجم / مل). امزج هذا المحلول مع ماصة دون إدخال فقاعات. تأكد من حل CR-1 بالكامل قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    2. إضافة حل CR-1 إلى الشريحة
      ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب إدخال الفقاعات إلى القنوات أثناء إضافة هذه الحلول. يجب أن يظل محلول CR-1 محميا من الضوء لهذه الخطوة.
      1. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، أضف 20 ميكرولتر من محلول CR-1 إلى مدخل القناة السفلية حتى يبدأ المحلول في الخروج من مخرج القناة السفلية. أضف 50 ميكرولتر من محلول CR-1 من خلال مدخل القناة العلوية حتى يبدأ المحلول في الخروج من مخرج القناة العلوية. قم بإزالة أي محلول CR-1 زائد من سطح الشريحة عن طريق الشفط اللطيف.
        ملاحظة: يجب دائما إضافة الحلول إلى القناة السفلية قبل القناة العلوية. إذا لوحظت الفقاعات ، فقم بغسل كلتا القناتين بمحلول CR-1 وكرر 2.3.2.1.
      2. إذا كان غطاء طبق زراعة الأنسجة الذي يحتوي على الرقائق في مكانه ، فقم بإزالته لهذه الخطوة. ضع رقائق البطاطس تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة CR-1 من القنوات العلوية والسفلية.
      3. كرر الخطوات من 2.3.2.1 إلى 2.3.2.2 لما مجموعه خطوتين لتنشيط الأشعة فوق البنفسجية. بعد هذه الخطوة ، لم تعد الرقائق حساسة للضوء.
      4. قم بإزالة CR-1 من القنوات العلوية والسفلية. اغسل كلتا القناتين ب 100 ميكرولتر من محلول CR-2. قم بإزالة حل CR-2 من القنوات العلوية والسفلية.
      5. اغسل كلتا القناتين ب 100 ميكرولتر من D-PBS المعقم. كرر الغسلات 2x. أضف 100 ميكرولتر من D-PBS إلى كلتا القناتين. قم بإزالة الفائض من سطح الرقائق ولكن اترك القنوات ممتلئة.
    3. قنوات معطف مع مصفوفة خارج الخلية.
      1. قم بإذابة الفبرونيكتين والكولاجين الرابع وهيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا على الجليد مباشرة قبل هذه الخطوة واحتفظ بهذه المحاليل على الجليد لبقية هذا القسم.
      2. قم بإعداد حلول المصفوفة خارج الخلية (ECM) التالية للقنوات العلوية والسفلية للشريحة:
        القناة العلوية: 100 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل من الكولاجين من النوع الرابع و 100 ميكروغرام / مل من هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا في D-PBS لكل شريحة.
        القناة السفلية: 100 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل من الكولاجين من النوع الرابع و 30 ميكروغرام / مل من الفبرونيكتين في D-PBS لكل شريحة.
      3. قم بإزالة D-PBS تماما من القنوات العلوية والسفلية. أضف 50 ميكرولتر من ECM إلى مدخل القناة السفلية حتى تظهر قطرة على المخرج. كرر للقناة العلوية. تأكد من استخدام حلول ECM المناسبة لكل قناة وإضافة الحل إلى القناة السفلية أولا.
      4. أضف D-PBS إلى خزان مهد الرقاقة واستبدل الغطاء الموجود على لوحة زراعة الأنسجة. ضع الرقائق في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 طوال الليل.
  4. اليوم (0): رقائق البذر مع HIMECs و enteroids
    1. توازن فراغ الوسائط
      1. أضف الحجم المطلوب من وسائط HIMEC ووسائط تمدد الرقاقة ، لإكمال التجربة ، إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. قم بموازنة الوسائط إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 1 ساعة على الأقل.
