Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Mikrofluidisk modell av nekrotiserande enterokolit som innehåller humana neonatala tarmenteroider och ett dysbiotiskt mikrobiom

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver en in vitro-modell av nekrotiserande enterokolit (NEC), som kan användas för mekanistiska studier av sjukdomspatogenes. Den har ett mikrofluidiskt chip sådd med tarmenteroider som härrör från den mänskliga neonatala tarmen, endotelceller och tarmmikrobiomet hos ett nyfött med svår NEC.

Abstract

Nekrotiserande enterokolit (NEC) är en allvarlig och potentiellt dödlig tarmsjukdom som har varit svår att studera på grund av dess komplexa patogenes, som fortfarande är ofullständigt klarlagd. Patofysiologin för NEC inkluderar störning av tarmens trånga korsningar, ökad permeabilitet i tarmbarriären, epitelcelldöd, mikrobiell dysbios och dysreglerad inflammation. Traditionella verktyg för att studera NEC inkluderar djurmodeller, cellinjer och tarmorganoider från människor eller möss. Även om studier som använder dessa modellsystem har förbättrat fältets förståelse av sjukdomars patofysiologi, är deras förmåga att rekapitulera komplexiteten hos mänsklig NEC begränsad. En förbättrad in vitro-modell av NEC med mikrofluidikteknik, kallad NEC-on-a-chip, har nu utvecklats. NEC-on-a-chip-modellen består av en mikrofluidisk enhet sådd med tarmenteroider som härrör från ett för tidigt fött nyfödd, samodlat med humana endotelceller och mikrobiomet från ett spädbarn med svår NEC. Denna modell är ett värdefullt verktyg för mekanistiska studier av patofysiologin hos NEC och en ny resurs för läkemedelstestning för neonatala tarmsjukdomar. I detta manuskript kommer en detaljerad beskrivning av NEC-on-a-chip-modellen att ges.

Introduction

Nekrotiserande enterokolit (NEC) drabbar för tidigt födda barn, med en incidens på upp till 10 % hos de födda som väger < 1500 g1. Patofysiologin vid NEC är komplex och inkluderar skador på tarmepitelet, störning av tarmens täta korsningar, ökad permeabilitet i tarmbarriären, immundysreglering och epitelcelldöd 2,3. Vår förståelse av mekanismerna som är involverade i patogenesen av NEC är fortfarande ofullständig, och trots årtionden av forskning finns det fortfarande inga effektiva riktade terapier.

Ett betydande hinder för att avancera NEC-forskningen är den begränsade tillgängligheten och den lilla storleken på primär tarmvävnad som isolerats från mänskliga spädbarn. Tarmvävnad som avlägsnats från spädbarn med NEC är ofta nekrotisk och allvarligt skadad, vilket försvårar studier av mekanismer som föregår sjukdomsdebut. Till exempel översvämmas tunntarmen hos spädbarn med NEC av immunceller, och ett minskat antal tarmstamceller, minskad epitelcellsproliferation och ökad epitelcellsapoptos observeras också 4,5,6,7. Detta leder till svårigheter att odla tarmepitelceller från dessa prover och att isolera RNA och proteiner, som kan brytas ned i denna fientliga inflammatoriska miljö. Dessutom, eftersom sjukdomsprocessen redan är avancerad hos spädbarn med kirurgisk NEC, är mekanistiska studier av faktorer som inducerar sjukdom omöjliga. Dessa begränsningar har lett till att man har förlitat sig på djurmodeller för mekanistiska studier av NEC.

Djurmodeller av NEC har etablerats för möss, råttor, smågrisar, kaniner och babianer 5,8,9,11. En styrka med djurmodeller är att NEC-liknande tarmsjukdom induceras av faktorer som är associerade med NEC-debut hos människor, inklusive ett dysbiotiskt mikrobiom, upprepade episoder av hypoxi och frånvaro av bröstmjölksmatning 5,8,10,11. Dessutom observerades det inflammatoriska svaret och patologiska förändringar under experimentell NEC parallell human sjukdom 5,9,12. Även om dessa modeller efterliknar många av egenskaperna hos mänsklig NEC, finns det inneboende skillnader mellan patofysiologin hos NEC hos djur och människor. Till exempel induceras den murina modellen av NEC hos möss som föds fullgångna, och även om deras tarmutveckling är ofullständig är patofysiologin för NEC i sig annorlunda i detta kliniska sammanhang. Genuttrycket i tarmen hos möss vid födseln liknar det hos ett pre-livsdugligt mänskligt foster och liknar inte det hos ett för tidigt fött nyfött barn i graviditetsvecka 22-24 fram till dag 14 (P14)13. Detta förbryllar den murina NEC-modellen eftersom tarmskador i allmänhet inte kan induceras hos möss efter P10. Dessutom saknar inavlade musstammar den immunologiska14 och mikrobiologiska mångfalden hos nyfödda barn15, vilket är en annan förväxlingsfaktor. Således förbättrar ökad inkorporering av primära humanprover i NEC-forskning den kliniska relevansen av studier inom detta område.

Studier av mekanismerna för NEC in vitro har traditionellt använt monotypiska cellinjer som härrör från vuxna tarmcancerceller, såsom kolorektal adenokarcinom (Caco2) och humant kolonadenokarcinom (HT-29) celler16. Dessa modeller är praktiska men begränsade i fysiologisk relevans på grund av deras tillväxt från vuxna cancerceller, icke-polariserad arkitektur och fenotypiska förändringar relaterade till upprepade passager i odling. Intestinala enteroider förbättrar dessa modeller eftersom de kan odlas från tarmvävnadens kryptor, differentieras i alla tarmepitelsubtyper och bilda en tredimensionell (3D) villusliknande struktur17,18,19,20. Nyligen har tarmenteroider kombinerats med mikrofluidikteknik för att utveckla en tunntarm-på-en-chip-modell och ge ett mer fysiologiskt relevant in vitro-modellsystem 21.

De första organ-on-a-chip-mikrofluidikenheterna introducerades i början av 2000-talet22,23,24. Den första organ-on-a-chip-modellen var den mänskliga andningen lung-on-a-chip25. Detta följdes av många modeller av enskilda organ som tarm 21, lever 26, njurar 27, benmärg 28, blod-hjärnbarriär 29 och hjärta30. Dessa organ-on-a-chip-modeller har använts för att studera akuta, kroniska och sällsynta sjukdomar, inklusive akut strålningssyndrom,31 kronisk obstruktiv lungsjukdom,32 och neurodegenerativa sjukdomar 33. Den polariserade karaktären hos cellerna på dessa chips och närvaron av två cellulära fack åtskilda av ett poröst membran möjliggör modellering av komplexa fysiologiska processer såsom perfusion, kemiska koncentrationsgradienter och immuncellskemotaxi34,35. Dessa mikrofluidiska system ger därmed ett nytt verktyg för att studera patofysiologin och mekanismerna för mänskliga sjukdomar.

Tunntarmen-på-ett-chip-modellen beskrevs av Kasendra et al. 2018, som använde pediatriska (i åldrarna 10-14 år) tunntarmsbiopsiprover differentierade till enteroider och odlade på en mikrofluidisk enhet21. Vaskulära endotelceller, kontinuerligt mediaflöde och stretch/relaxation inkorporerades också i denna modell. De observerade differentiering av tarmepitelsubtyp, bildning av 3D-villusliknande axlar, slemproduktion och genuttrycksmönster i tunntarmen21. Denna mikrofluidiska modell tillämpades på neonatal sjukdom med utvecklingen av NEC-on-a-chip-systemet, som innehåller neonatala tarmenteroider, endotelceller och mikrobiomet från ett nyfött barn med NEC36. NEC-on-a-chip rekapitulerar många av de kritiska egenskaperna hos humant NEC, inklusive inflammatoriskt genuttryck, förlust av specialiserade epitelceller och nedsatt tarmbarriärfunktion36. Således har denna modell många tillämpningar i studiet av NEC, inklusive mekanistiska studier och läkemedelsupptäckt. I detta manuskript tillhandahålls ett detaljerat protokoll för prestanda för NEC-on-a-chip-modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Enteroider härleddes från tunntarmsprover från för tidigt födda barn (födda vid 22 till 36 veckors graviditet) som erhölls vid tidpunkten för operation för NEC eller andra tarmsjukdomar med icke-inflammatoriska etiologier. All provtagning och bearbetning utfördes efter informerat samtycke och godkännande från Institutional Review Boards vid Washington University i St. Louis (IRB-protokollnummer 201706182 och 201804040) och University of North Carolina at Chapel Hill (IRB-protokollnummer 21-3134).

1. Isolering och plätering av kryptor från mänsklig neonatal tunntarm för att etablera enteroider

  1. Förberedelse av media
    1. Förbered alla medier som behövs enligt beskrivningen i tabell 1. Se till att aseptisk teknik används för beredning av alla medier. Filtrera steriliserande media med ett 0,2 μm filter och förvara vid 4 °C tills det används.
  2. Tvättning och malning av tarmvävnad
    1. Placera cellodlingsmatrishydrogelen på is för att tina. Ta mänsklig tarmvävnad från operationssalen. Placera omedelbart provet i 5 ml iskallt vävnadstvättmedium för att inaktivera endogena proteaser.
    2. Spola tarminnehållet med iskall Dulbeccos fosfatbuffrade koksaltlösning (D-PBS) med en 10 ml spruta försedd med en trimmad P1000-pipettspets. Överför tarmvävnaden till en 35 mm skål som innehåller 5 ml iskall D-PBS.
    3. Klipp tarmvävnaden i längdriktningen för att exponera lumen och klipp den i små bitar med en fin sax. Skölj tarmvävnaden genom att försiktigt röra om i D-PBS i vävnadsodlingsskålen.
    4. Överför vävnadsfragment till en ren 35 mm skål. Hacka vävnad med en fin sax. Den optimala storleken är 0,5 cm2 per styck. Tarmvävnaden ska passera genom en trimmad 1 ml pipettspets.
  3. Dissocierande tarmvävnad
    1. Tillsätt 1 ml förvärmt kollagenas I till vävnaden. Blanda vävnad med kollagenas genom pipettering 10-15 gånger och överför till ett 15 ml koniskt rör.
    2. Fäst röret horisontellt på en shaker inställd på 50 rpm. Skaka i 20 minuter i rumstemperatur.
    3. Efter inkubationen avlägsnas rören från skakapparaten och lösningen återsuspenderas genom pipettering 10-15 gånger. Valfritt: Ta bort en liten alikvot för att verifiera närvaron av enstaka kryptor med hjälp av faskontrastmikroskopi.
  4. Isolering av tarmkryptor
    1. Filtrera kryptor genom en 70 μm sil till ett 50 ml koniskt rör på is. Tvätta silen med 9 ml iskallt tvättmedel. Överför filtratet till ett 15 ml koniskt rör.
    2. Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C och ta försiktigt bort supernatanten. Det kommer att finnas cirka 200 μL media kvar i röret. Återsuspendera pelleten i 5 ml av det iskalla tvättmediet.
    3. Centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C. Återsuspendera pelleten i 1 ml vävnadstvättmedel och överför till ett 1.5 ml mikrocentrifugrör.
    4. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C för att pelletera kryptorna. Aspirera försiktigt och fullständigt supernatanten så mycket som möjligt med hjälp av en pipett. Placera röret på is.
  5. Plätering av tarmkryptor
    1. Återsuspendera pelleten i cellodlingsmatrishydrogel (20 μL/brunn på en vävnadsodlingsplatta med 48 brunnar) med hjälp av en förkyld pipettspets för att göra en homogen suspension av kryptor medan röret förblir på is. Undvik att göra bubblor när du pipetterar. Håll röret på is tills det är klart att användas.
      OBS: Cellkulturmatrishydrogelen kommer att polymeriseras vid temperaturer över 8 °C. Kryptor isolerade från en bit tarmvävnad 0,5 cm-1 cm lång pläteras i allmänhet i 10 brunnar av en 48-brunnars vävnadsodlingsplatta.
    2. Platta hydrogelsuspensionen från kryptan/cellodlingsmatrisen i en förvärmd vävnadsodlingsplatta med 48 brunnar. Värm plattan för att hjälpa till att stelna matrisen. Placera suspensionen i mitten av brunnen. Undvik bubblor vid plätering.
    3. Inkubera plattorna i 20 minuter vid 37 °C för att polymerisera matrisen. Det är viktigt att cellkulturens matrishydrogel polymeriseras helt innan media tillsätts.
    4. Efter att matrisen har polymeriserats, tillsätt 300 μL förvärmda 50 % L-WRN-konditionerade medier till varje brunn. Inkubera vid 37 °C, 5 % CO2
    5. Byt media var 2:e till 3:e dag. Byt ut mot varma 50 % L-WRN-konditionerade medier. Passage var 7:e till 10:e dag. Passageenteroider när de är 50%-90% sammanflytande och uppvisar knoppbildning.
      OBS: Materialet kan behöva bytas oftare om det blir gult. Passagefrekvensen beror på enteroiddensiteten och tillväxthastigheten för en viss patients celler. Enteroider måste passera om deras centrum blir mörkt till utseendet.
  6. Passage av enteroiderna
    1. Aspirera försiktigt media från brunnarna. Tvätta brunnarna noggrant med 500 μL varm D-PBS. Var försiktig så att du inte stör matrisen.
    2. Tillsätt 250 μl kylcellsåtervinningslösning till varje brunn. Skrapa botten av varje brunn med en ny pipettspets för att störa cellkulturens matrishydrogel. Inkubera plattan på is i 30 min.
    3. Dissociera enteroider genom kraftig pipettering (~25-50 gånger med P200-pipett) och tillsätt 500 μL vävnadstvättmedel.
    4. Överför enteroidsuspensionen till ett 15 ml rör och tillsätt ytterligare 5 ml kall vävnadstvätt. Pipettera försiktigt för att bilda en homogen lösning.
    5. Centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C för att pelletera enteroiderna. Placera tuben på is och aspirera supernatanten så fullständigt som möjligt. Det kommer att finnas cirka 30-60 μL kvar i röret.
      OBS: Om det finns svårigheter att bryta upp enteroiderna med pipettering kan 0,25 % trypsin-EDTA eller enzymatiskt dissociationsreagens användas för att underlätta denna process.
    6. Återsuspendera enteroider i restvolymen av tvättmedia med en P200-pipett. Undvik bubbelbildning vid pipettering.
    7. Tillsätt 20 μl cellodlingsmatrishydrogel per ny brunn på en platta med 48 brunnar till enteroidsuspensionen. Dela enteroiderna 1:3, 1:4 eller 1:5, beroende på deras densitet.
    8. Tillsätt suspensionen till en förvärmd 48-hålsplatta. Inkubera plattan vid 37 °C i 20 minuter för att stelna matrisen.
    9. Efter polymerisation, tillsätt 300 μL förvärmda 50 % L-WRN-konditionerade medier till varje brunn. Inkubera vid 37 °C, 5 % CO2

2. Neonatal tarm-på-en-chip-modell

OBS: För detaljerade instruktioner om hantering av mikrofluidiska chips och användning av denna utrustning, se tillverkarens tolvfingertarmschipodlingsprotokoll37.

  1. Förberedelse av media
    1. Förbered allt material som behövs enligt beskrivningen i tabell 2. Se till att aseptisk teknik används. Filtrera steriliserande media med ett 0,2 μm filter och förvara vid 4 °C tills det används.
  2. Dag (-3): Upptining och expansion av humana tarmmikrovaskulära endotelceller (HIMEC)
    1. Tina en flaska med HIMEC och platta enligt tillverkarens rekommendationer.
    2. Täck en 25 cm 2-kolv med gelatinbaserad beläggningslösning i2 min. Ta bort överflödig lösning. Tillsätt HIMEC (ca 0,5–1 x 106 celler) som återsuspenderats i 6 ml HIMEC-media till kolven. Inkubera vid 37 °C, 5 % CO2
    3. Byt HIMEC-media var 48:e timme. Tillsätt HIMEC till endotelkanalen (botten) på chipet inom 48-72 timmar efter att det blivit 100 % sammanflytande.
  3. Dag (-1): Aktivering och beläggning av chipsen före tillsats av enteroiderna
    1. Bered pulver av chipaktiveringsreagens 1 (CR-1) för att göra CR-1-lösning. Se till att CR-1-pulver och chipaktiveringsreagens 2 (CR-2) lösning har rumstemperatur för detta steg.
      OBS: Håll CR-1-pulvret och CR-1-lösningen som bereds i följande steg alltid skyddade från ljus. Ljuset ska vara släckt i huven för dessa steg.
      1. Placera chipet och flisbäraren i chipvaggan och placera dem sedan i en vävnadsodlingsskål i cellodlingskåpan. Se tillverkarens protokoll för rätt teknik för chipplacering i hållaren37.
      2. Tillsätt 1 ml CR-2-lösning till injektionsflaskan med CR-1-pulver och överför sedan lösningen direkt från CR-1-injektionsflaskan med pulver till en 15 ml tub insvept i aluminiumfolie för att skydda den från ljus. Blanda inte lösningen med pipetten. Målet är att undvika att bubblor bildas.
      3. Tillsätt ytterligare 1 ml CR-2-lösning till injektionsflaskan med CR-1 och överför till 15 ml slangen. Upprepa för totalt 4 sköljningar och totalt 4 ml CR-2 sköljt genom injektionsflaskan med CR-1. Sätt på locket på injektionsflaskan och vänd upp och ner för den sista sköljningen för att ta bort eventuella rester av pulver.
      4. Tillsätt ytterligare 6 ml CR-2 till 15 ml-röret som innehåller CR-1 för en slutlig volym på 10 ml (0,5 mg/ml). Blanda denna lösning med en pipett utan att tillföra bubblor. Se till att CR-1 är helt upplöst innan du går vidare till nästa steg.
    2. Tillsats av CR-1-lösning till chip
      OBS: Det är viktigt att undvika att introducera bubblor i kanalerna när du lägger till dessa lösningar. CR-1-lösningen ska förbli skyddad från ljus för detta steg.
      1. Använd en 200 μL pipettspets och tillsätt 20 μL CR-1-lösning till den nedre kanalens inlopp tills lösningen börjar lämna den nedre kanalens utlopp. Tillsätt 50 μl CR-1-lösning genom den övre kanalens inlopp tills lösningen börjar lämna den övre kanalens utlopp. Ta bort eventuellt överskott av CR-1-lösning från spånets yta genom försiktig aspiration.
        OBS: Lösningar bör alltid läggas till i den nedre kanalen före den övre kanalen. Om bubblor noteras, spola båda kanalerna med CR-1-lösning och upprepa 2.3.2.1.
      2. Om locket på vävnadsodlingsskålen som innehåller chipsen är på plats, ta bort det för detta steg. Placera chipsen under UV-ljus i 15 minuter. Ta bort CR-1 från de övre och nedre kanalerna.
      3. Upprepa steg 2.3.2.1 till 2.3.2.2 för totalt två UV-aktiveringssteg. Efter detta steg är chipsen inte längre ljuskänsliga.
      4. Ta bort CR-1 från de övre och nedre kanalerna. Tvätta båda kanalerna med 100 μL CR-2-lösning. Ta bort CR-2-lösningen från de övre och nedre kanalerna.
      5. Tvätta båda kanalerna med 100 μL steril D-PBS. Upprepa tvättarna 2 gånger. Tillsätt 100 μL D-PBS till båda kanalerna. Ta bort överskott från spånytan men lämna kanalerna fulla.
    3. Bestryk kanalerna med den extracellulära matrisen.
      1. Tina fibronektin, kollagen IV och cellodlingsmatrishydrogel på is omedelbart före detta steg och förvara dessa lösningar på is under resten av detta avsnitt.
      2. Bered följande lösningar för extracellulär matris (ECM) för chipets övre och nedre kanaler:
        Toppkanal: 100 μL 200 μg/ml kollagen typ IV och 100 μg/ml cellodlingsmatrishydrogel i D-PBS per chip.
        Nedre kanal: 100 μL 200 μg/ml typ IV-kollagen och 30 μg/ml fibronektin i D-PBS per chip.
      3. Ta bort D-PBS helt från de övre och nedre kanalerna. Tillsätt 50 μL ECM till den nedre kanalens inlopp tills en droppe syns på utloppet. Upprepa för den övre kanalen. Se till att använda lämpliga ECM-lösningar för varje kanal och lägg till lösningen i den nedre kanalen först.
      4. Tillsätt D-PBS till spånvaggans behållare och sätt tillbaka locket på vävnadsodlingsplattan. Placera chipsen i en fuktad 37 °C, 5 % CO2 inkubator över natten.
  4. Dag (0): Sådd av chips med HIMEC och enteroider
    1. Vakuumjämvikt för media
      1. Tillsätt erforderlig volym HIMEC-media och chipexpansionsmedia för att slutföra experimentet till ett sterilt 50 ml koniskt rör. Utjämna mediet till 37 °C i ett vattenbad i minst 1 timme.
      2. Anslut vakuumfiltreringsanordningen till 50 ml rör som innehåller uppvärmda medier. Rören ska orienteras med det förvärmda mediet i botten av det 50 ml koniska röret. Vakuum vid -70 kPa eller högre i 10 s.
      3. Vänd rören så att materialet rör sig genom filtret. Fortsätt att dammsuga i 5 min. När vakuumfiltreringen är klar, ta bort vakuumfiltreringsanordningen och placera de 50 ml rören som innehåller media i 37 °C-inkubatorn.
    2. Tvätta chipsen
      1. Tvätta endotelkanalen genom att spola med 100 μL förvärmt HIMEC-media.
        Tvätta epitelkanalen genom att spola med 100 μl förvärmt spånexpansionsmedium. Ta bort alla medier som sprids på spånens yta.
      2. Upprepa tvättsteget. Media bör finnas kvar i kanalerna samt inlopps- och utloppsportarna efter dessa spolningar. Sätt tillbaka locket på odlingsskålen som innehåller chipsen och lägg tillbaka i inkubatorn tills den ska användas.
    3. Skörd av HIMEC
      1. Aspirera media från 25 cm 2-kolven som innehåller HIMEC. Tvätta monolagret försiktigt med D-PBS. Tillsätt 2 ml förvärmd 0,05 % trypsin-EDTA i kolven och skölj försiktigt över monolagret.
      2. Inkubera kolven vid 37 °C i 2–5 minuter. Neutralisera trypsin med 10 ml HIMEC-media. Omsuspendera cellerna i mediet och överför dem till ett 15 ml rör.
      3. Centrifugera i cellerna 150 x g i 5 minuter vid 4 °C. Återsuspendera celler i 200 μl HIMEC-media.
      4. Ta bort 10 μL celler och lägg röret på is. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Den önskade koncentrationen av HIMEC är 6 x 10 6 till 8 x 106 celler/ml.
    4. Sådd av HIMEC på chipet
      1. Ta bort chipet från inkubatorn och för in det i huven. Sug upp alla medier som kan ha läckt ut på chipets yta.
      2. Spola chipets epitelkanal (överst) med 100 μL förvärmt chipexpansionsmedium. Spola chipets endotelkanal (bottenkanal) med 100 μL förvärmt HIMEC-media.
      3. Blanda försiktigt om HIMEC för att uppnå en homogen fördelning. Ta bort mediet helt från endotelkanalen (botten). Tillsätt 10 μL HIMEC (~36 000 celler/chip) till endotelkanalen (den nedre).
        OBS: Om det är svårt att fylla HIMEC-kanalen utan bubbelbildning vid användning av 10 μL HIMEC, öka volymen tillsatta celler. Det bör vara samma antal celler per chip.
      4. Tillsätt ytterligare organoidtillväxtmedia till epitelkanalen (överst) om den inte är full. Kontrollera såddtätheten för HIMEC. Om de inte är jämnt fördelade och inte täcker 80%-90% av spånytan, spola kanalen och upprepa sådden.
      5. Vänd upp och ner på chipet i flilugn i cellodlingsskålen. Tillsätt D-PBS i behållaren i spånvaggan. Sätt tillbaka locket på cellodlingsskålen och placera den i inkubatorn.
      6. Låt chipet vara uppochnedvänt vid 37 °C i 2-3 timmar så att HIMEC kan fästa på spånmembranet. När inkubationen är klar, sätt tillbaka flis-/flitvaggan till upprätt läge.
      7. Tvätta försiktigt endotelkanalen (bottenkanalen) med 100 μL varmt HIMEC-media. Lämna media i kanalen. Tvätta försiktigt epitelkanalen (översta kanalen) med 100 μL organoidtillväxtmedia. Lämna media i kanalen.
      8. Sätt tillbaka spånen i 37 °C-inkubatorn medan du slutför nästa steg.
    5. Skörd av enteroider och sådd på flis
      OBS: Chips är sådda med enteroider som delades 10-14 dagar tidigare, är 50%-75% sammanflytande och vid passage 7 och 20. Se figur 2 för uppkomsten av enteroider på dag 0. Den tid som krävs för att enteroider ska vara redo för sådd beror på tillväxthastigheten för en viss patients celler.
      1. Aspirera försiktigt media från brunnarna. Skölj noggrant brunnar som innehåller cellodlingsmatrishydrogel med 500 μL varm D-PBS. Var försiktig så att du inte stör cellodlingsmatrishydrogelen.
      2. Tillsätt 250 μl kylcellsåtervinningslösning till varje brunn. Repa botten av varje brunn med en ny pipettspets för att störa cellodlingsmatrishydrogelen. Tillsätt innehållet i brunnarna i ett kallt 15 ml rör på is.
      3. Inkubera röret på is i 45 minuter och vänd röret var 3-5:e minut. Under detta steg, förbered enteroiddissociationsmedia. Placera detta medium i vattenbadet vid 37 °C när det är 10 minuter kvar av inkubationssteget.
      4. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C för att pelletera enteroiderna. Ta bort supernatanten.
      5. Tillsätt 2 ml enteroiddissociationsmedia per skördad platta till pelleten och placera i ett 37 °C vattenbad i 60 s till 120 s. Virvla försiktigt röret under inkubationen. Inkubera tillräckligt länge för att uppnå fragmenterade enteroider men utan dissociation till en encellssuspension.
      6. Efter inkubationen, tillsätt 10 ml kall vävnad tvättmedel till varje 15 ml rör. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C för att pelletera enteroiderna. Aspirera supernatanten helt.
      7. Återsuspendera pelleten i 200 μl spånexpansionsmedia. Dissociera enteroider genom kraftig pipettering (~25-50 gånger med P200-pipett).
      8. Kombinera cellerna till ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Pipettera försiktigt för att bilda en homogen lösning. Målet är att så chipet med fragmenterade enteroider i små kluster om 10-30 celler.
      9. Avlägsna 10 μl cellsuspension för räkning. Lägg den återstående cellsuspensionen på is. Justera volymen på chipexpansionsmediet för att uppnå en koncentration på 6 x 106 celler/ml.
        OBS: Det kan vara nödvändigt att centrifugera enteroiderna och återsuspendera dem i en mindre medievolym för att uppnå erforderlig densitet.
      10. För in mikrofluidikchipsen i huven och aspirera mediet från chipets epitelkanal (överst). Ladda chipets övre kanal med 30 μL återsuspenderade celler (~180 000 celler/chip). Säkerställ fullständig och enhetlig täckning av chipets epitelkanal för bildandet av ett monolager. Om detta inte uppnås, skölj enteroiderna genom chipet och plantera om dem.
        OBS: Om det är svårt att uppnå en enhetlig suspension vid laddning av flera chips, kan enteroiderna separeras i 40 μL alikvoter i individuella 1.5 ml mikrocentrifugrör. Detta minimerar variabiliteten i enteroidnummer och fragmentstorlek när inläsningen fortsätter.
      11. Lägg tillbaka flisen i flisvaggan i cellodlingsskålen (om de har tagits bort). Tillsätt D-PBS i behållaren i spånvaggan. Sätt tillbaka locket på cellodlingsskålen och lägg pommes fritesen vid 37 °C, 5 % CO2 över natten.
  5. Dag (1): Förbereda baljor och introducera flöde till chips
    1. För in chipsen i vävnadsodlingskåpan. Spola försiktigt epitelkanalen två gånger med 100 μL chipexpansionsmedia. Spola endotelkanalen försiktigt två gånger med 100 μL HIMEC-media. Ta bort överflödigt material från spånytan.
    2. Prime pods och reglera enligt tillverkarens protokoll37. Tillsätt 2 ml lämpligt medium till inloppsbehållarna. Tillsätt 300 μl av lämpligt medium till utloppsbehållarna. Flödeshastigheten kommer att vara 30 μL/h. Stretch kommer inte att påbörjas ännu.
  6. Dag (2): Övervakning av utveckling av monolager och byte av media
    1. Pausa odlingsmodulen och ta med kapslarna in i huven.
    2. Inspektera chips och baljor för bubblor. Undersök epitelmonolagret med hjälp av ett faskontrastmikroskop. Ta bilder på konsekventa platser över chipet för att övervaka förloppet. Föreställ dig chipsen medan de finns kvar i kapslarna.
    3. Ta bort mediet från de övre kanalinloppsbehållarna och byt ut det mot 2 ml spåndifferentieringsmedia. Tillsätt 1 ml HIMEC-media till den nedre kanalens inloppsbehållare. Lämna tillräckligt med media i inloppsbehållarna för att säkerställa att behållarens botten förblir täckt med ett tunt lager media.
    4. Sätt tillbaka kapslarna i odlingsmodulen och starta om flödet vid 30 μL/h.
  7. Dag (3): Övervaka utvecklingen av ett enda lager, initiera stretch och lägga till media
    1. Upprepa steg 2.6.1.1. och 2.6.1.2. Tillsätt 1 ml spåndifferentieringsmedia till den övre kanalens inloppsbehållare och tillsätt 1 ml HIMEC-media till den nedre kanalens inloppsbehållare.
      OBS: Ta bort media från utloppsbehållarna på båda kanalerna när de börjar nå 50-75 % kapacitet.
    2. Returnera poddarna till kulturmodulen. Starta om flödet vid 30 μL/h och initiera töjning vid 2 % töjning och en frekvens på 0,2 Hz.
  8. Dag (4): Övervaka utvecklingen av ett enda lager, öka sträckningen och lägga till media
    1. Upprepa steg 2.6.1.1. och 2.6.1.2. Tillsätt 1 ml spåndifferentieringsmedia till den övre kanalens inloppsbehållare och tillsätt 1 ml HIMEC-media till den nedre kanalens inloppsbehållare.
      OBS: Ta bort media från utloppsbehållarna på båda kanalerna när de börjar nå 50-75 % kapacitet.
    2. Returnera poddarna till kulturmodulen. Starta om flödet vid 30 μL/h och öka töjningen till 10 % töjning och en frekvens på 0,2 Hz.
  9. Dag (5) till dag (7): Övervaka utveckling av monolager och lägga till media
    1. Upprepa steg 2.6.1.1. och 2.6.1.2. Tillsätt 1 ml spåndifferentieringsmedia till den övre kanalens inloppsbehållare och tillsätt 1 ml HIMEC-media till den nedre kanalens inloppsbehållare.
    2. Gå tillbaka till odlingsmodulen och starta om flödet och stretchen. När villus-liknande axlar har visualiserats, fortsätt till NEC-on-a-chip-modellen.

3. NEC-on-a-chip-modell

  1. Bakterieodling i tarmen
    OBS: Detta steg kräver ett förtitrerat fryst lager av enteriska bakterier från en patient med NEC som förbereds innan detta protokoll påbörjas. För dessa experiment användes en tidigare beskriven polymikrobiell enterisk bakterieslurry från en patient med svår kirurgisk NEC38.
    1. Gör ett 50% glycerollager av enterobakterier och förvara i en -80 °C frys tills vidare användning.
    2. Tina en alikvot av tarmbakterierna och inokulera 10 μL till 3 ml Luria-Bertani (LB) media. Inkubera vid 37 °C med skakning vid 150 varv/min över natten.
    3. Samma dag tvättas kanalerna försiktigt med 100 μl förvärmt antibiotikafritt chipdifferentieringsmedium (övre kanalen) eller 100 μl förvärmt antibiotikafritt HIMEC-medium (nedre kanalen). Aspirera mediet helt och upprepa spolningen i totalt 3 tvättar.
    4. Efter aspirering av den tredje tvätten, byt ut materialet i kanalerna och låt det sitta kvar.
    5. Skölj de övre och nedre kanalernas inloppsbehållare med steril D-PBS och fyll sedan på med 3 ml lämpligt antibiotikafritt medium. Prima pods och reglera som i 2.5.2.
    6. Sätt tillbaka chipet i odlingsmodulen och återinitiera sträckning och flöde.
    7. Följande morgon tar du 1 ml av den nattliga bakteriekulturen och inokulerar den i 25 ml färskt LB-media.
    8. Sätt tillbaka den nya kulturen i 37 °C-skakapparaten tills OD600 når 0,6 ± 0,02 mätt med en 1 cm kyvett. Späd bakteriekulturen till 7 x 108 kolonibildande enheter/ml i antibiotikafria chipexpansionsmedier.
    9. Spara en alikvot av denna gröda för att bekräfta koncentrationen av inokulatet39. Det kan vara nödvändigt att justera koncentrationen av bakterierna beroende på epitelets svar.
    10. Ta bort mediet från epitelkanalen (överst). Tillsätt 30 μl av bakteriekulturen utspädd i antibiotikafria chipexpansionsmedier till chipets övre kanal. Var mycket noga med att undvika korskontaminering av HIMEC-kanalen (endotel) med bakterier. Ta bort eventuellt extra material från chipets yta.
    11. Låt chipsen förbli under statiska förhållanden i 30 minuter för att underlätta bakteriell vidhäftning till den apikala sidan av neonatala epitelet. Efter inkubationen, spola den övre kanalen med 100 μL antibiotikafritt expansionsmedium för att avlägsna bakterier som inte sitter fast. Sätt tillbaka flisen i odlingsmodulen och återinitiera sträckning och flöde.
    12. Var 24:e timme tar du bort kapslarna från odlingsmodulen och spolar långsamt 100 μL antibiotikafritt chipexpansionsmedium genom epitelkanalen. Detta kommer att hjälpa till att förhindra bakteriell överväxt.

4. Analys av tarmpermeabilitet

OBS: Detta kan utföras när som helst under protokollet. Om den initieras när chip sås kan tarmpermeabilitetsanalysen användas för att seriellt bedöma sammanflöde i flera lager. Om den initieras vid tillsats av tarmbakterier kan denna analys användas för att bestämma tarmbakteriernas inflytande på tarmepitelens monolagerintegritet.

  1. Ta bort media från inloppsbehållaren för epitelkanalen (den övre). Tillsätt lämpligt medium som innehåller permeabilitetsfärgämne (50 μg/ml) till inloppsbehållaren. Använd antibiotikafria chipdifferentieringsmedier för NEC-on-a-chip-modellen.
  2. Samla upp avloppsvattnet från epitel- och endotelkanalerna var 24:e timme. Kvantifiera koncentrationen av permeabilitetsfärgämne med hjälp av en mikroplattläsare enligt Lanik et al.36.

5. Immunhistokemi

  1. Tvätta försiktigt den nedre kanalen och den övre kanalen på chipet med 200 μL D-PBS. Aspirera D-PBS helt från kanalerna.
  2. Fixera cellerna genom att spola båda kanalerna med 4% paraformaldehyd och lämna lösningen i kanalerna. Aspirera överskott från spånytan. Inkubera i rumstemperatur i 30 min.
  3. Tvätta båda kanalerna med 200 μL D-PBS. Lämna D-PBS i den nedre kanalen och ta bort den helt från den övre kanalen.
  4. Permeabilisera epitelskiktet genom att spola den övre kanalen med 100 μL 0,1 % tvättmedelslösning och lämna lösningen i kanalerna. Sug upp överskottet från spånytan och inkubera i rumstemperatur i 45 minuter.
  5. Tvätta båda kanalerna med 200 μL D-PBS. Lämna D-PBS i den nedre kanalen och ta bort den helt från den övre kanalen.
  6. Tillsätt 10 % åsneserum (eller ett lämpligt blockeringsmedel) till den övre kanalen i 1 timme i rumstemperatur. Tvätta båda kanalerna med 200 μL D-PBS. Lämna D-PBS i den nedre kanalen och ta bort den helt från den övre kanalen.
  7. Späd ut primära antikroppar i 5 % åsnesterum och tillsätt till den övre kanalen på chipet (antikroppar och koncentrationer som tidigare testats finns tillgängliga i Lanik et al.36). Inkubera vid 4 °C över natten.
  8. Tvätta båda kanalerna 3x med 200 μL D-PBS. Lämna D-PBS i den nedre kanalen och ta bort den helt från den övre kanalen.
  9. Utspädda fluorescerande märkta sekundära antikroppar utspädda 1:200 i 5 % åsnesterum i D-PBS och antingen Hoechst 33342 eller DAPI (nukleära infärgningar). Tillsätt sekundära antikroppar till den övre kanalen på chipet. Inkubera i rumstemperatur i 1 timme, skyddad från ljus.
  10. Tvätta båda kanalerna 3x med 200 μL D-PBS. Lämna kanalerna fyllda med D-PBS efter den sista tvätten. Placera chipet i en bildskål med D-PBS för bildtagning med konfokalmikroskopi.
    OBS: Fasta chips, antingen färgade eller ofärgade, kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka i PBS. Se till att kanalerna inte torkar ut under denna period.

6. Isolering av RNA, beredning av cDNA och kvantitativ realtids-PCR

  1. Tvätta försiktigt den nedre kanalen och den övre kanalen på chipet med 200 μL D-PBS. Aspirera D-PBS helt från kanalerna.
  2. Extrahera totalt RNA från cellerna med hjälp av ett RNA-extraktionsreagens enligt tillverkarens instruktioner. För att isolera RNA endast från epitelet, infundera endast genom den övre kanalen.
  3. Kvantifiera RNA-koncentrationen med hjälp av en nanovolymspektrofotometer. Transkribera omvänt 1 μg totalt RNA. Utför kvantitativ realtids-PCR. Primers som tidigare använts i denna modell finns i Lanik et al. 36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enteroider såddes in på den mikrofluidiska anordningen (Figur 1) och odlades enligt beskrivningen ovan. Tillväxten av enteroiderna i cellodlingsmatrishydrogel före sådd och sedan den efterföljande expansionen av tarmepitelcellens monolager efter sådd av enheten övervakades via ljusfältsmikroskopi (figur 2). Ett sammanflytande tarmepitelcellsmonolager som bildades och därefter utvecklades till en mogen 3D-villusliknande struktur (figur 2). Denna mikrofluidiska enhet sådd med ett enteroid-härlett neonatalt tarmepitel och HIMEC är känd som den neonatala tarmen-på-ett chip modell36.

NEC-on-a-chip-modellen utvecklades för att rekapitulera den mikrobiella dysbios som förekommer under neonatal NEC. Denna modell inkluderar tillägg av ett dysbiotiskt mikrobiom från ett nyfött barn med svår NEC till den neonatala tarm-på-en-chip-modellen. Med tillsatsen av detta dysbiotiska mikrobiom ökade uttrycket av en rad proinflammatoriska cytokiner, inklusive tumörnekrosfaktor alfa (TNFα; Figur 3), interleukin (IL)-1 beta (IL-1β)36 och IL-8 detekterades 36. Denna ökning av proinflammatoriska cytokiner speglar vad som observerats för humant NEC36.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av enteroidkultur och mikrofluidikplattformen. Kryptor isoleras från en kirurgiskt resekerad bit av neonatal tarm, och de sås i cellodlingsmatrishydrogel och odlas till tarmenteroider. Enteroider dissocieras och sås i den övre kanalen av mikrofluidikanordningen belagd med extracellulär matris (ECM). Endotelceller (HIMEC) läggs sedan till i den nedre kanalen. Figur skapad med Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Progression av tarmepitelceller odlade med hjälp av den neonatala tarm-på-en-chip-modellen. Bilder tagna med ljusfältsmikroskopi visar neonatala enteroider på dag 0, ett epitelcellmonolager i chipet på dag 3 och synliga villusliknande strukturer på dag 7. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3. NEC-on-a-chip intestinala epitelceller TNFα mRNA-uttryck. Jämförelse av TNFα mRNA-nivåer vid inkubation med enbart media (kontroll) eller ett dysbiotiskt mikrobiom från ett spädbarn med NEC (NEC-on-a-chip) i 24 timmar eller 72 timmar. **** p < 0,0001 jämfört med kontroll 24 timmar; ** p < 0,005 jämfört med kontroll 72 timmar enligt Mann-Whitney U-test. n=9 för manöverorgan 24 h; n=10 för NEC-on-a-chip 24 timmar. n=6 för manöverorganet 72 h; n=5 för NEC-on-a-chip 72 timmar. Data är medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1. Mediesammansättning för kryptisolering och enteroidtillväxt. Se Van Dussen et al.40 och Miyoshi et al.41 för detaljerade metoder som beskriver beredningen av L-WRN-konditionerade medier. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2. Mediesammansättning för NEC-on-a-chip-modellen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta NEC-on-a-chip-system är ett kraftfullt nytt verktyg som kan användas för att modellera patofysiologin hos NEC. Denna plattform ger en komplex mikromiljö som mer liknar in vivo tarmmiljön än tidigare modeller genom att införliva ett samodlingssystem med kontinuerligt luminalt flöde och sträckning. Dessa förhållanden främjar utvecklingen av 3D-villusliknande arkitektur kantad av ett mycket polariserat epitel bestående av mogna epitelsubtyper och täta korsningar (figur 2)36. Dessutom är den apikala epitelytan lättillgänglig för exponering för experimentella stimuli, såsom patienthärledd mikrobiota eller nya terapier. Slutligen kan denna modell också användas för att studera en mängd inflammatoriska och icke-inflammatoriska tarmsjukdomar, samt mekanismer för normal tarmepitelutveckling, genom att använda enteroider som härrör från de relevanta patientpopulationerna. Denna modell gör det möjligt att maximera datainsamlingen från ett enda patientprov, vilket är viktigt med tanke på den begränsade tillgängligheten och storleken på neonatala tarmprover.

Med hjälp av denna modell observerades många av de fysiologiska förändringar i tarmepitelet som uppstår under NEC hos spädbarn. Tillägget av det dysbiotiska mikrobiomet från en patient med svår NEC ledde till uppreglering av inflammatoriska cytokiner (Figur 3), ökad permeabilitet för tarm-på-en-chip-barriären, ökad celldöd, minskad proliferation och förlust av mogna epitelsubtyper36. Således kan framtida studier som använder denna modell fokusera på att fastställa de mekanismer som ligger till grund för utvecklingen av NEC och möjliga terapeutiska interventioner.

Det finns inneboende begränsningar i att implementera en komplex modell som NEC-on-a-chip. Detta system kräver specialutrustning, reagenser och utbildning för att använda mikrofluidikplattformen. Dessutom kräver modellen stor uppmärksamhet på detaljer med noggrann förberedelse av de olika medierna, korrekt sådd av chipet och upprätthållande av steril teknik, vilket är avgörande för framgång. Utredare måste också ha tillgång till tarmprover eller enteroider från neonatala patienter, som i allmänhet endast är tillgängliga på kvartära vårdcentraler med barnkirurger om de inte erhålls genom samarbetspartners. Slutligen ökar införlivandet av ytterligare viktiga komponenter i patofysiologin för NEC, såsom immunceller eller hypoxi, ytterligare svårigheten med denna modell även om den fysiologiska relevansen ökar.

Sammanfattningsvis är NEC-on-a-chip ett viktigt framsteg inom NEC-forskningen som kommer att förbättra kvaliteten på mekanistiska studier och underlätta testning av nya terapier för NEC. Det slutliga målet med denna forskning är att designa och testa riktade terapier som förbättrar resultaten för spädbarn med tarminflammation och NEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter relaterade till detta manuskript.

Acknowledgments

Detta manuskript stöddes av R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) och R01HD105301 (MG) från National Institutes of Health, Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), ett Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), ett UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) genom generöst stöd från donatorer till University of North Carolina i Chapel Hill, och avdelningen för pediatrik vid University of North Carolina i Chapel Hill.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Tags

Mikrofluidisk modell nekrotiserande enterokolit humana neonatala tarmenteroider dysbiotisk mikrobiom komplex patogenes tarmtrånga korsningar tarmbarriärpermeabilitet epitelcellsdöd mikrobiell dysbios dysreglerad inflammation djurmodeller cellinjer tarmorganoider in vitro-modell mikrofluidisk teknologi NEC-on-a-chip prematura nyfödda humana endotelceller läkemedelstestning
Mikrofluidisk modell av nekrotiserande enterokolit som innehåller humana neonatala tarmenteroider och ett dysbiotiskt mikrobiom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter