Summary
이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.
Abstract
괴사성 장염(Necrotizing enterocolitis, NEC)은 심각하고 치명적일 수 있는 장 질환으로, 복잡한 발병 기전으로 인해 연구가 어려웠으며, 아직 완전히 이해되지 않고 있습니다. NEC의 병태생리학에는 장 밀착 접합부의 파괴, 장 장벽 투과성 증가, 상피 세포 사멸, 미생물 미생물 미생물 불균형 및 조절 장애 염증이 포함됩니다. NEC를 연구하는 전통적인 도구에는 동물 모델, 세포주, 인간 또는 생쥐의 장 오가노이드가 포함됩니다. 이러한 모델 시스템을 사용한 연구는 질병 병태생리학에 대한 현장의 이해를 향상시켰지만, 인간 NEC의 복잡성을 요약하는 능력은 제한적입니다. NEC-on-a-chip이라고 하는 미세유체 기술을 사용하여 NEC의 개선된 시험관 모델이 현재 개발되었습니다. NEC-on-a-chip 모델은 인간 내피 세포 및 중증 NEC를 앓고 있는 유아의 마이크로바이옴과 함께 배양된 조산아에서 유래한 장내 장내형 장내형 물질로 파종된 미세유체 장치로 구성됩니다. 이 모델은 NEC의 병태생리학에 대한 기계론적 연구를 위한 귀중한 도구이자 신생아 장 질환에 대한 약물 발견 테스트를 위한 새로운 리소스입니다. 이 원고에서는 NEC-on-a-chip 모델에 대한 자세한 설명이 제공됩니다.
Introduction
괴사성 장염(Necrotizing enterocolitis, NEC)은 조산아에게 영향을 미치며, 체중 1500g < 출생아의 경우 발병률이 최대 10%에 이른다1. NEC의 병태생리학은 복잡하며 장 상피의 손상, 장 밀착 접합부의 파괴, 장 장벽 투과성 증가, 면역 조절 장애 및 상피 세포 사멸을 포함합니다 2,3. NEC의 발병기전과 관련된 메커니즘에 대한 우리의 이해는 불완전하며, 수십 년간의 연구에도 불구하고 효과적인 표적 치료법은 아직 없습니다.
NEC 연구의 진전을 가로막는 중요한 장벽은 인간 유아로부터 분리한 1차 장 조직의 가용성이 제한적이고 크기가 작다는 것입니다. NEC를 앓고 있는 영아의 장 조직을 절제하면 괴사하고 심하게 손상되는 경우가 많아 질병 발병 전 메커니즘에 대한 연구가 복잡해집니다. 예를 들어, NEC를 앓고 있는 영아의 소장에는 면역 세포가 넘쳐나며, 장 줄기세포의 수가 감소하고, 상피 세포 증식이 감소하며, 상피 세포 사멸이 증가한다 4,5,6,7. 이로 인해 이러한 샘플에서 장 상피 세포를 배양하고 적대적인 염증 환경에서 분해될 수 있는 RNA와 단백질을 분리하는 데 어려움이 있습니다. 또한, 외과적 NEC를 앓고 있는 영아의 경우 질병 진행이 이미 진행되었기 때문에 질병을 유발하는 요인에 대한 기계론적 연구는 실현 불가능합니다. 이러한 한계로 인해 NEC의 기계론적 연구를 위해 동물 모델에 의존하게 되었습니다.
NEC의 동물 모델은 생쥐, 쥐, 새끼 돼지, 토끼 및 개코원숭이에 대해 확립되었다 5,8,9,11. 동물 모델의 강점은 NEC와 유사한 장 질환이 생물 불균형 마이크로바이옴, 저산소증의 반복적인 에피소드 및 모유 수유 부족을 포함하여 인간의 NEC 발병과 관련된 요인에 의해 유발된다는 것입니다 5,8,10,11. 또한, 실험 NEC 동안 관찰 된 염증 반응 및 병리학적 변화는 인간 질병과 유사합니다 5,9,12. 이러한 모델은 인간 NEC의 많은 특징을 모방하지만 동물과 인간에서 NEC의 병태생리학 사이에는 고유한 차이점이 있습니다. 예를 들어, NEC의 쥐 모델은 만삭으로 태어난 마우스에서 유도되며, 장 발달이 불완전하지만 NEC의 병태생리학은 이러한 임상적 맥락에서 본질적으로 다릅니다. 출생 시 쥐의 장 유전자 발현은 생존 가능한 인간 태아와 유사하며, 임신 22-24주의 조산아의 유전자 발현과 14일째까지 비슷하지 않다(P14)13. 이것은 P10 이후 마우스에서 장 손상이 일반적으로 유도될 수 없기 때문에 쥐 NEC 모델을 혼란스럽게 합니다. 또한, 생쥐의 근친교배 균주는 인간 신생아15의 면역학적 다양성14 및 미생물학적 다양성이 결여되어 있으며, 이는 또 다른 교란 요인으로 작용한다. 따라서 NEC 연구에 1차 인간 샘플의 통합이 증가하면 이 분야 연구의 임상적 관련성이 향상됩니다.
NEC의 체외 기전에 대한 연구는 전통적으로 대장 선암(Caco2) 및 인간 결장 선암(HT-29) 세포와 같은 성인 장암 세포에서 유래한 단일형 세포주를 활용해 왔다16. 이러한 모델은 편리하지만 성인 암 세포로부터의 성장, 분극되지 않은 구조 및 배양의 반복적인 통과와 관련된 표현형 변화로 인해 생리학적 관련성이 제한적입니다. 장 장내골은 장 조직의 소낭에서 성장할 수 있고, 모든 장 상피 아형으로 분화될 수 있으며, 3차원(3D) 융모와 같은 구조를 형성할 수 있기 때문에 이러한 모델보다 개선된다(17,18,19,20). 최근에, 장내 장내골은 미세유체 기술과 결합되어 소장-온-어-칩(small intestine-on-a-chip) 모델을 개발하고, 생리학적으로 더 관련성이 높은 시험관 내 모델 시스템(in vitro modelsystem)을 제공한다(21).
초기 장기 칩 미세 유체 장치는 2000 년대 초반에 도입되었습니다22,23,24. 최초의 장기 칩(organ-on-a-chip) 모델은 인간 호흡 폐 온 칩 25(Lung-on-a-chip25)였습니다. 그 뒤를 이어 장 21, 간26, 신장27, 골수 28, 혈액뇌장벽29, 심장30과 같은 수많은 단일 장기 모델이 나왔다. 이러한 장기 칩 모델은 급성 방사선 증후군,31 만성 폐쇄성 폐 질환,32 및 신경 퇴행성 질환33을 포함한 급성, 만성 및 희귀 질환을 연구하는 데 사용되었습니다. 이러한 칩에 있는 세포의 분극화된 특성과 다공성 막으로 분리된 두 개의 세포 구획의 존재는 관류, 화학 농도 구배 및 면역 세포 화학주성34,35와 같은 복잡한 생리학적 과정의 모델링을 가능하게 합니다. 따라서 이러한 미세유체 시스템은 인간 질병의 병태생리학 및 메커니즘을 연구하기 위한 새로운 도구를 제공합니다.
소장온어칩(small intestine-on-a-chip) 모델은 2018년 Kasendra et al.에 의해 기술되었으며, 그는 소아(10-14세) 소장 생검 표본을 장내형으로 분화하고 미세유체 장치(21)에서 배양했습니다. 혈관 내피 세포, 지속적인 배지 흐름 및 스트레칭/이완도 이 모델에 통합되었습니다. 그들은 장 상피 아형 분화, 3D 융모 유사 축의 형성, 점액 생성 및 소장 유전자 발현 패턴을 관찰했다21. 이 미세유체 모델은 NEC36을 가진 신생아 장 장내, 내피 세포 및 신생아의 마이크로바이옴을 통합하는 NEC-on-a-chip 시스템의 개발로 신생아 질환에 적용되었습니다. NEC-on-a-chip은 염증성 유전자 발현, 특수 상피 세포의 손실, 장 장벽 기능 감소 등 인간 NEC의 많은 중요한 특징을 요약합니다36. 따라서 이 모델은 기계론적 연구 및 약물 발견을 포함하여 NEC 연구에서 수많은 응용 분야를 가지고 있습니다. 이 원고에서는 NEC-on-a-chip 모델의 성능에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
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Protocol
엔테로이드는 NEC 또는 비염증성 병인이 있는 기타 장 질환에 대한 수술 시 얻은 미숙아(임신 22주에서 36주에 출생)의 소장 샘플에서 유래되었습니다. 모든 검체 채취 및 처리는 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학교(IRB 프로토콜 번호 201706182 및 201804040)와 채플힐에 있는 노스캐롤라이나 대학교(IRB 프로토콜 번호 21-3134)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Boards)의 정보에 입각한 동의 및 승인을 받은 후 수행되었습니다.
1. 장내형 질환을 확립하기 위해 인간 신생아 소장에서 크립트의 분리 및 도금
- 배지 준비
- 표 1에 설명된 대로 필요한 모든 매체를 준비합니다. 모든 매체 준비에 무균 기술이 사용되는지 확인하십시오. 필터: 0.2μm 필터를 사용하여 배지를 멸균하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
- 장 조직 세척 및 다지기
- 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 얼음 위에 올려 해동합니다. 수술실에서 인간의 장 조직을 얻습니다. 즉시 샘플을 5mL의 얼음처럼 차가운 조직 세척 배지에 넣어 내인성 프로테아제를 비활성화합니다.
- 트리밍된 P1000 피펫 팁이 장착된 10mL 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS)로 장 내용물을 씻어냅니다. 장 조직을 얼음처럼 차가운 D-PBS 5mL가 들어 있는 35mm 접시에 옮깁니다.
- 장 조직을 세로로 잘라 내강이 드러나도록 하고 가는 가위를 사용하여 작은 조각으로 자릅니다. 조직 배양 접시에 D-PBS를 넣고 부드럽게 교반하여 장 조직을 헹굽니다.
- 조직 조각을 깨끗한 35mm 접시에 옮깁니다. 가는 가위로 티슈를 다집니다. 최적의 크기는 개 당 0.5 cm2 입니다. 장 조직은 잘린 1mL 피펫 팁을 통과해야 합니다.
- 장 조직 해리
- 미리 데워진 콜라겐분해효소 I 1mL를 조직에 추가합니다. 피펫팅을 10-15회 하여 조직과 콜라겐분해효소를 혼합하고 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
- 50rpm으로 설정된 Shaker에 튜브를 수평으로 고정합니다. 실온에서 20분간 흔들어 줍니다.
- 배양 후 셰이커에서 튜브를 제거하고 피펫팅하여 용액을 10-15회 재현탁시킵니다. 선택 사항: 위상차 현미경을 사용하여 단일 크립트의 존재를 확인하기 위해 작은 부분 표본을 제거합니다.
- 장낭샘 격리
- 70μm 스트레이너를 통해 얼음 위의 50mL 원뿔형 튜브로 크립트를 여과합니다. 얼음처럼 차가운 조직 세척제 9mL로 여과기를 세척합니다. 여과액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
- 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 부드럽게 제거합니다. 튜브에는 약 200μL의 매체가 남아 있습니다. 펠릿을 얼음처럼 차가운 조직 세척 배지 5mL에 재현탁시킵니다.
- 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 1mL의 조직 세척 배지에 재현탁시키고 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 크립트를 펠릿화합니다. 피펫을 사용하여 가능한 한 상층액을 신중하고 완전하게 흡입합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 장내 크립트 도금
- 튜브가 얼음 위에 있는 동안 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 세포 배양 매트릭스 하이드로겔(48웰 조직 배양 플레이트의 20μL/웰)에 펠릿을 재현탁시켜 크립트의 균질한 현탁액을 만듭니다. 피펫팅할 때 거품을 만들지 마십시오. 사용할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오.
알림: 세포 배양 매트릭스 하이드로겔은 8°C 이상의 온도에서 중합됩니다. 길이 0.5cm-1cm의 장 조직 조각에서 분리한 크립트는 일반적으로 48웰 조직 배양 플레이트의 10웰에 도금됩니다. - 크립트/세포 배양 매트릭스 하이드로겔 현탁액을 예열된 48웰 조직 배양 플레이트에 플레이트합니다. 매트릭스의 응고를 돕기 위해 플레이트를 따뜻하게 합니다. 서스펜션을 우물 중앙에 놓습니다. 도금할 때 기포를 피하십시오.
- 플레이트를 37°C에서 20분 동안 배양하여 매트릭스를 중합합니다. 세포 배양 매트릭스 하이드로겔은 배지를 추가하기 전에 완전히 중합하는 것이 필수적입니다.
- 매트릭스가 중합된 후 300μL의 예열된 50% L-WRN 조절 배지를 각 웰에 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 배양합니다.
- 2-3일마다 미디어를 교체하십시오. 따뜻한 50% L-WRN 컨디셔닝 미디어로 교체하십시오. 7-10일마다 통과합니다. 통로 장내류는 50%-90% 합류하고 새싹 형성을 나타냅니다.
주: 미디어가 노랗게 변하면 더 자주 교체해야 할 수 있습니다. 통과 빈도는 장내 밀도와 특정 환자 세포의 성장 속도에 따라 달라집니다. 장내염은 중심이 어두워지면 통과해야 합니다.
- 튜브가 얼음 위에 있는 동안 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 세포 배양 매트릭스 하이드로겔(48웰 조직 배양 플레이트의 20μL/웰)에 펠릿을 재현탁시켜 크립트의 균질한 현탁액을 만듭니다. 피펫팅할 때 거품을 만들지 마십시오. 사용할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 장내염 통과
- 우물에서 배지를 부드럽게 흡입합니다. 500μL의 따뜻한 D-PBS로 웰을 조심스럽게 세척합니다. 매트릭스를 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 각 웰에 250μL의 콜드 셀 회수 용액을 추가합니다. 새 피펫 팁으로 각 웰의 바닥을 긁어 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 파괴합니다. 얼음 위에 접시를 30분 동안 배양합니다.
- 격렬한 피펫팅(P25 피펫의 경우 ~50회)으로 장내를 분리하고 500μL의 조직 세척 배지를 추가합니다.
- 엔테로이드 현탁액을 15mL 튜브에 옮기고 5mL의 저온 조직 세척 배지를 추가합니다. 균질한 용액을 형성하기 위해 부드럽게 피펫팅합니다.
- 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 장류를 펠트합니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 상층액을 가능한 한 완전히 흡입합니다. 튜브에는 약 30-60μL가 남습니다.
참고: 피펫팅으로 장내염을 분해하는 데 어려움이 있는 경우 0.25% 트립신-EDTA 또는 효소 해리 시약을 사용하여 이 과정을 용이하게 할 수 있습니다. - P200 피펫으로 세척 매체의 잔류량에 장내염체를 재현탁시킵니다. 피펫팅하는 동안 기포가 형성되지 않도록 하십시오.
- 엔테로이드 현탁액에 48웰 플레이트의 새 웰당 20μL의 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 추가합니다. 장내를 밀도에 따라 1:3, 1:4 또는 1:5로 나눕니다.
- 예열된 48웰 플레이트에 서스펜션을 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 20분 동안 배양하여 매트릭스를 응고시킵니다.
- 중합 후 300μL의 예열된 50% L-WRN 조절 배지를 각 웰에 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 배양합니다.
2. 신생아 장 온 칩 모델
알림: 미세유체 칩 취급 및 이 장비 사용에 대한 자세한 지침은 제조업체의 십이지장 장 칩 배양 프로토콜37을 참조하십시오.
- 배지 준비
- 표 2에 설명된 대로 필요한 모든 매체를 준비합니다. 무균 기술이 사용되었는지 확인하십시오. 필터: 0.2μm 필터를 사용하여 배지를 멸균하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
- 일(-3): 인간 장내 미세혈관 내피 세포(HIMEC) 해동 및 확장
- 제조업체의 권장 사항에 따라 HIMECs 및 플레이트 바이알을 해동합니다.
- 25cm2 플라스크에 젤라틴 기반 코팅 용액을 2분 동안 코팅합니다. 과도한 용액을 제거하십시오. 6mL의 HIMEC 배지에 재현탁된 HIMEC(약 0.5-1 x10 6 세포)를 플라스크에 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 배양합니다.
- 48시간마다 HIMEC 미디어를 교체하십시오. 100% 합류 후 48-72시간 이내에 칩의 내피(하단) 채널에 HIMEC를 추가합니다.
- 일(-1): 장내염을 추가하기 전에 칩을 활성화하고 코팅합니다.
- 칩 활성화 시약 1(CR-1) 분말을 재구성하여 CR-1 용액을 만듭니다. 이 단계에서 CR-1 분말 및 칩 활성화 시약 2(CR-2) 용액이 실온에 있는지 확인합니다.
알림: 다음 단계에서 준비한 CR-1 분말과 CR-1 용액은 항상 빛으로부터 보호하십시오. 이 단계를 수행하려면 후드의 표시등이 꺼져 있어야 합니다.- 칩과 칩 캐리어를 칩 크래들에 넣은 다음 세포 배양 후드의 조직 배양 접시에 넣습니다. 캐리어(37)에 칩을 배치하기 위한 적절한 기술에 대해서는 제조업체의 프로토콜을 참조하십시오.
- CR-1 분말 바이알에 CR-2 용액 1mL를 첨가한 다음 CR-1 분말 바이알에서 알루미늄 호일로 감싼 15mL 튜브로 용액을 직접 옮겨 빛으로부터 보호합니다. 용액을 피펫과 혼합하지 마십시오. 목표는 기포 형성을 방지하는 것입니다.
- CR-1 바이알에 CR-2 용액 1mL를 더 넣고 15mL 튜브로 옮깁니다. 총 4회 헹구고 CR-4 바이알을 통해 총 2mL의 CR-1을 헹굽니다. 바이알에 캡을 추가하고 마지막 헹굼을 위해 뒤집어 잔류 분말을 제거합니다.
- 최종 부피 10mL(0.5mg/mL)를 위해 CR-1이 포함된 15mL 튜브에 CR-2 6mL를 추가합니다. 기포를 유입시키지 않고 이 용액을 피펫과 혼합하십시오. 다음 단계로 진행하기 전에 CR-1이 완전히 용해되었는지 확인하십시오.