      2. قم بتوصيل جهاز الترشيح بالفراغ بأنابيب سعة 50 مل تحتوي على وسائط دافئة. يجب توجيه الأنابيب مع الوسائط الدافئة مسبقا في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. فراغ عند -70 كيلو باسكال أو أعلى لمدة 10 ثوان.
      3. اقلب الأنابيب بحيث تتحرك الوسائط عبر الفلتر. استمر في التنظيف بالمكنسة الكهربائية لمدة 5 دقائق. عند الانتهاء من الترشيح الفراغي ، قم بإزالة جهاز الترشيح بالفراغ وضع أنابيب 50 مل التي تحتوي على وسائط في حاضنة 37 درجة مئوية.
    2. غسل الرقائق
      1. اغسل القناة البطانية عن طريق التنظيف ب 100 ميكرولتر من وسائط HIMEC المسخنة مسبقا.
        اغسل القناة الظهارية عن طريق التنظيف ب 100 ميكرولتر من وسائط تمدد الرقاقة المسخنة مسبقا. قم بإزالة أي وسائط تنتشر على سطح الرقائق.
      2. كرر خطوة الغسيل. يجب أن تظل الوسائط في القنوات وكذلك منافذ المدخل والمخرج بعد هذه التدفقات. استبدل غطاء طبق الثقافة الذي يحتوي على الرقائق والعودة إلى الحاضنة حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
    3. حصاد الهيميك
      1. نضح الوسائط من قارورة 25 سم2 تحتوي على HIMECs. اغسل الطبقة الأحادية برفق باستخدام D-PBS. أضف 2 مل من التربسين-EDTA المسخن مسبقا 0.05٪ إلى القارورة واشطفه برفق فوق الطبقة الأحادية.
      2. احتضان القارورة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق. تحييد التربسين مع 10 مل من وسائط HIMEC. أعد تعليق الخلايا في الوسائط ونقلها إلى أنبوب سعة 15 مل.
      3. تدور في الخلايا 150 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من وسائط HIMEC.
      4. قم بإزالة 10 ميكرولتر من الخلايا وضع الأنبوب على الثلج. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي. التركيز المطلوب من HIMECs هو 6 × 10 6 إلى 8 × 106 خلايا / مل.
    4. بذر HIMECs على الشريحة
      1. أخرج الشريحة من الحاضنة وأدخلها إلى الغطاء. نضح أي وسائط قد تكون تسربت على سطح الشريحة.
      2. اغسل القناة الظهارية (العلوية) للرقاقة ب 100 ميكرولتر من وسائط تمدد الرقاقة المسخنة مسبقا. اغسل القناة البطانية (السفلية) للرقاقة ب 100 ميكرولتر من وسائط HIMEC المدفأة مسبقا.
      3. أعد تعليق HIMECs برفق للحصول على توزيع متجانس. قم بإزالة الوسائط تماما من القناة البطانية (السفلية). أضف 10 ميكرولتر من HIMECs (~ 36000 خلية / شريحة) إلى القناة البطانية (السفلية).
        ملاحظة: إذا كان من الصعب ملء قناة HIMEC دون تكوين فقاعة عند استخدام 10 ميكرولتر من HIMECs ، فقم بزيادة حجم الخلايا المضافة. يجب أن يكون نفس عدد الخلايا لكل شريحة.
      4. أضف وسائط نمو عضوية إضافية إلى القناة الظهارية (العلوية) إذا لم تكن ممتلئة. تحقق من كثافة البذر في HIMECs. إذا لم يتم توزيعها بشكل موحد ولا تغطي 80٪ -90٪ من سطح الرقاقة ، اغسل القناة وكرر البذر.
      5. اقلب الشريحة في مهد الرقاقة في طبق زراعة الخلايا. أضف D-PBS إلى الخزان في مهد الرقاقة. استبدل الغطاء بطبق زراعة الخلايا وضعه في الحاضنة.
      6. اترك الشريحة مقلوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات للسماح ل HIMECs بالالتصاق بغشاء الرقاقة. بعد اكتمال الحضانة ، أعد مهد الرقاقة / الرقاقة إلى وضع رأسي.
