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Summary

Este protocolo describe un modelo in vitro de enterocolitis necrotizante (ECN), que puede utilizarse para estudios mecanicistas de patogénesis de la enfermedad. Cuenta con un chip microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados del intestino neonatal humano, células endoteliales y el microbioma intestinal de un neonato con ECN grave.

Abstract

La enterocolitis necrotizante (ECN) es una enfermedad intestinal grave y potencialmente mortal que ha sido difícil de estudiar debido a su compleja patogenia, que sigue sin comprenderse completamente. La fisiopatología de la ECN incluye la alteración de las uniones estrechas intestinales, el aumento de la permeabilidad de la barrera intestinal, la muerte de las células epiteliales, la disbiosis microbiana y la inflamación desregulada. Las herramientas tradicionales para estudiar la ECN incluyen modelos animales, líneas celulares y organoides intestinales humanos o de ratón. Si bien los estudios que utilizan esos sistemas modelo han mejorado la comprensión del campo de la fisiopatología de la enfermedad, su capacidad para recapitular la complejidad de la ECN humana es limitada. Ahora se ha desarrollado un modelo in vitro mejorado de NEC que utiliza tecnología microfluídica, denominado NEC-on-a-chip. El modelo NEC-on-a-chip consiste en un dispositivo microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados de un neonato prematuro, cocultivado con células endoteliales humanas y el microbioma de un lactante con ECN grave. Este modelo es una herramienta valiosa para los estudios mecanicistas sobre la fisiopatología de la ECN y un nuevo recurso para las pruebas de descubrimiento de fármacos para las enfermedades intestinales neonatales. En este manuscrito, se proporcionará una descripción detallada del modelo NEC en un chip.

Introduction

La enterocolitis necrotizante (ECN) afecta a los prematuros, con una incidencia de hasta el 10% en los nacidos con un peso < 1500 g¹. La fisiopatología de la ECN es compleja e incluye daño al epitelio intestinal, alteración de las uniones estrechas intestinales, aumento de la permeabilidad de la barrera intestinal, desregulación inmunitaria y muerte de células epiteliales ^2,3. Nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la patogénesis de la ECN sigue siendo incompleta y, a pesar de décadas de investigación, todavía no existen terapias dirigidas eficaces.

Un obstáculo importante para el avance de la investigación de la ECN es la disponibilidad limitada y el pequeño tamaño del tejido intestinal primario aislado de bebés humanos. El tejido intestinal extirpado de lactantes con ECN suele estar necrótico y gravemente dañado, lo que complica los estudios sobre los mecanismos que preceden a la aparición de la enfermedad. Por ejemplo, el intestino delgado de los lactantes con ECN está inundado de células inmunitarias, y también se observa una reducción del número de células madre intestinales, una disminución de la proliferación de células epiteliales y un aumento de la apoptosis de las células epiteliales 4,5,6,7. Esto conduce a dificultades en el cultivo de células epiteliales intestinales a partir de estas muestras y en el aislamiento de ARN y proteínas, que pueden degradarse en este entorno inflamatorio hostil. Además, dado que el proceso de la enfermedad ya está avanzado en los lactantes con ECN quirúrgica, los estudios mecanicistas sobre los factores que inducen la enfermedad son inviables. Estas limitaciones han llevado a una dependencia de los modelos animales para los estudios mecanicistas de la ECN.

Se han establecido modelos animales de ECN para ratones, ratas, lechones, conejos y babuinos 5,8,9,11. Una fortaleza de los modelos animales es que la enfermedad intestinal similar a la ECN es inducida por factores asociados con la aparición de ECN en los seres humanos, incluido un microbioma disbiótico, episodios repetidos de hipoxia y la ausencia de alimentación con leche materna 5,8,10,11. Además, la respuesta inflamatoria y los cambios patológicos observados durante la ECN experimental son paralelos a la enfermedad humana ^5,9,12. Si bien estos modelos imitan muchas de las características de la ECN humana, existen diferencias inherentes entre la fisiopatología de la ECN en animales y humanos. Por ejemplo, el modelo murino de ECN se induce en ratones nacidos a término, y aunque su desarrollo intestinal es incompleto, la fisiopatología de ECN es inherentemente diferente en este contexto clínico. La expresión génica intestinal murina al nacer es similar a la de un feto humano previable y no se aproxima a la de un neonato prematuro de 22-24 semanas de gestación hasta el día 14 (P14)¹³. Esto confunde el modelo murino de ECN porque generalmente no se puede inducir lesión intestinal en ratones después de P10. Además, las cepas endogámicas de ratones carecen de la diversidad inmunológica¹⁴ y microbiológica de los neonatos humanos¹⁵, lo que sirve como otro factor de confusión. Por lo tanto, una mayor incorporación de muestras humanas primarias en la investigación de ECN mejora la relevancia clínica de los estudios en este campo.

Los estudios sobre los mecanismos de la ECN in vitro han utilizado tradicionalmente líneas celulares monotípicas derivadas de células adultas de cáncer intestinal, como el adenocarcinoma colorrectal (Caco2) y las células del adenocarcinoma de colon humano (HT-29)¹⁶. Estos modelos son convenientes, pero tienen una relevancia fisiológica limitada debido a su crecimiento a partir de células cancerosas adultas, su arquitectura no polarizada y los cambios fenotípicos relacionados con los pasajes repetidos en el cultivo. Los enteroides intestinales mejoran estos modelos, ya que pueden crecer a partir de las criptas del tejido intestinal, diferenciarse en todos los subtipos epiteliales intestinales y formar una estructura tridimensional (3D) similar a una vellosidad^17,18,19,20. Recientemente, los enteroides intestinales se han combinado con la tecnología microfluídica para desarrollar un modelo de intestino delgado en un chip y proporcionar un sistema modelo in vitro fisiológicamente más relevante²¹.

Los primeros dispositivos microfluídicos de órgano en un chip se introdujeron a principios de la década de 2000^22,23,24. El primer modelo de órgano en un chip fue el pulmón en un chip de respiración humana²⁵. A esto le siguieron numerosos modelos de un solo órgano, como el intestino²¹, el hígado²⁶, los riñones 27, la médula ósea 28, la barrera hematoencefálica²⁹ y el corazón³⁰. Estos modelos de órganos en un chip se han utilizado para estudiar enfermedades agudas, crónicas y raras, incluido el síndrome de radiación aguda,31 la enfermedad pulmonar obstructiva ^crónica,32 y las enfermedades neurodegenerativas,33. La naturaleza polarizada de las células en estos chips y la presencia de dos compartimentos celulares separados por una membrana porosa permite modelar procesos fisiológicos complejos como la perfusión, los gradientes de concentración química y la quimiotaxis de las células inmunitarias^34,35. Estos sistemas microfluídicos proporcionan así una nueva herramienta para estudiar la fisiopatología y los mecanismos de las enfermedades humanas.

El modelo de intestino delgado en un chip fue descrito por Kasendra et al. en 2018, quienes utilizaron muestras de biopsia de intestino delgado pediátricas (de 10 a 14 años) diferenciadas en enteroides y cultivadas en un dispositivo microfluídico²¹. Las células endoteliales vasculares, el flujo continuo de medios y el estiramiento/relajación también se incorporaron a este modelo. Observaron la diferenciación de los subtipos epiteliales intestinales, la formación de ejes en forma de vellosidades en 3D, la producción de moco y los patrones de expresión génica del intestino delgado²¹. Este modelo microfluídico se aplicó a la enfermedad neonatal con el desarrollo del sistema NEC-on-a-chip, que incorpora enteroides intestinales neonatales, células endoteliales y el microbioma de un neonato con NEC³⁶. La ECN en un chip recapitula muchas de las características críticas de la ECN humana, incluida la expresión génica inflamatoria, la pérdida de células epiteliales especializadas y la reducción de la función de barrera intestinal³⁶. Por lo tanto, este modelo tiene numerosas aplicaciones en el estudio de la ECN, incluidos los estudios mecanicistas y el descubrimiento de fármacos. En este manuscrito, se proporciona un protocolo detallado para el rendimiento del modelo NEC en un chip.

Protocol

Los enteroides se derivaron de muestras del intestino delgado de lactantes prematuros (nacidos entre las semanas 22 y 36 de gestación) obtenidas en el momento de la cirugía por ECN u otras afecciones intestinales con etiologías no inflamatorias. Toda la recolección y el procesamiento de muestras se realizaron después del consentimiento informado y la aprobación de las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Washington en St. Louis (números de protocolo 201706182 y 201804040) y de la Universidad de C…

Representative Results

Los enteroides se sembraron en el dispositivo microfluídico (Figura 1) y se cultivaron como se describió anteriormente. El crecimiento de los enteroides en el hidrogel de la matriz de cultivo celular antes de la siembra y luego la posterior expansión de la monocapa de células epiteliales intestinales después de la siembra del dispositivo se monitoreó mediante microscopía de campo claro (Figura 2). Se formó una monocapa de células epiteliales intestinale…

Discussion

Este sistema de ECN en un chip es una nueva y poderosa herramienta que se puede utilizar para modelar la fisiopatología de la ECN. Esta plataforma proporciona un microambiente complejo que se asemeja más al medio intestinal in vivo que los modelos anteriores al incorporar un sistema de cocultivo con flujo y estiramiento luminal continuo. Estas condiciones promueven el desarrollo de una arquitectura 3D similar a una vellosidad revestida por un epitelio altamente polarizado que consiste en subtipos epiteliales m…

Materials

[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	Agilent	7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro	BrandTech	759085D
Cell Recovery Solution	Corning	354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	12011319
Chip Cradle	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well	Corning	3548
Collagen from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II automated cell counter	Invitrogen	AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7132	Permeability dye
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 surface activation reagent	Emulate	ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent	Emulate	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicin	Gibco	15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Invitrogen	H3570
Human Collagen Type I	Sigma-Aldrich	CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Biologics	H-6054
Inverted Microscope	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	American Type Culture Collection	CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-274200
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 Hub Module	Emulate	N/A
Paraformaldehyde	ThermoFisher	047392.9L
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Portable Module	Emulate	N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
Sterile Syringes, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors	Miltex Instruments	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Culture Module	Emulate	N/A