- 칩에 CR-1 용액 추가
알림: 이러한 솔루션을 추가하는 동안 채널에 거품이 발생하지 않도록 하는 것이 중요합니다. CR-1 용액은 이 단계에서 빛으로부터 보호되어야 합니다.- 200μL 피펫 팁을 사용하여 용액이 하단 채널 출구에서 나오기 시작할 때까지 20μL의 CR-1 용액을 하단 채널 입구에 추가합니다. 용액이 상단 채널 출구에서 나오기 시작할 때까지 상단 채널 입구를 통해 50μL의 CR-1 용액을 추가합니다. 부드러운 흡인으로 칩 표면에서 과도한 CR-1 용액을 제거합니다.
참고: 솔루션은 항상 상단 채널보다 하단 채널에 먼저 추가해야 합니다. 기포가 보이면 CR-1 용액으로 두 채널을 모두 세척하고 2.3.2.1을 반복합니다. - 칩이 들어 있는 조직 배양 접시의 뚜껑이 제자리에 있으면 이 단계에서 제거합니다. 칩을 자외선 아래에 15분 동안 놓습니다. 상단 및 하단 채널에서 CR-1을 제거합니다.
- 2.3.2.1 - 2.3.2.2 단계를 반복하여 총 두 개의 UV 활성화 단계를 수행합니다. 이 단계가 끝나면 칩은 더 이상 빛에 민감하지 않습니다.
- 상단 및 하단 채널에서 CR-1을 제거합니다. 두 채널을 100μL의 CR-2 용액으로 세척합니다. 상단 및 하단 채널에서 CR-2 용액을 제거합니다.
- 두 채널 모두 100μL의 멸균 D-PBS로 세척합니다. 세탁을 2회 반복합니다. 두 채널 모두에 100μL의 D-PBS를 추가합니다. 칩 표면에서 초과분을 제거하되 채널은 가득 채운 상태로 둡니다.
- 200μL 피펫 팁을 사용하여 용액이 하단 채널 출구에서 나오기 시작할 때까지 20μL의 CR-1 용액을 하단 채널 입구에 추가합니다. 용액이 상단 채널 출구에서 나오기 시작할 때까지 상단 채널 입구를 통해 50μL의 CR-1 용액을 추가합니다. 부드러운 흡인으로 칩 표면에서 과도한 CR-1 용액을 제거합니다.
- 세포외 기질로 채널을 코팅합니다.
- 이 단계 직전에 피브로넥틴, 콜라겐 IV 및 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 얼음 위에서 해동하고 이 섹션의 나머지 부분 동안 이러한 용액을 얼음 위에 보관합니다.
- 칩의 상단 및 하단 채널에 대해 다음과 같은 세포외 기질(ECM) 용액을 준비합니다.
상단 채널: 칩당 100μL의 200μg/mL의 IV형 콜라겐 및 100μg/mL의 세포 배양 매트릭스 하이드로겔(D-PBS).
하단 채널: 칩당 100μL의 200μg/mL의 IV형 콜라겐 및 30μg/mL의 피브로넥틴(D-PBS). - 상단 및 하단 채널에서 D-PBS를 완전히 제거합니다. 출구에 방울이 나타날 때까지 하단 채널 입구에 50μL의 ECM을 추가합니다. 위쪽 채널에 대해 반복합니다. 각 채널에 적합한 ECM 솔루션을 사용하고 먼저 하단 채널에 솔루션을 추가해야 합니다.
- 칩 크래들 저장소에 D-PBS를 추가하고 조직 배양 플레이트의 뚜껑을 다시 닫습니다. 칩을 가습된 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 밤새 넣습니다.
- 칩 활성화 시약 1(CR-1) 분말을 재구성하여 CR-1 용액을 만듭니다. 이 단계에서 CR-1 분말 및 칩 활성화 시약 2(CR-2) 용액이 실온에 있는지 확인합니다.
- Day (0): HIMEC과 장내형 칩을 파종합니다
- 매체의 진공 평형
- 실험을 완료하기 위해 필요한 부피의 HIMEC 배지 및 칩 확장 배지를 멸균 50mL 코니컬 튜브에 추가합니다. 매체를 수조에서 37°C로 최소 1시간 동안 평형화합니다.
- 진공 여과 장치를 가열된 매체가 들어 있는 50mL 튜브에 연결합니다. 튜브는 50mL 코니컬 튜브의 바닥에 있는 예열된 배지로 향해야 합니다. -70kPa 이상에서 10초 동안 진공.
- 미디어가 필터를 통과하도록 튜브를 뒤집습니다. 5분 동안 계속 진공 청소기로 청소합니다. 진공 여과가 완료되면 진공 여과 장치를 제거하고 배지가 들어 있는 50mL 튜브를 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
- 칩 세척
- 100μL의 예열된 HIMEC 배지로 세척하여 내피 채널을 세척합니다.
100μL의 예열된 칩 팽창 매체로 세척하여 상피 채널을 세척합니다. 칩 표면에 퍼진 모든 매체를 제거합니다. - 세탁 단계를 반복합니다. 미디어는 이러한 플러시 후에도 채널과 입구 및 출구 포트에 남아 있어야 합니다. 칩이 들어 있는 배양 접시의 뚜껑을 다시 덮고 사용할 준비가 될 때까지 인큐베이터로 돌아갑니다.
- 100μL의 예열된 HIMEC 배지로 세척하여 내피 채널을 세척합니다.
- HIMEC 수확
- HIMEC가 포함된 25cm2 플라스크에서 매체를 흡입합니다. 단층을 D-PBS로 부드럽게 세척합니다. 미리 데워진 0.05% 트립신-EDTA 2mL를 플라스크에 넣고 단층 위에서 부드럽게 헹굽니다.
- 플라스크를 37°C에서 2-5분 동안 배양합니다. 10mL의 HIMEC 배지로 트립신을 중화합니다. 세포를 배지에 재현탁시키고 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 4°C에서 5분 동안 150 x g 의 세포를 회전시킵니다. 200μL의 HIMEC 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
- 10μL의 세포를 제거하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. HIMEC의 원하는 농도는 6 x 10 6 내지 8 x 106 cells/mL이다.
- 칩에 HIMEC 시드
- 인큐베이터에서 칩을 제거하고 후드로 가져옵니다. 칩 표면에서 누출되었을 수 있는 모든 매체를 흡입합니다.
- 100μL의 예열된 칩 확장 매체로 칩의 상피(상단) 채널을 플러시합니다. 100μL의 예열된 HIMEC 배지로 칩의 내피(하단) 채널을 플러시합니다.
- 균일한 분포를 얻기 위해 HIMEC를 부드럽게 재현탁시킵니다. 내피(하단) 채널에서 배지를 완전히 제거합니다. 10μL의 HIMEC(~36,000세포/칩)를 내피(하단) 채널에 추가합니다.
알림: 10μL의 HIMEC를 사용할 때 기포 형성 없이 HIMEC 채널을 채우기 어려운 경우 추가되는 셀의 부피를 늘리십시오. 칩당 셀 수가 같아야 합니다. - 오가노이드 성장 배지가 가득 차지 않은 경우 상피(상단) 채널에 추가합니다. HIMEC의 시드 밀도를 확인하십시오. 균일하게 분포되어 있지 않고 칩 표면의 80%-90%를 덮지 않으면 채널을 플러시하고 파종을 반복합니다.
- 칩을 세포 배양 접시의 칩 크래들로 반전시킵니다. 칩 크래들의 저장소에 D-PBS를 추가합니다. 세포 배양 접시의 뚜껑을 교체하고 인큐베이터에 넣습니다.
- HIMEC가 칩 멤브레인에 부착될 수 있도록 칩을 37°C에서 2-3시간 동안 뒤집은 상태로 둡니다. 배양이 완료되면 칩/칩 크래들을 똑바로 세웁니다.
- 100μL의 따뜻한 HIMEC 배지로 내피(하단) 채널을 부드럽게 세척합니다. 채널에 미디어를 남겨 둡니다. 100μL의 오가노이드 성장 배지로 상피(상단) 채널을 부드럽게 세척합니다. 채널에 미디어를 남겨 둡니다.
- 다음 단계를 완료하는 동안 칩을 37°C 인큐베이터로 되돌립니다.
- 엔테로이드 수확 및 칩 파종
참고: 칩은 10-14일 전에 분할된 엔테로이드로 파종되며, 50%-75%가 합류하고, 7번과 20번 통로에 있습니다. 0일차의 장내염 증상에 대해서는 그림 2 를 참조하십시오. 엔테로이드가 파종될 준비가 되는 데 필요한 시간은 특정 환자 세포의 성장 속도에 따라 달라집니다.- 우물에서 배지를 부드럽게 흡입합니다. 세포 배양 매트릭스 하이드로겔이 들어 있는 웰을 500μL의 따뜻한 D-PBS로 조심스럽게 세척합니다. 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 각 웰에 250μL의 콜드 셀 회수 용액을 추가합니다. 새 피펫 팁으로 각 웰의 바닥을 긁어 세포 배양 매트릭스 하이드로겔을 방해합니다. 얼음 위의 차가운 15mL 튜브에 우물의 내용물을 추가합니다.
- 얼음 위에서 45분 동안 튜브를 배양하고 3-5분마다 튜브를 뒤집습니다. 이 단계에서 장내 해리 배지를 준비합니다. 배양 단계에서 37분이 남았을 때 이 배지를 10°C 수조에 넣습니다.
- 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 장류를 펠트합니다. 상층액을 제거합니다.
- 채취한 접시당 2mL의 장내 해리 배지를 펠릿에 넣고 37°C 수조에 60초에서 120초 동안 넣습니다. 배양하는 동안 튜브를 부드럽게 휘젓습니다. 단편화된 장내를 얻을 수 있을 만큼 충분히 오래 배양하지만 단일 세포 현탁액으로 해리되지 않습니다.
- 배양 후 각 15mL 튜브에 10mL의 차가운 조직 세척액을 추가합니다. 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 장류를 펠트합니다. 상층액을 완전히 흡인하십시오.
- 펠릿을 200μL의 칩 팽창 매체에 재현탁시킵니다. 격렬한 피펫팅으로 장내형 생물을 분리합니다(P25 피펫으로 ~50-200회).
- 세포를 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 결합합니다. 균질한 용액을 형성하기 위해 부드럽게 피펫팅합니다. 목표는 10-30 개의 세포로 구성된 작은 클러스터에서 단편화 된 장내형으로 칩을 파종하는 것입니다.
- 계수를 위해 10μL의 세포 현탁액을 제거합니다. 나머지 셀 현탁액을 얼음 위에 놓습니다. 칩 팽창 매체의 부피를 조정하여 6 x 106 cells/mL의 농도를 달성합니다.
알림: 필요한 밀도를 달성하기 위해 장류를 원심분리하고 더 적은 양의 매체에 재현탁해야 할 수도 있습니다. - 미세유체 칩을 후드로 가져오고 칩의 상피(상단) 채널에서 배지를 흡입합니다. 칩의 상단 채널에 30μL의 재현탁 셀(~180,000셀/칩)을 로드합니다. 단층 형성을 위해 칩의 상피 채널의 완전하고 균일한 커버리지를 보장합니다. 이것이 달성되지 않으면 칩을 통해 장내를 헹구고 다시 시드하십시오.
참고: 여러 칩을 로딩하는 동안 균일한 현탁액을 얻는 데 어려움이 있는 경우 장내를 개별 1.5mL 미세 원심분리 튜브에서 40μL 분취액으로 분리할 수 있습니다. 이렇게 하면 로딩이 진행됨에 따라 장내 수와 단편 크기의 변동성이 최소화됩니다. - 칩을 세포 배양 접시의 칩 크래들로 되돌립니다(칩이 제거된 경우). 칩 크래들의 저장소에 D-PBS를 추가합니다. 세포 배양 접시의 뚜껑을 다시 덮고 칩을 37°C, 5%CO2 에서 밤새 둡니다.
- 매체의 진공 평형
- 1일차: 포드 준비 및 칩에 흐름 도입
- 칩을 조직 배양 후드로 가져옵니다. 100μL의 칩 확장 매체로 상피 채널을 두 번 부드럽게 플러시합니다. 100μL의 HIMEC 배지로 내피 채널을 두 번 부드럽게 세척합니다. 칩 표면에서 과도한 매체를 제거합니다.
- 포드를 프라임하고 제조업체의 프로토콜37에 따라 규제합니다. 적절한 배지 2mL를 주입구 저장소에 추가합니다. 300μL의 적절한 매체를 배출 저장소에 추가합니다. 유속은 30μL/h입니다. 스트레치가 아직 시작되지 않습니다.
- (2일): 단층 발달 및 배지 변화 모니터링
- 배양 모듈을 일시 중지하고 포드를 후드로 가져옵니다.
- 칩과 포드에 기포가 있는지 검사합니다. 위상차 현미경을 사용하여 상피 단층을 검사합니다. 칩 전체의 일관된 위치에서 이미지를 캡처하여 진행 상황을 모니터링합니다. 칩이 포드에 남아 있는 동안 칩을 이미지화합니다.
- 상부 채널 Inlet reservoir에서 배지를 제거하고 2mL의 칩 분화 배지로 교체합니다. HIMEC 배지 1mL를 하부 채널 입구 저장소에 추가합니다. 저장 탱크의 바닥이 얇은 매체 층으로 덮여 있도록 입구 저장소에 충분한 매체를 남겨 두십시오.
- 포드를 배양 모듈로 되돌리고 30μL/h로 흐름을 다시 시작합니다.
- (3일): 단층 발달 모니터링, 스트레치 시작 및 배지 추가
- 2.6.1.1단계를 반복한다. 및 2.6.1.2. 상부 채널 Inlet reservoir에 1mL의 칩 분화 배지를 추가하고 lower channel Inlet reservoir에 1mL의 HIMEC 배지를 추가합니다.
알림: 두 채널의 콘센트 저장소가 50-75% 용량에 도달하기 시작하면 미디어를 제거합니다. - Pod를 culture 모듈로 반환합니다. 30μL/h에서 흐름을 다시 시작하고 2% 변형률과 0.2Hz의 주파수에서 스트레칭을 시작합니다.
- 2.6.1.1단계를 반복한다. 및 2.6.1.2. 상부 채널 Inlet reservoir에 1mL의 칩 분화 배지를 추가하고 lower channel Inlet reservoir에 1mL의 HIMEC 배지를 추가합니다.
- (4일): 단층 발달 모니터링, 스트레치 증가 및 배지 추가
- 2.6.1.1단계를 반복한다. 및 2.6.1.2. 상부 채널 Inlet reservoir에 1mL의 칩 분화 배지를 추가하고 lower channel Inlet reservoir에 1mL의 HIMEC 배지를 추가합니다.
알림: 두 채널의 콘센트 저장소가 50-75% 용량에 도달하기 시작하면 미디어를 제거합니다. - Pod를 culture 모듈로 반환합니다. 30μL/h에서 흐름을 다시 시작하고 스트레치를 10% 변형률과 0.2Hz의 주파수로 증가시킵니다.
- 2.6.1.1단계를 반복한다. 및 2.6.1.2. 상부 채널 Inlet reservoir에 1mL의 칩 분화 배지를 추가하고 lower channel Inlet reservoir에 1mL의 HIMEC 배지를 추가합니다.
- 5일차부터 7일차까지: 단층 개발 모니터링 및 배지 추가
- 2.6.1.1단계를 반복한다. 및 2.6.1.2. 상부 채널 Inlet reservoir에 1mL의 칩 분화 배지를 추가하고 lower channel Inlet reservoir에 1mL의 HIMEC 배지를 추가합니다.
- Pod를 culture 모듈로 되돌리고 흐름 및 스트레치를 다시 시작합니다. 융모와 같은 축이 시각화되면 NEC-on-a-chip 모델로 진행합니다.
3. NEC-on-a-chip 모델
- 장내 세균 배양
참고: 이 단계에서는 이 프로토콜을 시작하기 전에 준비된 NEC 환자의 장내 박테리아 사전 적정 냉동 재고가 필요합니다. 이들 실험을 위해, 중증 외과적 NEC를 가진 한 환자로부터 이전에 기술된 다균성 장내 세균 슬러리를 사용하였다38.- 장용성 박테리아의 글리세롤 50% 스톡을 만들고 나중에 사용할 때까지 -80°C 냉동실에 보관하십시오.
- 장내 박테리아의 부분 표본을 해동하고 10μL를 3mL의 Luria-Bertani(LB) 배지에 접종합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 150rpm으로 진탕하여 배양합니다.
- 같은 날, 100μL의 예열된 무항생제 칩 분화 배지(상단 채널) 또는 100μL의 예열된 무항생제 HIMEC 배지(하단 채널)로 채널을 부드럽게 세척합니다. 배지를 완전히 흡인하고 총 3회 세척을 위해 세척을 반복합니다.
- 세 번째 세척을 흡입한 후 채널의 매체를 교체하고 제자리에 두십시오.
- 멸균 D-PBS로 상단 및 하단 채널 입구 저장소를 헹구고 적절한 무항생제 배지 3mL를 채웁니다. 포드를 프라임하고 2.5.2에서와 같이 규제합니다.
- 칩을 배양 모듈로 되돌리고 스트레치 및 흐름을 다시 시작합니다.
- 다음날 아침, 하룻밤 동안 배양한 박테리아 배양 1mL를 신선한 LB 배지 25mL에 접종합니다.
- OD600 이 1cm 큐벳을 사용하여 측정한 0.6 ± 0.02에 도달할 때까지 이 새로운 배양액을 37°C Shaker에 되돌립니다. 박테리아 배양을 무항생제 칩 확장 배지에서 7 x 108 콜로니 형성 단위/mL로 희석합니다.
- 접종물의 농도를 확인하기 위해 이 배양액을 저장한다39. 상피의 반응에 따라 박테리아의 농도를 조정해야 할 수도 있습니다.
- 상피(상단) 채널에서 배지를 제거합니다. 무항생제 칩 확장 매질에 희석한 박테리아 배양 30μL를 칩의 상단 채널에 추가합니다. HIMEC(내피) 채널이 박테리아로 교차 오염되지 않도록 각별히 주의하십시오. 칩 표면에서 여분의 미디어를 제거합니다.
- 신생아 상피의 정점 쪽에 박테리아가 부착되는 것을 촉진하기 위해 칩을 30분 동안 정적 상태로 두십시오. 배양 후 100μL의 무항생제 팽창 배지로 상단 채널을 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거합니다. 칩을 배양 모듈로 되돌리고 스트레칭 및 흐름을 다시 시작합니다.
- 24시간마다 배양 모듈에서 포드를 제거하고 상피 채널을 통해 100μL의 무항생제 칩 확장 배지를 천천히 플러시합니다. 이것은 박테리아의 과잉 증식을 방지하는 데 도움이 됩니다.
4. 장 투과성 분석
참고: 이 작업은 프로토콜 중 어느 단계에서나 수행할 수 있습니다. 칩을 파종할 때 시작되는 경우 장 투과성 분석을 사용하여 단층 합류를 연속적으로 평가할 수 있습니다. 장내 세균을 첨가할 때 이 분석을 시작하면 장내 세균이 장 상피 단층 무결성에 미치는 영향을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
- 상피(상단) 채널의 입구 저장소에서 배지를 제거합니다. 투과성 염료(50μg/mL)가 포함된 적절한 배지를 입구 저장소에 추가합니다. NEC-on-a-chip 모델에는 무항생제 칩 분화 매체를 사용합니다.
- 24시간마다 상피 및 내피 채널에서 폐수를 수집합니다. Lanik et al.36에 따라 마이크로플레이트 리더를 사용하여 투과성 염료의 농도를 정량화합니다.
5. 면역조직화학
- 칩의 하단 채널과 상단 채널을 200μL의 D-PBS로 부드럽게 세척합니다. 채널에서 D-PBS를 완전히 흡입합니다.
- 4% 파라포름알데히드로 두 채널을 모두 플러시하고 채널에 용액을 남겨 세포를 고정합니다. 칩 표면에서 과잉을 흡입합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 두 채널 모두 200μL의 D-PBS로 세척합니다. D-PBS는 하단 채널에 그대로 두고 상단 채널에서 완전히 제거합니다.
- 100μL의 0.1% 세제 용액으로 상단 채널을 세척하여 상피층을 투과시키고 채널에 용액을 남깁니다. 칩 표면에서 초과분을 흡인하고 실온에서 45분 동안 배양합니다.
- 두 채널 모두 200μL의 D-PBS로 세척합니다. D-PBS는 하단 채널에 그대로 두고 상단 채널에서 완전히 제거합니다.
- 10% 당나귀 혈청(또는 적절한 차단제)을 상온에서 1시간 동안 상단 채널에 추가합니다. 두 채널 모두 200μL의 D-PBS로 세척합니다. D-PBS는 하단 채널에 그대로 두고 상단 채널에서 완전히 제거합니다.
- 1차 항체를 5% 당나귀 혈청에 희석하고 칩의 상단 채널에 추가합니다(이전에 테스트한 항체 및 농도는 Lanik et al.36에서 확인할 수 있음). 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 두 채널 모두 200μL의 D-PBS로 3번 세척합니다. D-PBS는 하단 채널에 그대로 두고 상단 채널에서 완전히 제거합니다.
- D-PBS 및 Hoechst 33342 또는 DAPI(핵 염색)의 5% 당나귀 혈청에 1:200으로 희석된 형광 표지 2차 항체를 희석합니다. 칩의 상단 채널에 2차 항체를 추가합니다. 빛으로부터 보호하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 두 채널 모두 200μL의 D-PBS로 3번 세척합니다. 최종 세척 후 채널을 D-PBS로 채운 상태로 두십시오. 컨포칼 현미경을 사용한 이미지 획득을 위해 D-PBS가 있는 이미징 접시에 칩을 놓습니다.
참고: 염색 또는 염색되지 않은 고정 칩은 PBS에서 최대 4주일 동안 1°C에서 보관할 수 있습니다. 이 기간 동안 채널이 마르지 않도록 하십시오.
6. RNA 분리, cDNA 전처리, 정량적 Real-Time PCR
- 칩의 하단 채널과 상단 채널을 200μL의 D-PBS로 부드럽게 세척합니다. 채널에서 D-PBS를 완전히 흡입합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 시약을 사용하여 세포에서 총 RNA를 추출합니다. 상피에서만 RNA를 분리하려면 상단 채널을 통해서만 주입합니다.
- 나노 부피 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 정량화합니다. 총 RNA 1μg을 역전사합니다. 정량적 Real-Time PCR을 수행합니다. 이 모델에서 이전에 사용된 프라이머는 Lanik et al. 36에서 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
엔테로이드를 미세유체 장치(그림 1)에 파종하고 상술한 바와 같이 배양하였다. 파종 전 세포 배양 매트릭스 하이드로겔에서 엔테로이드의 성장과 파종 후 장 상피 세포 단층의 후속 확장은 명시야 현미경을 통해 모니터링되었습니다(그림 2). 합류하는 장 상피 세포 단층이 형성된 후 성숙한 3D 융모와 같은 구조로 발전했습니다(그림 2). 장내 유래 신생아 장 상피와 HIMECs가 파종된 이 미세유체 장치는 신생아 장-온-어-칩 모델(36)로 알려져 있습니다.
NEC-on-a-chip 모델은 신생아 NEC 중에 존재하는 미생물 미생물 불균형을 재현하기 위해 개발되었습니다. 이 모델에는 중증 NEC가 있는 신생아의 dysbiotic 마이크로바이옴을 신생아 intestine-on-a-chip 모델에 추가하는 것이 포함됩니다. 이 dysbiotic 마이크로바이옴이 추가됨에 따라 종양괴사인자 알파(TNFα; 도 3), 인터루킨(IL)-1 베타(IL-1β)36 및 IL-8이 검출되었다36. 이러한 전염증성 사이토카인의 증가는 인간 NEC36에서 관찰된 것을 반영합니다.
그림 1: 장내 배양 및 미세유체공학 플랫폼의 개략도. 크립트는 수술로 절제된 신생아 장 조각에서 분리되어 세포 배양 매트릭스 하이드로겔에 파종되어 장내 장내로 성장합니다. 엔테로이드는 세포외 기질(ECM)로 코팅된 미세유체 장치의 상단 채널에서 해리되고 파종됩니다. 그런 다음 내피 세포(HIMEC)가 하단 채널에 추가됩니다. Biorender.com 로 만든 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 신생아 장-온-어-칩(informine on-a-chip) 모델을 사용하여 성장한 장 상피 세포의 진행. 명시야 현미경을 사용하여 획득한 이미지는 0일째에 신생아 장내세포, 3일째에 칩의 상피 세포 단층, 7일째에 눈에 보이는 융모 유사 구조를 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. NEC-on-a-chip 장 상피 세포 TNFα mRNA 발현. 24시간 또는 72시간 동안 NEC(NEC-on-a-chip)가 있는 영아의 배지 단독(대조군) 또는 디스바이오틱 마이크로바이옴으로 배양 시 TNFα mRNA 수준 비교. **** p < 0.0001 대 대조군 24시간; ** p < 0.005 vs. 대조군 72 시간 Mann-Whitney U 검정. 제어 9시간의 경우 n=24; NEC-on-a-chip 10시간의 경우 n=24; 대조군의 경우 n=6 72 h; NEC-on-a-chip 72시간의 경우 n=5. 데이터는 SEM± 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 크립트 분리 및 장내 성장을 위한 배지 구성. L-WRN 조건 매체의 제조를 설명하는 자세한 방법은 Van Dussen et al.40 및 Miyoshi et al.41을 참조하십시오. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2. NEC-on-a-chip 모델의 미디어 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 NEC-on-a-chip 시스템은 NEC의 병태생리학을 모델링하는 데 사용할 수 있는 강력한 새 도구입니다. 이 플랫폼은 연속적인 발광 흐름 및 스트레치가 있는 공동 배양 시스템을 통합하여 이전 모델보다 생체 내 장 내 환경과 더 유사한 복잡한 미세환경을 제공합니다. 이러한 조건은 성숙한 상피 하위 유형과 단단한 접합부로 구성된 고도로 편광된 상피가 늘어선 3D 융모와 같은 구조의 발달을 촉진합니다(그림 2)36. 또한 정점 상피 표면은 환자 유래 미생물 또는 새로운 치료제와 같은 실험 자극에 노출되기 위해 쉽게 접근할 수 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 관련 환자 집단에서 파생된 장내유세포를 활용하여 다양한 염증성 및 비염증성 장 질환과 정상적인 장 상피 발달 메커니즘을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 모델을 사용하면 단일 환자 샘플에서 데이터 수집을 극대화할 수 있으며, 이는 신생아 장 샘플의 제한된 가용성과 크기를 고려할 때 필수적입니다.
이 모델을 사용하여 유아의 NEC 동안 발생하는 장 상피의 많은 생리학적 변화가 관찰되었습니다. 중증 NEC 환자로부터 디스바이오틱 마이크로바이옴을 추가하면 염증성 사이토카인의 상향 조절(그림 3), gut-on-a-chip 장벽 투과성 증가, 세포 사멸 강화, 증식 감소, 성숙한 상피 아형 손실이 발생했습니다36. 따라서 이 모델을 활용한 향후 연구는 NEC의 발달 기전과 가능한 치료적 개입을 결정하는 데 초점을 맞출 수 있습니다.
NEC-on-a-chip과 같은 복잡한 모델을 구현하는 데에는 내재된 한계가 있습니다. 이 시스템은 미세유체공학 플랫폼을 활용하기 위해 특수 장비, 시약 및 교육이 필요합니다. 또한 이 모델은 다양한 배지의 정확한 준비, 칩의 적절한 파종 및 멸균 기술의 유지 관리와 함께 세부 사항에 세심한 주의를 기울여야 하며, 이는 성공에 매우 중요합니다. 또한 조사관은 신생아 환자의 장 샘플 또는 장내염에 접근할 수 있어야 하며, 이는 일반적으로 공동 연구자를 통해 얻지 않는 한 소아 외과 의사가 있는 4차 진료 센터에서만 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 면역 세포 또는 저산소증과 같은 NEC의 병태생리학에 중요한 추가 구성 요소를 통합하면 생리학적 관련성이 증가하지만 이 모델의 난이도가 더욱 높아집니다.
요약하면, NEC-on-a-chip은 NEC 연구 분야의 중요한 발전으로, 기계론적 연구의 품질을 개선하고 NEC에 대한 새로운 치료법의 테스트를 용이하게 할 것입니다. 이 연구의 궁극적인 목표는 장 염증 및 NEC가 있는 영아의 결과를 개선하는 표적 치료법을 설계하고 테스트하는 것입니다.
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Disclosures
저자는 이 원고와 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 원고는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 R01DK118568(MG), R01DK124614(MG) 및 R01HD105301(MG), Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749(MG), Thrasher Research Fund Early Career Award(LCF), UNC Children's Development Early Career Investigator Grant(LCF)의 지원을 받았습니다. 채플 힐에 있는 노스캐롤라이나 대학교의 소아과.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| A 83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Gibco | 12634010 | |
| B-27 Supplement, serum free (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Basic Bio-kit | Emulate | N/A | |
| BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | Agilent | 7131000 | |
| BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro | BrandTech | 759085D | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| CFX Opus Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chip Cradle | Emulate | N/A | |
| Chip-S1 Stretchable Chip | Emulate | N/A | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates, 48 well | Corning | 3548 | |
| Collagen from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit | Cell Biologics | H-1168 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7132 | Permeability dye |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane | Fisher Scientific | FB12566504 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | Corning | 46-034-CI | |
| ER-1 surface activation reagent | Emulate | ER-1 | Chip Activation Reagent 1 |
| ER-2 surface activation reagent | Emulate | ER-2 | Chip Activation Reagent 2 |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics | 6950 | |
| Genie Temp-Shaker 300 | Scientific Industries, Inc. | SI-G300 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | |
| HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) | Corning | 25-060-CI | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Invitrogen | H3570 | |
| Human Collagen Type I | Sigma-Aldrich | CC050 | |
| Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Biologics | H-6054 | |
| Inverted Microscope | Fisher Scientific | 03-000-013 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Broth (LB) agar, Miller | Supelco | L3027 | |
| L-WRN Cells | American Type Culture Collection | CRL-3276 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356231 | Cell Culture Matrix |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | 1009005 | |
| NAILSTAR UV LAMP | NailStar | NS-01-US | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-274200 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | 72340 | |
| Orb-HM1 Hub Module | Emulate | N/A | |
| Paraformaldehyde | ThermoFisher | 047392.9L | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | |
| Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 | Rainin | 17014966 | |
| Pod Portable Module | Emulate | N/A | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) | Avantor Seradigm | 1500-500 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated | Corning | 431111 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SE1M179M6 | |
| Sterile Cell Strainers, 70um | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Sterile Syringes, 10mL | Fisher Scientific | 14-955-453 | |
| Straight, fine, sharp point scissors | Miltex Instruments | MH5-300 | |
| Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge | Thermo Scientific | 75016052 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA extraction reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 | Corning | 25-900-CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Enzymatic Dissociation Reagent |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 13-998-252 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| Zoë-CM1 Culture Module | Emulate | N/A |
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