      7. اغسل القناة البطانية (السفلية) برفق باستخدام 100 ميكرولتر من وسائط HIMEC الدافئة. اترك الوسائط في القناة. اغسل القناة الظهارية (العلوية) برفق باستخدام 100 ميكرولتر من وسائط النمو العضوية. اترك الوسائط في القناة.
      8. أعد الرقائق إلى حاضنة 37 درجة مئوية أثناء إكمال الخطوات التالية.
    5. حصاد المعوية والبذر على الرقاقة
      ملاحظة: يتم زرع الرقائق بالمعوية التي تم تقسيمها قبل 10-14 يوما ، وهي متقاربة بنسبة 50٪ -75٪ ، وعند المرور 7 و 20. يرجى الاطلاع على الشكل 2 لمعرفة ظهور المعوية في اليوم 0. يعتمد الوقت اللازم لتكون الأمعاء جاهزة للبذر على معدل نمو خلايا مريض معين.
      1. نضح الوسائط برفق من الآبار. اغسل بعناية الآبار التي تحتوي على هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا مع 500 ميكرولتر من D-PBS الدافئ. احرص على عدم إزعاج هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا.
      2. أضف 250 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا الباردة إلى كل بئر. خدش قاع كل بئر بطرف ماصة جديد لتعطيل هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا. أضف محتويات الآبار إلى أنبوب بارد سعة 15 مل على الجليد.
      3. احتضان الأنبوب على الثلج لمدة 45 دقيقة ، واقلب الأنبوب كل 3-5 دقائق. خلال هذه الخطوة ، قم بإعداد وسائط تفكك المعوي. ضع هذه الوسائط في حمام مائي 37 درجة مئوية عندما تبقى 10 دقائق في درجة الحضانة.
      4. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات المعوية. إزالة الطاف.
      5. أضف 2 مل من وسائط تفكك الأمعاء لكل صفيحة محصودة إلى الحبيبات وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 60 ثانية إلى 120 ثانية. أنبوب دوامة بلطف أثناء الحضانة. احتضان لفترة كافية لتحقيق المعوية مجزأة ولكن دون تفكك في تعليق خلية واحدة.
      6. بعد الحضانة ، أضف 10 مل من وسائط غسيل الأنسجة الباردة إلى كل أنبوب سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات المعوية. نضح طاف تماما.
      7. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من وسائط تمدد الرقاقة. فصل المعوية عن طريق ماصة قوية (~ 25-50 مرة مع ماصة P200).
      8. اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل. ماصة بلطف لتشكيل حل متجانس. الهدف هو زرع الشريحة مع المعوية المجزأة في مجموعات صغيرة من 10-30 خلية.
      9. إزالة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية للعد. ضع تعليق الخلية المتبقي على الجليد. اضبط حجم وسائط تمدد الرقاقة لتحقيق تركيز 6 × 106 خلايا / مل.
        ملاحظة: قد يكون من الضروري طرد مركزي للمعوية وإعادة تعليقها في حجم أصغر من الوسائط لتحقيق الكثافة المطلوبة.
      10. أحضر رقائق الموائع الدقيقة إلى الغطاء واستنشق الوسائط من القناة الظهارية (العلوية) للرقاقة. قم بتحميل القناة العلوية للرقاقة ب 30 ميكرولتر من الخلايا المعلقة (~ 180000 خلية / شريحة). ضمان تغطية كاملة وموحدة للقناة الظهارية للرقاقة لتشكيل طبقة واحدة. إذا لم يتحقق ذلك ، شطف الأمعاء من خلال رقاقة وإعادة بذر.
        ملاحظة: إذا كانت هناك صعوبات في تحقيق تعليق موحد أثناء تحميل رقائق متعددة ، فيمكن فصل المعوية إلى 40 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 مل. سيؤدي ذلك إلى تقليل التباين في أرقام المعوي وحجم الشظية مع استمرار التحميل.
      11. أعد الرقائق إلى مهد الرقائق في طبق زراعة الخلايا (إذا تمت إزالتها). أضف D-PBS إلى الخزان في مهد الرقاقة. استبدل الغطاء بطبق زراعة الخلايا ، وضع الرقائق على حرارة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 طوال الليل.
  5. يوم (1): تحضير القرون وإدخال التدفق إلى الرقائق
    1. جلب رقائق في غطاء زراعة الأنسجة. اغسل القناة الظهارية برفق مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من وسائط تمدد الرقاقة. اغسل القناة البطانية برفق مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من وسائط HIMEC. قم بإزالة الوسائط الزائدة من سطح الرقاقة.
    2. القرون الرئيسية وتنظيمها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة37. أضف 2 مل من الوسائط المناسبة إلى خزانات المدخل. أضف 300 ميكرولتر من الوسائط المناسبة إلى خزانات المخرج. سيكون معدل التدفق 30 ميكرولتر / ساعة. لن يبدأ التمدد بعد.
  6. اليوم (2): مراقبة تطور الطبقة الأحادية وتغيير الوسائط
    1. أوقف وحدة الثقافة مؤقتا وأحضر القرون إلى الغطاء.
    2. افحص الرقائق والقرون بحثا عن الفقاعات. افحص الطبقة الأحادية الظهارية باستخدام مجهر تباين الطور. التقط الصور في مواقع متسقة عبر الشريحة لمراقبة التقدم. تخيل الرقائق أثناء بقائها في القرون.
    3. قم بإزالة الوسائط من خزانات مدخل القناة العلوية واستبدلها ب 2 مل من وسائط تمايز الرقاقة. أضف 1 مل من وسائط HIMEC إلى خزان مدخل القناة السفلية. اترك وسائط كافية في خزانات المدخل لضمان بقاء قاع الخزان مغطى بطبقة رقيقة من الوسائط.
    4. أعد القرون إلى وحدة الاستزراع وأعد تشغيل التدفق عند 30 ميكرولتر / ساعة.
  7. اليوم (3): مراقبة التطور أحادي الطبقة ، وبدء التمدد ، وإضافة الوسائط
    1. كرر الخطوات 2.6.1.1. و2.6.1.2. أضف 1 مل من وسائط تمايز الرقائق إلى خزان مدخل القناة العلوية وأضف 1 مل من وسائط HIMEC إلى خزان مدخل القناة السفلية.
      ملاحظة: قم بإزالة الوسائط من خزانات مخرج كلتا القناتين بمجرد أن تبدأ في الوصول إلى سعة 50-75٪.
    2. أعد القرون إلى وحدة الثقافة. أعد تشغيل التدفق عند 30 ميكرولتر / ساعة ، وابدأ التمدد عند إجهاد 2٪ وتردد 0.2 هرتز.
  8. يوم (4): مراقبة التطور أحادي الطبقة وزيادة التمدد وإضافة الوسائط
    1. كرر الخطوات 2.6.1.1. و2.6.1.2. أضف 1 مل من وسائط تمايز الرقائق إلى خزان مدخل القناة العلوية وأضف 1 مل من وسائط HIMEC إلى خزان مدخل القناة السفلية.
      ملاحظة: قم بإزالة الوسائط من خزانات مخرج كلتا القناتين بمجرد أن تبدأ في الوصول إلى سعة 50-75٪.
    2. أعد القرون إلى وحدة الثقافة. أعد تشغيل التدفق عند 30 ميكرولتر / ساعة وقم بزيادة التمدد إلى إجهاد 10٪ وتردد 0.2 هرتز.
  9. اليوم (5) حتى اليوم (7): مراقبة تطور الطبقة الأحادية وإضافة الوسائط
    1. كرر الخطوات 2.6.1.1. و2.6.1.2. أضف 1 مل من وسائط تمايز الرقائق إلى خزان مدخل القناة العلوية وأضف 1 مل من وسائط HIMEC إلى خزان مدخل القناة السفلية.
    2. أعد القرون إلى وحدة الثقافة ، وأعد تشغيل التدفق والتمدد. بمجرد تصور محاور تشبه الزغابات ، انتقل إلى نموذج NEC-on-a-chip.

3. نموذج NEC على رقاقة

  1. ثقافة البكتيريا المعوية
    ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة مخزونا مجمدا معايرا مسبقا من البكتيريا المعوية من مريض مصاب ب NEC يتم إعداده مسبقا لبدء هذا البروتوكول. لهذه التجارب ، تم استخدام ملاط البكتيريا المعوية متعددة الميكروبات الموصوفة سابقا من مريض واحد مصاب ب NEC جراحي شديد38.
    1. اصنع مخزون 50٪ من الجلسرين من البكتيريا المعوية واحفظه في فريزر -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    2. قم بإذابة حصة من البكتيريا المعوية وقم بتلقيح 10 ميكرولتر في 3 مل من وسائط Luria-Bertani (LB). احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 150 دورة في الدقيقة طوال الليل.
    3. في نفس اليوم ، اغسل القنوات برفق باستخدام 100 ميكرولتر من وسائط تمايز الرقائق الخالية من المضادات الحيوية الدافئة مسبقا (القناة العلوية) أو 100 ميكرولتر من وسائط HIMEC الخالية من المضادات الحيوية الدافئة مسبقا (القناة السفلية). نضح الوسط بالكامل وكرر التدفق لما مجموعه 3 غسلات.
    4. بعد شفط الغسيل الثالث ، استبدل الوسائط في القنوات واتركها في مكانها.
    5. اشطف خزانات مدخل القناة العلوية والسفلية باستخدام D-PBS المعقم ثم املأها ب 3 مل من الوسائط المناسبة الخالية من المضادات الحيوية. القرون الرئيسية وتنظيمها كما في 2.5.2.
    6. أعد الشريحة إلى وحدة الثقافة ، وأعد بدء التمدد والتدفق.
    7. في صباح اليوم التالي ، خذ 1 مل من الثقافة البكتيرية الليلية وقم بتلقيحها في 25 مل من وسائط LB الطازجة.
    8. أعد هذه الثقافة الجديدة إلى شاكر 37 درجة مئوية حتى يصل OD600 إلى 0.6 ± 0.02 مقاسا باستخدام كفيت 1 سم. تمييع الثقافة البكتيرية إلى 7 × 108 وحدات تشكيل مستعمرة / مل في وسائط توسيع رقاقة خالية من المضادات الحيوية.
    9. احفظ حصة من هذه الثقافة لتأكيد تركيز اللقاح39. قد يكون من الضروري ضبط تركيز البكتيريا اعتمادا على استجابة الظهارة.
    10. قم بإزالة الوسائط من القناة الظهارية (العلوية). أضف 30 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية المخففة في وسائط تمدد الرقاقة الخالية من المضادات الحيوية إلى القناة العلوية للرقاقة. كن حذرا جدا لتجنب التلوث المتبادل لقناة HIMEC (البطانية) بالبكتيريا. قم بإزالة أي وسائط إضافية من سطح الشريحة.
    11. اترك الرقائق تبقى في ظل ظروف ثابتة لمدة 30 دقيقة لتسهيل التصاق البكتيريا بالجانب القمي من ظهارة حديثي الولادة. بعد الحضانة ، اغسل القناة العلوية ب 100 ميكرولتر من وسائط التمدد الخالية من المضادات الحيوية لإزالة البكتيريا غير الملتصقة. أعد الرقائق إلى وحدة الاستزراع وأعد بدء التمدد والتدفق.
    12. كل 24 ساعة ، قم بإزالة القرون من وحدة الاستزراع ، واغسل ببطء 100 ميكرولتر من وسائط تمدد الرقاقة الخالية من المضادات الحيوية عبر القناة الظهارية. هذا سوف يساعد في منع فرط نمو البكتيريا.

4. مقايسة نفاذية الأمعاء

ملاحظة: يمكن إجراء ذلك في أي خطوة أثناء البروتوكول. إذا بدأت عند زرع الرقائق ، يمكن استخدام مقايسة نفاذية الأمعاء لتقييم التقاء أحادي الطبقة بشكل متسلسل. إذا بدأ عند إضافة البكتيريا المعوية ، يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد تأثير البكتيريا المعوية على سلامة الطبقة الأحادية الظهارية في الأمعاء.

  1. قم بإزالة الوسائط من خزان المدخل للقناة الظهارية (العلوية). أضف الوسائط المناسبة التي تحتوي على صبغة نفاذية (50 ميكروغرام / مل) إلى خزان المدخل. استخدم وسائط تمايز الرقائق الخالية من المضادات الحيوية لنموذج NEC-on-a-chip.
  2. جمع النفايات السائلة من القنوات الظهارية والبطانية كل 24 ساعة. حدد تركيز صبغة النفاذية باستخدام قارئ صفيحة مجهرية وفقا ل Lanik et al.36.

5. الكيمياء الهيستولوجية المناعية

  1. اغسل القناة السفلية والقناة العلوية للشريحة برفق باستخدام 200 ميكرولتر من D-PBS. نضح تماما D-PBS من القنوات.
  2. إصلاح الخلايا عن طريق شطف كلتا القناتين مع 4 ٪ بارافورمالدهيد ، وترك الحل في القنوات. نضح الزائدة من سطح الرقاقة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. اغسل كلتا القناتين ب 200 ميكرولتر من D-PBS. اترك D-PBS في القناة السفلية وقم بإزالته تماما من القناة العلوية.
  4. تتخلل الطبقة الظهارية عن طريق شطف القناة العلوية بمحلول منظف 100 ميكرولتر من محلول منظف 0.1٪ ، مع ترك المحلول في القنوات. نضح الزائدة من سطح الرقاقة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  5. اغسل كلتا القناتين ب 200 ميكرولتر من D-PBS. اترك D-PBS في القناة السفلية وقم بإزالته تماما من القناة العلوية.
  6. أضف 10٪ مصل حمار (أو عامل مانع مناسب) إلى القناة العلوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل كلتا القناتين ب 200 ميكرولتر من D-PBS. اترك D-PBS في القناة السفلية وقم بإزالته تماما من القناة العلوية.
  7. خفف الأجسام المضادة الأولية في مصل الحمير بنسبة 5٪ وأضفها إلى القناة العلوية للرقاقة (تتوفر الأجسام المضادة والتركيزات التي تم اختبارها مسبقا في Lanik et al.36). احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  8. اغسل كلتا القناتين 3x باستخدام 200 ميكرولتر من D-PBS. اترك D-PBS في القناة السفلية وقم بإزالته تماما من القناة العلوية.
  9. الأجسام المضادة الثانوية المخففة ذات العلامات الفلورية المخففة 1: 200 في مصل الحمير 5٪ في D-PBS وإما Hoechst 33342 أو DAPI (البقع النووية). أضف أجساما مضادة ثانوية إلى القناة العلوية للشريحة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، محمية من الضوء.
  10. اغسل كلتا القناتين 3x باستخدام 200 ميكرولتر من D-PBS. اترك القنوات مملوءة ب D-PBS بعد الغسيل النهائي. ضع الشريحة في طبق تصوير باستخدام D-PBS للحصول على الصور باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.
    ملاحظة: يمكن تخزين الرقائق الثابتة ، سواء كانت ملطخة أو غير ملوثة ، عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع في برنامج تلفزيوني. تأكد من عدم جفاف القنوات خلال هذه الفترة.

6. عزل الحمض النووي الريبي ، وإعداد cDNA ، و PCR الكمي في الوقت الحقيقي

  1. اغسل القناة السفلية والقناة العلوية للشريحة برفق باستخدام 200 ميكرولتر من D-PBS. نضح تماما D-PBS من القنوات.
  2. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لعزل الحمض النووي الريبي من الظهارة فقط ، قم ببثه من خلال القناة العلوية فقط.
  3. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي بحجم النانو. نسخ عكسي 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي. الاشعال المستخدمة سابقا في هذا النموذج متوفرة في Lanik et al. 36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم زرع المعوية على جهاز الموائع الدقيقة (الشكل 1) واستزراعها كما هو موضح أعلاه. تمت مراقبة نمو المعوية في هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا قبل البذر ثم التوسع اللاحق للطبقة الأحادية للخلية الظهارية المعوية بعد البذر عبر مجهر برايت فيلد (الشكل 2). تشكلت طبقة أحادية الخلية الظهارية المعوية المتقاربة وتطورت لاحقا إلى بنية ناضجة تشبه الزغابات ثلاثية الأبعاد (الشكل 2). يعرف جهاز الموائع الدقيقة هذا المصنف بظهارة معوية حديثي الولادة مشتقة من الأمعاء و HIMECs باسم نموذج الأمعاء الوليدية على رقاقة36.

تم تطوير نموذج NEC-on-a-chip لتلخيص dysbiosis الميكروبي الموجود أثناء NEC لحديثي الولادة. يتضمن هذا النموذج إضافة ميكروبيوم عسر حيوي من حديث الولادة المصاب ب NEC الشديد إلى نموذج الأمعاء الوليدية على رقاقة. مع إضافة هذا الميكروبيوم dysbiotic ، زيادة كبيرة في التعبير عن مجموعة من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك عامل نخر الورم ألفا (TNFα; الشكل 3) ، تم اكتشاف إنترلوكين (IL) -1 بيتا (IL-1β) 36 ، و IL-8 36. تعكس هذه الزيادة في السيتوكينات المسببة للالتهابات ما لوحظ بالنسبة للإنسان NEC36.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لثقافة المعوي ومنصة الموائع الدقيقة. يتم عزل الخبايا من قطعة مقطوعة جراحيا من الأمعاء الوليدية ، ويتم زرعها في هيدروجيل مصفوفة زراعة الخلايا وتنمو لتصبح معوية معوية. يتم فصل المعوية وبذرها في القناة العلوية لجهاز الموائع الدقيقة المطلي بمصفوفة خارج الخلية (ECM). ثم تضاف الخلايا البطانية (HIMECs) إلى القناة السفلية. تم إنشاء الشكل باستخدام Biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تطور الخلايا الطلائية المعوية التي نمت باستخدام نموذج الأمعاء الوليدية على رقاقة. تظهر الصور التي تم الحصول عليها باستخدام الفحص المجهري برايت فيلد وجود معوية لحديثي الولادة في اليوم 0 ، وطبقة أحادية الخلية الظهارية في الرقاقة في اليوم 3 ، وهياكل شبيهة بالزغابات المرئية في اليوم 7. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. NEC-on-a-chip الخلية الظهارية المعوية TNFα تعبير mRNA. مقارنة مستويات TNFα mRNA عند الحضانة مع الوسائط وحدها (التحكم) أو ميكروبيوم dysbiotic من رضيع مع NEC (NEC-on-a-chip) لمدة 24 ساعة أو 72 ساعة. **** p < 0.0001 مقابل التحكم 24 ساعة ؛ ** p < 0.005 مقابل التحكم 72 ساعة بواسطة اختبار Mann-Whitney U. ن = 9 للتحكم 24 ساعة ؛ ن = 10 ل NEC-on-a-chip 24 ساعة ؛ ن = 6 للتحكم 72 ساعة ؛ ن = 5 ل NEC-on-a-chip 72 ساعة. البيانات تعني ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. تكوين الوسائط لعزل القبو والنمو المعوي. ارجع إلى Van Dussen et al.40 و Miyoshi et al.41 للحصول على طرق مفصلة تصف تحضير الوسائط المشروطة L-WRN. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2. تكوين الوسائط لنموذج NEC-on-a-chip. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد نظام NEC-on-a-chip أداة جديدة قوية يمكن استخدامها لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية ل NEC. توفر هذه المنصة بيئة دقيقة معقدة تشبه إلى حد كبير الوسط المعوي في الجسم الحي أكثر من النماذج السابقة من خلال دمج نظام الاستزراع المشترك مع التدفق اللمعي المستمر والتمدد. تعزز هذه الظروف تطوير بنية تشبه الزغابات ثلاثية الأبعاد تصطف على جانبيها ظهارة شديدة الاستقطاب تتكون من أنواع فرعية ظهارية ناضجة وتقاطعات ضيقة (الشكل 2)36. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الوصول بسهولة إلى السطح الظهاري القمي للتعرض للمحفزات التجريبية ، مثل الجراثيم المشتقة من المريض أو العلاجات الجديدة. أخيرا ، يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لدراسة مجموعة متنوعة من الأمراض المعوية الالتهابية وغير الالتهابية ، بالإضافة إلى آليات التطور الظهاري المعوي الطبيعي ، من خلال استخدام المعوية المشتقة من مجموعات المرضى ذات الصلة. يسمح هذا النموذج بتعظيم الحصول على البيانات من عينة مريض واحدة ، وهو أمر ضروري نظرا لمحدودية توافر وحجم عينات الأمعاء الوليدية.

باستخدام هذا النموذج ، لوحظت العديد من التغيرات الفسيولوجية في ظهارة الأمعاء التي تحدث أثناء NEC عند الرضع. أدت إضافة ميكروبيوم dysbiotic من مريض مصاب ب NEC شديد إلى زيادة تنظيم السيتوكينات الالتهابية (الشكل 3) ، وزيادة نفاذية حاجز الأمعاء على الرقاقة ، وتعزيز موت الخلايا ، وانخفاض الانتشار ، وفقدان الأنواع الفرعية الظهارية الناضجة36. وبالتالي ، يمكن أن تركز الدراسات المستقبلية التي تستخدم هذا النموذج على تحديد الآليات الكامنة وراء تطوير NEC والتدخلات العلاجية الممكنة.

هناك قيود متأصلة في تنفيذ نموذج معقد مثل NEC-on-a-chip. يتطلب هذا النظام معدات متخصصة وكواشف وتدريبا لاستخدام منصة الموائع الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب النموذج اهتماما وثيقا بالتفاصيل مع الإعداد الدقيق للوسائط المختلفة ، والبذر المناسب للرقاقة ، والحفاظ على التقنية المعقمة ، كونها حاسمة للنجاح. يجب أن يتمكن الباحثون أيضا من الوصول إلى عينات معوية أو معوية من مرضى حديثي الولادة ، والتي لا تتوفر بشكل عام إلا في مراكز الرعاية الرباعية مع جراحي الأطفال ما لم يتم الحصول عليها من خلال المتعاونين. أخيرا ، يؤدي دمج مكونات مهمة إضافية في الفيزيولوجيا المرضية ل NEC ، مثل الخلايا المناعية أو نقص الأكسجة ، إلى زيادة صعوبة هذا النموذج على الرغم من زيادة الأهمية الفسيولوجية.

باختصار ، يعد NEC-on-a-chip تقدما مهما في مجال أبحاث NEC التي من شأنها تحسين جودة الدراسات الميكانيكية وتسهيل اختبار العلاجات الجديدة ل NEC. الهدف النهائي من هذا البحث هو تصميم واختبار العلاجات المستهدفة التي تعمل على تحسين النتائج للرضع المصابين بالتهاب الأمعاء و NEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح يتعلق بهذه المخطوطة.

Acknowledgments

تم دعم هذه المخطوطة من قبل R01DK118568 (MG) و R01DK124614 (MG) و R01HD105301 (MG) من المعاهد الوطنية للصحة ، ومنحة مبادرة تشان زوكربيرج 2022-316749 (MG) ، وجائزة Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF) ، ومنحة الباحث الوظيفي المبكر لتنمية الأطفال في UNC (LCF) من خلال الدعم السخي من المانحين لجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل ، وقسم طب الأطفال في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Tags

نموذج الموائع الدقيقة ، التهاب الأمعاء والقولون الناخر ، الأمعاء المعوية لحديثي الولادة البشرية ، ميكروبيوم dysbiotic ، التسبب المعقد ، الوصلات الضيقة المعوية ، نفاذية حاجز الأمعاء ، موت الخلايا الظهارية ، dysbiosis الميكروبي ، التهاب غير منظم ، نماذج حيوانية ، خطوط الخلايا ، عضويات معوية ، نموذج في المختبر ، تقنية الموائع الدقيقة ، NEC-on-a-chip ، حديثي الولادة الخدج ، الخلايا البطانية البشرية ، اختبار اكتشاف الأدوية
نموذج الموائع الدقيقة لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر الذي يتضمن الأمعاء المعوية البشرية حديثي الولادة وميكروبيوم عسر الهضم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter