Summary
该方案描述了坏死性小肠结肠炎（NEC）的 体外 模型，可用于疾病发病机制的机制研究。它的特点是微流控芯片，其中植入了源自人类新生儿肠道、内皮细胞和患有严重 NEC 的新生儿肠道微生物组的肠道类生物。
Abstract
坏死性小肠结肠炎 （NEC） 是一种严重且可能致命的肠道疾病，由于其复杂的发病机制而难以研究，目前尚不完全清楚。NEC 的病理生理学包括肠道紧密连接破坏、肠道屏障通透性增加、上皮细胞死亡、微生物菌群失调和炎症失调。研究NEC的传统工具包括动物模型、细胞系以及人类或小鼠肠道类器官。虽然使用这些模型系统的研究提高了该领域对疾病病理生理学的理解，但它们概括人类NEC复杂性的能力是有限的。现在已经开发了一种使用微流控技术的改进的NEC 体外 模型，称为NEC-on-a-chip。NEC-on-a-chip 模型由一个微流控装置组成，该装置接种了源自早产新生儿的肠样蛋白，与人内皮细胞和来自患有严重 NEC 的婴儿的微生物组共培养。该模型是NEC病理生理学机制研究的宝贵工具，也是新生儿肠道疾病药物发现测试的新资源。在本手稿中，将提供 NEC-on-a-chip 模型的详细说明。
Introduction
坏死性小肠结肠炎 （NEC） 影响早产儿，出生体重 < 1500 g 的早产儿发病率高达 10%1。NEC 的病理生理学很复杂，包括肠上皮损伤、肠紧密连接破坏、肠道屏障通透性增加、免疫失调和上皮细胞死亡 2,3。我们对NEC发病机制的理解仍然不完整，尽管进行了数十年的研究，但仍然没有有效的靶向治疗。
推进NEC研究的一个重大障碍是从人类婴儿中分离出的原代肠道组织的可用性有限且尺寸小。从NEC患儿身上切除的肠道组织通常坏死并严重受损，这使得对疾病发病前机制的研究变得复杂。例如，患有NEC的婴儿的小肠被免疫细胞淹没，并且还观察到肠道干细胞数量减少，上皮细胞增殖减少和上皮细胞凋亡增加4,5,6,7。这导致从这些样品中培养肠上皮细胞以及分离RNA和蛋白质的困难，这些RNA和蛋白质可以在这种恶劣的炎症环境中降解。此外，由于手术NEC婴儿的疾病过程已经晚期，因此对诱发疾病的因素进行机制研究是不可行的。这些局限性导致依赖动物模型进行NEC的机理研究。
已经为小鼠、大鼠、仔猪、兔子和狒狒建立了NEC的动物模型5,8,9,11。动物模型的一个优势是，NEC样肠道疾病是由与人类NEC发病相关的因素诱发的，包括菌群失调的微生物组、反复缺氧发作和缺乏母乳喂养5,8,10,11。此外，在实验性NEC期间观察到的炎症反应和病理变化与人类疾病平行5,9,12。虽然这些模型模仿了人类NEC的许多特征，但NEC在动物和人类中的病理生理学之间存在固有的差异。例如，NEC的小鼠模型是在足月出生的小鼠中诱导的，尽管它们的肠道发育不完整，但NEC的病理生理学在这种临床背景下本质上是不同的。出生时小鼠肠道基因表达与存活前人类胎儿相似，直到第 14 天才接近妊娠 22-24 周的早产新生儿 （P14）13。这混淆了小鼠NEC模型，因为在P10之后通常不能在小鼠中诱导肠道损伤。此外，小鼠的近交系缺乏人类新生儿的免疫学14 和微生物多样性15，这是另一个混杂因素。因此，在NEC研究中增加将原发性人类样本纳入可提高该领域研究的临床相关性。
传统上，对 NEC 体外机制的研究利用了源自成人肠道癌细胞的单型细胞系，例如结直肠腺癌 （Caco2） 和人结肠腺癌 （HT-29） 细胞16。这些模型很方便，但由于它们从成体癌细胞生长、非极化结构以及与培养物重复传代相关的表型变化，因此生理相关性有限。肠样蛋白改进了这些模型，因为它们可以从肠组织的隐窝生长，分化为所有肠上皮亚型，并形成三维 （3D） 绒毛状结构17,18,19,20。最近，肠样蛋白与微流控技术相结合，开发了一种小肠芯片模型，并提供了更具生理相关性的体外模型系统21。
最初的器官芯片微流控设备是在 2000 年代初期推出的22,23,24。第一个器官芯片模型是人类呼吸肺芯片25。紧随其后的是许多单器官模型，如肠 21、肝脏 26、肾脏27、骨髓 28、血脑屏障 29 和心脏30。这些器官芯片模型已用于研究急性、慢性和罕见疾病，包括急性放射综合征、31 慢性阻塞性肺病、32 和神经退行性疾病 33。这些芯片上细胞的极化性质以及由多孔膜隔开的两个细胞区室的存在允许对复杂的生理过程进行建模，例如灌注、化学浓度梯度和免疫细胞趋化性34,35。因此，这些微流控系统为研究人类疾病的病理生理学和机制提供了新的工具。
Kasendra 等人于 2018 年描述了小肠芯片模型，他们利用儿科（10-14 岁）小肠活检标本分化成肠样并在微流控设备上培养21。血管内皮细胞、连续介质流动和拉伸/松弛也被纳入该模型。他们观察到肠上皮亚型分化、3D 绒毛状轴的形成、粘液产生和小肠基因表达模式21。随着 NEC-on-a-chip 系统的开发，该微流控模型被应用于新生儿疾病，该系统结合了新生儿肠样蛋白、内皮细胞和来自 NEC36 新生儿的微生物组。NEC-on-a-chip 概括了人类 NEC 的许多关键特征，包括炎症基因表达、特化上皮细胞的丧失和肠道屏障功能降低36。因此，该模型在NEC研究中有许多应用，包括机理研究和药物发现。在这篇手稿中，提供了NEC-on-a-chip模型性能的详细协议。
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Protocol
肠样蛋白来源于早产儿（妊娠 22 至 36 周出生）的小肠样本，这些样本是在 NEC 或其他具有非炎症性病因的肠道疾病手术时获得的。所有样本采集和处理均在圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会（IRB 协议编号 201706182 和 201804040）和北卡罗来纳大学教堂山分校（IRB 协议编号 21-3134）的知情同意和批准后进行。
1.从人新生儿小肠中分离并铺板隐窝以建立肠样体
- 培养基制备
- 如 表 1 所述准备所需的所有培养基。确保所有培养基的制备都使用无菌技术。使用0.2μm过滤器过滤灭菌培养基，并储存在4°C直至使用。
- 清洗和切碎肠道组织
- 将细胞培养基质水凝胶放在冰上解冻。从手术室获取人体肠道组织。立即将样品置于 5 mL 冰冷的组织洗涤培养基中以灭活内源性蛋白酶。
- 使用装有修剪过的 P1000 移液器吸头的 10 mL 注射器，用冰冷的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （D-PBS） 冲洗肠内容物。将肠道组织转移到含有 5 mL 冰冷 D-PBS 的 35 mm 培养皿中。
- 纵向切割肠组织，露出管腔，用细剪刀切成小块。通过在组织培养皿中轻轻搅拌D-PBS来冲洗肠道组织。
- 将组织碎片转移到干净的 35 mm 培养皿中。用细剪刀切碎纸巾。最佳尺寸为每件 0.5 cm2 。肠道组织应通过修剪过的 1 mL 移液器吸头。
- 解离肠组织
- 向组织中加入 1 mL 预热的胶原酶 I。通过移液 10-15 次将组织与胶原酶混合，然后转移到 15 mL 锥形管中。
- 将管子水平固定在设置为 50 rpm 的振动台上。在室温下摇动20分钟。
- 孵育后，从振荡器中取出试管，并通过移液10-15次重新悬浮溶液。可选：取出一小份等分试样，使用相差显微镜验证是否存在单个隐窝。
- 隔离肠隐窝
- 通过 70 μm 过滤器过滤隐窝到冰上的 50 mL 锥形管中。用 9 mL 冰冷的组织清洗介质清洗过滤器。将滤液转移到 15 mL 锥形管中。
- 在4°C下以300× g 离心10分钟，并轻轻除去上清液。试管中将剩下大约 200 μL 的培养基。将沉淀重悬于 5 mL 冰冷的组织洗涤培养基中。
- 在4°C下以300× g 离心10分钟。 将沉淀重悬于 1 mL 组织洗涤培养基中，并转移到 1.5 mL 微量离心管中。
- 在4°C下以300× g 离心5分钟以沉淀隐窝。使用移液管尽可能小心并完全吸出上清液。将试管放在冰上。
- 电镀肠隐窝
- 使用预冷的移液器吸头将沉淀重悬于细胞培养基质水凝胶（48 孔组织培养板的 20 μL/孔）中，以在试管保持在冰上时形成均匀的隐窝悬浮液。移液时避免产生气泡。将试管放在冰上，直到准备好使用。
注意：细胞培养基质水凝胶将在高于8°C的温度下聚合。 从一块长度为0.5 cm-1 cm的肠组织中分离的隐窝通常接种在48孔组织培养板的10个孔中。 - 将隐窝/细胞培养基质水凝胶悬浮液铺在预热的 48 孔组织培养板中。加热板以帮助基质凝固。将悬浮液放在孔的中心。电镀时避免气泡。
- 将板在37°C下孵育20分钟以聚合基质。在添加培养基之前，细胞培养基质水凝胶必须完全聚合。
- 基质聚合后，向每个孔中加入 300 μL 预热的 50% L-WRN 条件培养基。在37°C，5%CO2下孵育。
- 每 2 到 3 天更换一次介质。用温热的 50% L-WRN 条件培养基替换。每 7 至 10 天一次。当它们汇合 50%-90% 并表现出芽形成时，传代肠样。
注意：如果介质变黄，可能需要更频繁地更换介质。传代频率将取决于肠道密度和特定患者细胞的生长速度。如果肠样体的中心颜色变暗，则需要通过它们。
- 使用预冷的移液器吸头将沉淀重悬于细胞培养基质水凝胶（48 孔组织培养板的 20 μL/孔）中，以在试管保持在冰上时形成均匀的隐窝悬浮液。移液时避免产生气泡。将试管放在冰上，直到准备好使用。
- 传代肠样体
- 轻轻地从孔中吸出培养基。用 500 μL 温热的 D-PBS 仔细清洗孔。注意不要干扰矩阵。
- 向每个孔中加入 250 μL 冷细胞回收溶液。用新鲜的移液器吸头刮擦每个孔的底部，以破坏细胞培养基质水凝胶。将板在冰上孵育 30 分钟。
- 通过剧烈移液（用P200移液管~25-50次）解离肠样蛋白，并加入500μL组织洗涤培养基。
- 将肠样悬浮液转移到 15 mL 试管中，并额外加入 5 mL 冷组织洗涤培养基。轻轻移液以形成均匀的溶液。
- 在4°C下以400× g 离心5分钟以沉淀肠样蛋白。将试管放在冰上并尽可能完全吸出上清液。试管中将剩下大约 30-60 μL。
注：如果用移液法分解肠样蛋白有困难，可以使用0.25%胰蛋白酶-EDTA或酶解离试剂来促进这一过程。 - 用P200移液管将肠样蛋白重悬于洗涤介质的残留体积中。避免移液时形成气泡。
- 将 48 孔板的每个新孔加入 20 μL 细胞培养基质水凝胶到肠样悬浮液中。将肠样体按 1：3、1：4 或 1：5 分开，具体取决于它们的密度。
- 将悬浮液添加到预热的 48 孔板中。将板在37°C孵育20分钟以固化基质。
- 聚合后，向每个孔中加入 300 μL 预热的 50% L-WRN 条件培养基。在37°C，5%CO2下孵育。
2. 新生儿肠道芯片模型
注意：有关处理微流控芯片和使用此设备的详细说明，请参阅制造商的十二指肠肠芯片培养方案37。
- 培养基制备
- 如 表 2 所述准备所需的所有培养基。确保使用无菌技术。使用0.2μm过滤器过滤灭菌培养基，并储存在4°C直至使用。
- 第 （-3 天）：解冻和扩增人肠道微血管内皮细胞 （HIMECs）
- 根据制造商的建议解冻一小瓶 HIMEC 和板。
- 用明胶基包衣溶液涂覆 25 cm 2 烧瓶2 分钟。除去多余的溶液。将重悬于 6 mL HIMEC 培养基中的 HIMEC（约 0.5-1 x 106 个细胞）加入烧瓶中。在37°C，5%CO2下孵育。
- 每 48 小时更换一次 HIMEC 介质。在 100% 汇合后 48-72 小时内将 HIMEC 添加到芯片的内皮（底部）通道。
- 第 （-1 天）：在添加肠样蛋白之前激活和包被芯片
- 将芯片活化试剂 1 （CR-1） 粉末复溶，制成 CR-1 溶液。在此步骤中，确保 CR-1 粉末和芯片活化试剂 2 （CR-2） 溶液在室温下。
注意： 始终保持 CR-1 粉末和按以下步骤制备的 CR-1 溶液避光。在这些步骤中，引擎盖上的灯应该熄灭。- 将芯片和芯片载体放入芯片支架中，然后将它们放入细胞培养罩中的组织培养皿中。有关在载体37 中放置芯片的正确技术，请参阅制造商的协议。
- 将 1 mL CR-2 溶液加入 CR-1 粉末小瓶中，然后将溶液从 CR-1 粉末小瓶直接转移到用铝箔包裹的 15 mL 管中，以避光。不要将溶液与移液器混合。目的是避免气泡的形成。
- 向 CR-1 小瓶中再加入 1 mL CR-2 溶液，然后转移到 15 mL 试管中。重复总共 4 次冲洗，总共 4 mL CR-2 通过 CR-1 小瓶冲洗。将盖子加入小瓶中，倒置进行最后一次冲洗以除去任何残留的粉末。
- 向含有 CR-1 的 15 mL 试管中再加入 6 mL CR-2，最终体积为 10 mL （0.5 mg/mL）。将该溶液与移液器混合，不要引入气泡。在进行下一步之前，确保 CR-1 完全溶解。
- 将 CR-1 解决方案添加到芯片中
注意：在添加这些解决方案时，避免将气泡引入通道至关重要。在此步骤中，CR-1 溶液应保持避光状态。- 使用 200 μL 移液器吸头，将 20 μL CR-1 溶液加入底部通道入口，直到溶液开始离开底部通道出口。通过顶部通道入口加入 50 μL CR-1 溶液，直到溶液开始离开顶部通道出口。轻轻抽吸，从芯片表面去除任何多余的 CR-1 溶液。
注意：解决方案应始终添加到顶部通道之前的底部通道。如果发现气泡，请用 CR-1 溶液冲洗两个通道并重复 2.3.2.1。 - 如果含有芯片的组织培养皿的盖子就位，请将其取下以进行此步骤。将芯片置于紫外线下 15 分钟。从顶部和底部通道中取出 CR-1。
- 重复步骤 2.3.2.1 到 2.3.2.2，总共两个紫外线激活步骤。完成此步骤后，芯片不再对光敏感。
- 从顶部和底部通道中取出 CR-1。用 100 μL CR-2 溶液洗涤两个通道。从顶部和底部通道中取出 CR-2 溶液。
- 用 100 μL 无菌 D-PBS 洗涤两个通道。重复洗涤 2 次。向两个通道中加入 100 μL D-PBS。去除芯片表面的多余部分，但保持通道充满。
- 使用 200 μL 移液器吸头，将 20 μL CR-1 溶液加入底部通道入口，直到溶液开始离开底部通道出口。通过顶部通道入口加入 50 μL CR-1 溶液，直到溶液开始离开顶部通道出口。轻轻抽吸，从芯片表面去除任何多余的 CR-1 溶液。
- 用细胞外基质包被通道。
- 在此步骤之前，立即在冰上解冻纤连蛋白、胶原蛋白 IV 和细胞培养基质水凝胶，并在本节的其余部分将这些溶液保持在冰上。
- 为芯片的顶部和底部通道准备以下细胞外基质 （ECM） 溶液：
顶部通道：每片芯片 100 μL 200 μg/mL IV 型胶原蛋白和 100 μg/mL 细胞培养基质水凝胶的 D-PBS 溶液。
底部通道：每个芯片 100 μL 的 200 μg/mL IV 型胶原蛋白和 30 μg/mL 纤连蛋白的 D-PBS 溶液。 - 从顶部和底部通道中完全去除 D-PBS。向底部通道入口加入 50 μL ECM，直到出口上出现液滴。对上声道重复上述步骤。确保为每个通道使用适当的 ECM 解决方案，并首先将解决方案添加到底部通道。
- 将D-PBS加入芯片支架储液器中，并更换组织培养板上的盖子。将芯片置于加湿的37°C，5%CO2 培养箱中过夜。
- 将芯片活化试剂 1 （CR-1） 粉末复溶，制成 CR-1 溶液。在此步骤中，确保 CR-1 粉末和芯片活化试剂 2 （CR-2） 溶液在室温下。
- 第 （0） 天：接种含有 HIMEC 和肠样蛋白的芯片
- 介质的真空平衡
- 将所需体积的HIMEC培养基和芯片扩增培养基加入无菌50 mL锥形管中以完成实验。在水浴中将培养基平衡至37°C至少1小时。
- 将真空过滤装置连接到装有加热介质的 50 mL 管上。试管的方向应与 50 mL 锥形管底部的预热介质定向。在 -70 kPa 或更高温度下真空 10 秒。
- 翻转管子，使介质通过过滤器。继续抽真空 5 分钟。真空过滤完成后，取出真空过滤装置，将含有培养基的50mL管放入37°C培养箱中。
- 清洗薯片
- 用 100 μL 预热的 HIMEC 培养基冲洗内皮通道。
用 100 μL 预热的芯片膨胀培养基冲洗上皮通道。清除散落在芯片表面的所有介质。 - 重复洗涤步骤。冲洗后，介质应保留在通道以及入口和出口中。盖上装有薯片的培养皿的盖子，然后放回培养箱，直至准备好使用。
- 用 100 μL 预热的 HIMEC 培养基冲洗内皮通道。
- 收获 HIMEC
- 从含有 HIMEC 的 25 cm2 烧瓶中吸出培养基。用D-PBS轻轻洗涤单层。向烧瓶中加入 2 mL 预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，并在单层上轻轻冲洗。
- 将烧瓶在37°C孵育2-5分钟。用 10 mL HIMEC 培养基中和胰蛋白酶。将细胞重悬于培养基中并转移到 15 mL 试管中。
- 在4°C下以150× g 的细胞旋转5分钟。 将细胞重悬于 200 μL HIMEC 培养基中。
- 取出 10 μL 细胞并将试管置于冰上。使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞进行计数。所需的 HIMEC 浓度为 6 x 106 至 8 x 106 个细胞/mL。
- 将 HIMEC 植入芯片
- 从培养箱中取出芯片并将其放入引擎盖中。吸出芯片表面可能泄漏的任何介质。
- 用 100 μL 预热的芯片扩增培养基冲洗芯片的上皮（顶部）通道。用 100 μL 预热的 HIMEC 培养基冲洗芯片的内皮（底部）通道。
- 轻轻地重悬 HIMEC 以获得均匀的分布。从内皮（底部）通道中完全去除培养基。向内皮（底部）通道中加入 10 μL HIMEC（~36,000 个细胞/芯片）。
注意：如果在使用 10 μL HIMEC 时难以填充 HIMEC 通道而不形成气泡，请增加添加的细胞体积。它应该是每个芯片的单元数相同。 - 如果上皮（顶部）通道未满，则向上皮（顶部）通道添加额外的类器官生长培养基。检查 HIMEC 的播种密度。如果它们分布不均匀且未覆盖芯片表面的 80%-90%，请冲洗通道并重复播种。
- 将芯片倒置到细胞培养皿中的芯片支架中。将 D-PBS 添加到芯片支架的储液器中。盖上细胞培养皿的盖子，并将其放入培养箱中。
- 将芯片在37°C下倒置2-3小时，以使HIMEC附着在芯片膜上。孵育完成后，将芯片/芯片支架放回直立位置。
- 用 100 μL 温热的 HIMEC 培养基轻轻洗涤内皮（底部）通道。将媒体保留在频道中。用 100 μL 类器官生长培养基轻轻洗涤上皮（顶部）通道。将媒体保留在频道中。
- 将芯片放回37°C培养箱，同时完成后续步骤。
- 收获肠样体并在芯片上播种
注意：芯片接种有 10-14 天前分裂的肠样蛋白，汇合率为 50%-75%，在第 7 次和第 20 次传代。请参阅 图 2 了解第 0 天肠样蛋白的外观。肠样体准备接种所需的时间将取决于特定患者细胞的生长速度。- 轻轻地从孔中吸出培养基。用 500 μL 温热的 D-PBS 仔细清洗含有细胞培养基质水凝胶的孔。注意不要干扰细胞培养基质水凝胶。
- 向每个孔中加入 250 μL 冷细胞回收溶液。用新鲜的移液器吸头刮擦每个孔的底部，以破坏细胞培养基质水凝胶。将孔内容物加入冰上的冷 15 mL 管中。
- 将试管在冰上孵育 45 分钟，每 3-5 分钟倒置试管一次。在此步骤中，准备肠样解离培养基。将该培养基置于37°C水浴中，当孵育步骤剩余10分钟时。
- 在4°C下以300× g 离心5分钟以沉淀肠样蛋白。除去上清液。
- 将每个收获的板加入2mL肠溶解离培养基到沉淀中，并置于37°C水浴中60秒至120秒。在孵育过程中轻轻旋转试管。孵育足够长的时间以获得片段化的肠样蛋白，但不会解离成单细胞悬液。
- 孵育后，向每个 15 mL 试管中加入 10 mL 冷组织洗涤培养基。在4°C下以300× g 离心5分钟以沉淀肠样蛋白。完全吸出上清液。
- 将沉淀重悬于 200 μL 芯片扩增培养基中。通过剧烈移液（用P200移液器~25-50次）解离肠样体。
- 将细胞合并到无菌的 1.5 mL 微量离心管中。轻轻移液以形成均匀的溶液。目标是将带有片段化的肠样蛋白接种在 10-30 个细胞的小簇中。
- 取出 10 μL 细胞悬液进行计数。将剩余的细胞悬液置于冰上。调整芯片扩增介质的体积，使浓度达到 6 x 106 个细胞/mL。
注意：可能需要离心肠样蛋白并将其重悬于较小体积的培养基中以达到所需的密度。 - 将微流控芯片带入罩中，并从芯片的上皮（顶部）通道吸出培养基。用 30 μL 重悬细胞（~180,000 个细胞/芯片）加载芯片的顶部通道。确保芯片上皮通道的完整和均匀覆盖，以形成单层。如果无法做到这一点，请通过芯片冲洗肠样蛋白并重新播种。
注：如果在加载多个芯片时难以实现均匀的悬浮液，则可以在单独的 1.5 mL 微量离心管中将肠样蛋白分成 40 μL 等分试样。随着上样的进行，这将最大限度地减少肠样数量和片段大小的变异性。 - 将芯片放回细胞培养皿中的芯片支架（如果它们已被移除）。将 D-PBS 添加到芯片支架的储液器中。盖上细胞培养皿的盖子，并将芯片置于37°C，5%CO2 过夜。
- 介质的真空平衡
- 第 （1 天）：准备豆荚并将流量引入切屑
- 将芯片带入组织培养罩。用 100 μL 芯片扩增培养基轻轻冲洗上皮通道两次。用 100 μL HIMEC 培养基轻轻冲洗内皮通道两次。清除芯片表面多余的介质。
- 灌注豆荚并按照制造商的协议进行调节37.向入口储液器中加入 2 mL 适当的培养基。向出口储液槽中加入 300 μL 适当的培养基。流速为 30 μL/h。Stretch 尚未启动。
- 第（2天）：监测单层显影和更换介质
- 暂停培养模块并将豆荚带入引擎盖。
- 检查芯片和豆荚是否有气泡。使用相差显微镜检查上皮单层。在芯片的一致位置捕获图像以监控进度。当芯片留在吊舱中时对它们进行成像。
- 从上通道入口储液槽中取出培养基，并用 2 mL 芯片分化培养基替换。将 1 mL HIMEC 培养基添加到下通道入口储液槽中。在入口储液器中留出足够的介质，以确保储液罐底部仍然覆盖着一层薄薄的介质。
- 将豆荚放回培养模块，并以 30 μL/h 的速度重新开始流动。
- 第 （3 天）：监测单层发育、启动拉伸和添加培养基
- 重复步骤 2.6.1.1。和 2.6.1.2.向上通道入口储液槽中加入 1 mL 芯片分化培养基，向下通道入口储液槽中加入 1 mL HIMEC 培养基。
注意： 一旦两个通道的出口储液器开始达到 50-75% 的容量，请从它们中取出介质。 - 将 Pod 返回到培养模块。以 30 μL/h 重新开始流动，并以 2% 应变和 0.2 Hz 的频率开始拉伸。
- 重复步骤 2.6.1.1。和 2.6.1.2.向上通道入口储液槽中加入 1 mL 芯片分化培养基，向下通道入口储液槽中加入 1 mL HIMEC 培养基。
- 第 （4 天）：监测单层发育、增加拉伸和添加培养基
- 重复步骤 2.6.1.1。和 2.6.1.2.向上通道入口储液槽中加入 1 mL 芯片分化培养基，向下通道入口储液槽中加入 1 mL HIMEC 培养基。
注意： 一旦两个通道的出口储液器开始达到 50-75% 的容量，请从它们中取出介质。 - 将 Pod 返回到培养模块。以 30 μL/h 的速度重新开始流动，并将拉伸增加到 10% 应变和 0.2 Hz 的频率。
- 重复步骤 2.6.1.1。和 2.6.1.2.向上通道入口储液槽中加入 1 mL 芯片分化培养基，向下通道入口储液槽中加入 1 mL HIMEC 培养基。
- 第 （5） 天至第 （7 天）：监测单层显影和添加培养基
- 重复步骤 2.6.1.1。和 2.6.1.2.向上通道入口储液槽中加入 1 mL 芯片分化培养基，向下通道入口储液槽中加入 1 mL HIMEC 培养基。
- 将 Pod 返回到文化模块，然后重新启动 flow 和 stretch。一旦绒毛状轴可视化，就进入 NEC-on-a-chip 模型。
3. NEC-on-a-chip模型
- 肠道细菌培养
注意：此步骤需要在开始此方案之前准备好来自 NEC 患者的预先滴定的肠道细菌冷冻原液。对于这些实验，使用了先前描述的来自一名患有严重外科 NEC 的患者的多微生物肠道细菌浆液38。- 制备50%的肠道细菌甘油储备液，并储存在-80°C冰箱中直至进一步使用。
- 解冻肠道细菌的等分试样，并将 10 μL 接种到 3 mL Luria-Bertani （LB） 培养基中。在37°C下孵育，以150rpm振荡过夜。
- 同一天，用 100 μL 预热的无抗生素芯片分化培养基（顶部通道）或 100 μL 预热的无抗生素 HIMEC 培养基（底部通道）轻轻洗涤通道。完全吸出介质并重复冲洗，总共洗涤 3 次。
- 吸出第三次洗涤后，更换通道中的介质并放置到位。
- 用无菌 D-PBS 冲洗顶部和底部通道入口储液槽，然后填充 3 mL 适当的无抗生素培养基。Prime Pod 并按照 2.5.2 进行调节。
- 将芯片返回到培养模块，然后重新启动拉伸和流动。
- 第二天早上，取 1 mL 过夜细菌培养物，并将其接种到 25 mL 新鲜 LB 培养基中。
- 将这种新培养物放回37°C振荡器中，直到OD600 达到0.6±0.02，使用1cm比色皿测量。在无抗生素芯片扩增培养基中将细菌培养物稀释至 7 x 108 个菌落形成单位/mL。
- 保存该培养物的等分试样以确认接种物的浓度39。可能需要根据上皮的反应调整细菌的浓度。
- 从上皮（顶部）通道中取出培养基。将 30 μL 在无抗生素芯片扩增培养基中稀释的细菌培养物添加到芯片的顶部通道中。要非常小心，避免HIMEC（内皮）通道与细菌交叉污染。从芯片表面取出多余的介质。
- 让芯片在静态条件下保持30分钟，以促进细菌粘附在新生儿上皮的顶端。孵育后，用 100 μL 不含抗生素的扩增培养基冲洗顶部通道以去除未附着的细菌。将芯片返回到培养模块并重新启动拉伸和流动。
- 每 24 小时，从培养模块中取出豆荚，并通过上皮通道缓慢冲洗 100 μL 无抗生素芯片扩增培养基。这将有助于防止细菌过度生长。
4.肠道通透性测定
注意：这可以在协议期间的任何步骤执行。如果在晶片播种时启动，肠道通透性测定可用于连续评估单层汇合度。如果在添加肠道细菌时开始，该测定可用于确定肠道细菌对肠道上皮单层完整性的影响。
- 从上皮（顶部）通道的入口储液器中取出培养基。向入口储液器中加入含有渗透染料 （50 μg/mL） 的适当培养基。将不含抗生素的芯片分化培养基用于 NEC-on-a-chip 模型。
- 每24小时收集来自上皮和内皮通道的流出物。根据 Lanik 等人 36 使用酶标仪量化渗透性染料的浓度。
5. 免疫组化
- 用 200 μL D-PBS 轻轻清洗芯片的底部通道和顶部通道。从通道中完全吸出D-PBS。
- 通过用4%多聚甲醛冲洗两个通道来固定细胞，将溶液留在通道中。从芯片表面吸出多余的。在室温下孵育30分钟。
- 用 200 μL D-PBS 洗涤两个通道。将 D-PBS 留在底部通道中，然后从顶部通道中完全取出。
- 用 100 μL 0.1% 洗涤剂溶液冲洗顶部通道，将溶液留在通道中，从而透化上皮层。从芯片表面吸出多余的，并在室温下孵育45分钟。
- 用 200 μL D-PBS 洗涤两个通道。将 D-PBS 留在底部通道中，然后从顶部通道中完全取出。
- 在室温下向顶部通道中加入10%驴血清（或适当的封闭剂）1小时。用 200 μL D-PBS 洗涤两个通道。将 D-PBS 留在底部通道中，然后从顶部通道中完全取出。
- 在5%驴血清中稀释一抗，并添加到芯片的顶部通道中（先前测试的抗体和浓度可在Lanik等人36中获得）。在4°C孵育过夜。
- 用 200 μL D-PBS 洗涤两个通道 3 次。将 D-PBS 留在底部通道中，然后从顶部通道中完全取出。
- 在 D-PBS 和 Hoechst 33342 或 DAPI（核染色剂）中以 1：200 的比例稀释荧光标记的二抗。将二抗添加到芯片的顶部通道。在室温下孵育1小时，避光。
- 用 200 μL D-PBS 洗涤两个通道 3 次。在最后一次洗涤后，让通道充满 D-PBS。将芯片放入带有D-PBS的成像盘中，以便使用共聚焦显微镜进行图像采集。
注意：固定的芯片，无论是染色的还是未染色的，都可以在4°C下在PBS中储存长达1周。确保在此期间渠道不会干涸。
6. RNA分离、cDNA制备、实时荧光定量PCR
- 用 200 μL D-PBS 轻轻清洗芯片的底部通道和顶部通道。从通道中完全吸出D-PBS。
- 按照制造商的说明，使用RNA提取试剂从细胞中提取总RNA。要仅从上皮细胞中分离RNA，请仅通过顶部通道输注。
- 使用纳米体积分光光度计定量RNA浓度。逆转录 1 μg 总 RNA。进行定量实时荧光定量PCR。先前用于该模型的引物可在 Lanik 等人 36 中获得。
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Representative Results
将肠样体接种到微流控装置上（图1）并如上所述培养。通过明场显微镜监测接种前细胞培养基质水凝胶中肠样蛋白的生长，然后在接种装置后随后的肠上皮细胞单层扩增（图2）。形成汇合的肠上皮细胞单层，随后发育成成熟的 3D 绒毛状结构（图 2）。这种接种有肠源性新生儿肠上皮和 HIMEC 的微流控装置被称为新生儿肠芯片模型36。
NEC-on-a-chip 模型的开发是为了概括新生儿 NEC 期间存在的微生物菌群失调。该模型包括将来自患有严重 NEC 的新生儿的菌群失调微生物组添加到新生儿肠道芯片模型中。随着这种失调微生物组的加入，一系列促炎细胞因子的表达显着增加，包括肿瘤坏死因子α（TNFα;图 3）、白细胞介素 （IL）-1 β （IL-1β）36 和 IL-8 检测 36。促炎细胞因子的这种增加反映了在人类 NEC36 中观察到的情况。
图 1：肠道培养和微流控平台的示意图。 隐窝是从手术切除的新生儿肠片中分离出来的，并将它们接种在细胞培养基质水凝胶中并生长到肠样体中。肠样体被解离并接种在涂有细胞外基质 （ECM） 的微流体装置的顶部通道中。然后将内皮细胞 （HIMEC） 添加到底部通道中。用 Biorender.com 创建的图形。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：使用新生儿肠道芯片模型生长的肠上皮细胞的进展。 使用明场显微镜获得的图像显示第 0 天出现新生儿肠道样体，第 3 天芯片中出现上皮细胞单层，第 7 天显示可见的绒毛样结构。比例尺 = 100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3.NEC-on-a-chip 肠上皮细胞 TNFα mRNA 表达。 与单独培养基（对照）或来自NEC婴儿（NEC-on-a-chip）的菌群失调微生物组孵育24小时或72小时时TNFα mRNA水平的比较<。 ** p < 0.005 与对照组 72 小时通过 Mann-Whitney U 检验。n=9 对照 24 h;n=10 对于 NEC-on-a-chip 24 小时;对照组 72 h，n=6;n=5 对于 NEC-on-a-chip 72 小时。数据均±SEM平均值。 请点击这里查看此图的较大版本.
表 1.用于隐窝分离和肠样生长的培养基组成。 参见Van Dussen等人40和Miyoshi等人41，了解描述L-WRN条件培养基制备的详细方法。 请按此下载此表格。
表 2.NEC-on-a-chip 模型的介质组成。请按此下载此表格。
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Discussion
这种 NEC-on-a-chip 系统是一种强大的新工具，可用于模拟 NEC 的病理生理学。该平台提供了一个复杂的微环境，通过结合具有连续管腔流动和拉伸的共培养系统，比以前的模型更接近 体内 肠道环境。这些条件促进了 3D 绒毛状结构的发展，该结构由高度极化的上皮组成，由成熟的上皮亚型和紧密连接组成（图 2）36。此外，顶端上皮表面很容易接触到实验性刺激，例如患者来源的微生物群或新型疗法。最后，该模型还可用于研究各种炎症性和非炎症性肠道疾病，以及正常肠上皮发育的机制，方法是利用来自相关患者群体的肠样蛋白。该模型允许从单个患者样本中最大限度地采集数据，鉴于新生儿肠道样本的可用性和大小有限，这是必不可少的。
使用该模型，观察到婴儿NEC期间发生的肠上皮的许多生理变化。来自严重 NEC 患者的菌群失调微生物组的添加导致炎性细胞因子上调（图 3）、肠道芯片屏障通透性增加、细胞死亡增强、增殖减少和成熟上皮亚型的丧失36。因此，未来利用该模型的研究可以侧重于确定NEC发展和可能的治疗干预措施的潜在机制。
实现复杂模型（如片上 NEC）存在固有的局限性。该系统需要专门的设备、试剂和培训才能使用微流体平台。此外，该模型需要密切关注细节，准确制备各种培养基，正确播种芯片，并保持无菌技术，这对成功至关重要。研究人员还必须能够获得新生儿患者的肠道样本或肠样蛋白，除非通过合作者获得，否则通常只能在有小儿外科医生的四级护理中心获得。最后，在NEC的病理生理学中加入其他重要成分，如免疫细胞或缺氧，进一步增加了该模型的难度，尽管增加了生理相关性。
总之，NEC-on-a-chip是NEC研究领域的重要进展，将提高机理研究的质量，并促进NEC新疗法的测试。这项研究的最终目标是设计和测试靶向疗法，以改善患有肠道炎症和NEC的婴儿的预后。
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Disclosures
作者声明与本手稿没有利益冲突。
Acknowledgments
这份手稿得到了美国国立卫生研究院的 R01DK118568 （MG）、R01DK124614 （MG） 和 R01HD105301 （MG）、Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 （MG）、Thrasher 研究基金早期职业奖 （LCF）、UNC 儿童发展早期职业调查员资助 （LCF） 的支持，通过捐赠者对北卡罗来纳大学教堂山分校的慷慨支持， 以及北卡罗来纳大学教堂山分校的儿科系。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| A 83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Gibco | 12634010 | |
| B-27 Supplement, serum free (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Basic Bio-kit | Emulate | N/A | |
| BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | Agilent | 7131000 | |
| BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro | BrandTech | 759085D | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| CFX Opus Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chip Cradle | Emulate | N/A | |
| Chip-S1 Stretchable Chip | Emulate | N/A | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates, 48 well | Corning | 3548 | |
| Collagen from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit | Cell Biologics | H-1168 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7132 | Permeability dye |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane | Fisher Scientific | FB12566504 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | Corning | 46-034-CI | |
| ER-1 surface activation reagent | Emulate | ER-1 | Chip Activation Reagent 1 |
| ER-2 surface activation reagent | Emulate | ER-2 | Chip Activation Reagent 2 |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics | 6950 | |
| Genie Temp-Shaker 300 | Scientific Industries, Inc. | SI-G300 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | |
| HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) | Corning | 25-060-CI | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Invitrogen | H3570 | |
| Human Collagen Type I | Sigma-Aldrich | CC050 | |
| Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Biologics | H-6054 | |
| Inverted Microscope | Fisher Scientific | 03-000-013 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Broth (LB) agar, Miller | Supelco | L3027 | |
| L-WRN Cells | American Type Culture Collection | CRL-3276 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356231 | Cell Culture Matrix |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | 1009005 | |
| NAILSTAR UV LAMP | NailStar | NS-01-US | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-274200 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | 72340 | |
| Orb-HM1 Hub Module | Emulate | N/A | |
| Paraformaldehyde | ThermoFisher | 047392.9L | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | |
| Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 | Rainin | 17014966 | |
| Pod Portable Module | Emulate | N/A | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) | Avantor Seradigm | 1500-500 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated | Corning | 431111 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SE1M179M6 | |
| Sterile Cell Strainers, 70um | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Sterile Syringes, 10mL | Fisher Scientific | 14-955-453 | |
| Straight, fine, sharp point scissors | Miltex Instruments | MH5-300 | |
| Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge | Thermo Scientific | 75016052 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA extraction reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 | Corning | 25-900-CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Enzymatic Dissociation Reagent |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 13-998-252 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| Zoë-CM1 Culture Module | Emulate | N/A |
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