Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

Bu protokol, hastalık patogenezine yönelik mekanik çalışmalar için kullanılabilen bir in vitro nekrotizan enterokolit (NEC) modelini açıklar. İnsan yenidoğan bağırsağından, endotel hücrelerinden ve şiddetli NEC'li bir yenidoğanın bağırsak mikrobiyomundan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış bir mikroakışkan çipe sahiptir.

Abstract

Nekrotizan enterokolit (NEK), tam olarak anlaşılamamış, karmaşık patogenezi nedeniyle araştırılması zor olan ciddi ve potansiyel olarak ölümcül bir bağırsak hastalığıdır. NEC'in patofizyolojisi, bağırsak sıkı bağlantılarının bozulmasını, artmış bağırsak bariyeri geçirgenliğini, epitel hücre ölümünü, mikrobiyal disbiyozisis ve düzensiz inflamasyonu içerir. NEC'yi incelemek için kullanılan geleneksel araçlar arasında hayvan modelleri, hücre dizileri ve insan veya fare bağırsak organoidleri bulunur. Bu model sistemlerini kullanan çalışmalar, alanın hastalık patofizyolojisi anlayışını geliştirmiş olsa da, insan NEC'nin karmaşıklığını özetleme yetenekleri sınırlıdır. NEC-on-a-chip adı verilen mikroakışkan teknolojisini kullanan geliştirilmiş bir in vitro NEC modeli geliştirilmiştir. Çip üzerinde NEC modeli, preterm bir yenidoğandan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış, insan endotel hücreleri ve şiddetli NEC'li bir bebekten alınan mikrobiyom ile birlikte kültürlenmiş bir mikroakışkan cihazdan oluşur. Bu model, NEC'nin patofizyolojisine yönelik mekanik çalışmalar için değerli bir araçtır ve yenidoğan bağırsak hastalıkları için ilaç keşif testi için yeni bir kaynaktır. Bu yazıda, NEC-on-a-chip modelinin ayrıntılı bir açıklaması sağlanacaktır.

Introduction

Nekrotizan enterokolit (NEC), 1500 g'< doğanlarda %10'a varan insidansla erken doğmuş bebekleri etkiler1. NEC'in patofizyolojisi karmaşıktır ve bağırsak epitelinde hasar, bağırsak sıkı bağlantılarının bozulması, artmış bağırsak bariyeri geçirgenliği, immün düzensizlik ve epitel hücre ölümünü içerir 2,3. NEC'in patogenezinde rol oynayan mekanizmalar hakkındaki anlayışımız eksik kalmıştır ve onlarca yıllık araştırmalara rağmen hala etkili bir hedefe yönelik tedavi yoktur.

NEC araştırmalarını ilerletmenin önündeki önemli bir engel, insan bebeklerinden izole edilen birincil bağırsak dokusunun sınırlı mevcudiyeti ve küçük boyutudur. NEC'li bebeklerden rezeke edilen bağırsak dokusu genellikle nekrotiktir ve ciddi şekilde hasar görür, bu da hastalık başlangıcından önce gelen mekanizmalara yönelik çalışmaları zorlaştırır. Örneğin, NEC'li bebeklerin ince bağırsağı bağışıklık hücreleri ile doludur ve bağırsak kök hücre sayısında azalma, epitel hücre proliferasyonunda azalma ve epitel hücresi apoptozunda artış da gözlenir 4,5,6,7. Bu, bu örneklerden bağırsak epitel hücrelerinin kültürlenmesinde ve bu düşmanca enflamatuar ortamda parçalanabilen RNA ve proteinlerin izole edilmesinde zorluklara yol açar. Ek olarak, cerrahi NEC'li bebeklerde hastalık süreci zaten ilerlemiş olduğundan, hastalığı indükleyen faktörlere yönelik mekanik çalışmalar mümkün değildir. Bu sınırlamalar, NEC'nin mekanik çalışmaları için hayvan modellerine güvenilmesine yol açmıştır.

Fareler, sıçanlar, domuz yavruları, tavşanlar ve babunlar için NEC'nin hayvan modelleri oluşturulmuştur 5,8,9,11. Hayvan modellerinin güçlü bir gücü, NEC benzeri bağırsak hastalığının, disbiyotik bir mikrobiyom, tekrarlanan hipoksi atakları ve anne sütü beslemelerinin olmamasıdahil olmak üzere insanlarda NEC başlangıcı ile ilişkili faktörler tarafından indüklenmesidir 5,8,10,11. Ek olarak, deneysel NEC sırasında gözlenen inflamatuar yanıt ve patolojik değişiklikler paralel insan hastalığı 5,9,12. Bu modeller insan NEC'nin birçok özelliğini taklit ederken, hayvanlarda ve insanlarda NEC'nin patofizyolojisi arasında doğal farklılıklar vardır. Örneğin, NEC'in murin modeli, tam süreli doğan farelerde indüklenir ve bağırsak gelişimleri tamamlanmamış olsa da, NEC'in patofizyolojisi bu klinik bağlamda doğal olarak farklıdır. Doğumda murin bağırsak gen ekspresyonu, yaşayabilir bir insan fetüsüne benzer ve 14. güne kadar 22-24 haftalık bir preterm yenidoğanınkine yaklaşmaz (P14)13. Bu, murin NEC modelini karıştırır, çünkü bağırsak yaralanması genellikle P10'dan sonra farelerde indüklenemez. Ek olarak, kendi içinde yetiştirilmiş fare suşları, insan yenidoğanların15 immünolojik14 ve mikrobiyolojik çeşitliliğinden yoksundur, bu da başka bir kafa karıştırıcı faktör olarak hizmet eder. Bu nedenle, birincil insan örneklerinin NEC araştırmalarına daha fazla dahil edilmesi, bu alandaki çalışmaların klinik uygunluğunu artırmaktadır.

NEC mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar in vitro geleneksel olarak kolorektal adenokarsinom (Caco2) ve insan kolon adenokarsinomu (HT-29) hücreleri gibi yetişkin bağırsak kanseri hücrelerinden türetilen monotipik hücre dizilerini kullanmıştır16. Bu modeller, yetişkin kanser hücrelerinden büyümeleri, polarize olmayan mimarileri ve kültürde tekrarlanan geçişlerle ilgili fenotipik değişiklikler nedeniyle uygundur ancak fizyolojik önemi sınırlıdır. Bağırsak enteroidleri, bağırsak dokusunun kriptlerinden büyütülebildikleri, tüm bağırsak epitel alt tiplerine farklılaşabildikleri ve üç boyutlu (3D) villus benzeri bir yapıoluşturdukları için bu modelleri geliştirir 17,18,19,20. Son zamanlarda, bağırsak enteroidleri, çip üzerinde ince bir bağırsak modeli geliştirmek ve fizyolojik olarak daha ilgili bir in vitro model sistemi sağlamak için mikroakışkan teknolojisi ile birleştirilmiştir21.

İlk çip üzerinde organ mikroakışkan cihazları 2000'li yılların başında tanıtıldı22,23,24. İlk çip üzerinde organ modeli, çip üzerinde insan solunumu yapan akciğer25'ti. Bunu bağırsak 21, karaciğer26, böbrekler27, kemik iliği 28, kan-beyin bariyeri29 ve kalp30 gibi çok sayıda tek organ modeli izledi. Bu çip üzerinde organ modelleri, akut radyasyon sendromu,31 kronik obstrüktif akciğer hastalığı,32 ve nörodejeneratif hastalıklar 33 dahil olmak üzere akut, kronik ve nadir hastalıkları incelemek için kullanılmıştır. Bu çipler üzerindeki hücrelerin polarize doğası ve gözenekli bir zarla ayrılmış iki hücresel bölmenin varlığı, perfüzyon, kimyasal konsantrasyon gradyanları ve bağışıklık hücresi kemotaksisi gibi karmaşık fizyolojik süreçlerin modellenmesine izin verir34,35. Bu mikroakışkan sistemler, insan hastalıklarının patofizyolojisini ve mekanizmalarını incelemek için yeni bir araç sağlar.

Çip üzerinde ince bağırsak modeli, Kasendra ve ark. 2018 yılında, enteroidlere farklılaşmış ve mikroakışkanbir cihazda kültürlenmiş pediatrik (10-14 yaş) ince bağırsak biyopsi örneklerini kullanan. Vasküler endotel hücreleri, sürekli ortam akışı ve gerilme/gevşeme de bu modele dahil edildi. Bağırsak epitelyal alt tip farklılaşması, 3D villus benzeri eksenlerin oluşumu, mukus üretimi ve ince bağırsak gen ekspresyon paternlerini gözlemlediler21. Bu mikroakışkan model, yenidoğan bağırsak enteroidlerini, endotel hücrelerini ve NEC36'lı bir yenidoğandan mikrobiyomu içeren NEC-on-a-chip sisteminin geliştirilmesiyle yenidoğan hastalığına uygulandı. Çip üzerinde NEC, enflamatuar gen ekspresyonu, özel epitel hücrelerinin kaybı ve azalmış bağırsak bariyeri fonksiyonu36 dahil olmak üzere insan NEC'nin kritik özelliklerinin çoğunu özetler. Bu nedenle, bu model, mekanik çalışmalar ve ilaç keşfi de dahil olmak üzere NEC çalışmasında çok sayıda uygulamaya sahiptir. Bu makalede, NEC-on-a-chip modelinin performansı için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Enteroidler, NEC veya enflamatuar olmayan etiyolojileri olan diğer bağırsak koşulları için ameliyat sırasında elde edilen prematüre bebeklerden (22 ila 36 gebelik haftasında doğan) ince bağırsak örneklerinden türetilmiştir. Tüm numune toplama ve işleme, St. Louis'deki Washington Üniversitesi'ndeki (IRB Protokol numaraları 201706182 ve 201804040) ve Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki (IRB protokol numarası 21-3134) Kurumsal İnceleme Kurullarından bilgilendirilmiş onam ve onaydan sonra gerçekleştirildi.

1. Enteroidler oluşturmak için insan yenidoğan ince bağırsağından kriptlerin izolasyonu ve kaplanması

  1. Medya hazırlığı
    1. Gerekli tüm ortamları Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Tüm ortamların hazırlanmasında aseptik tekniğin kullanıldığından emin olun. Filtre, ortamı 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin ve kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
  2. Bağırsak dokusunun yıkanması ve kıyılması
    1. Hücre kültürü matris hidrojelini çözmek için buzun üzerine yerleştirin. Ameliyathaneden insan bağırsak dokusunu alın. Endojen proteazları etkisiz hale getirmek için numuneyi hemen 5 mL buz gibi soğuk doku yıkama ortamına yerleştirin.
    2. Kesilmiş bir P1000 pipet ucuna sahip 10 mL'lik bir şırınga kullanarak bağırsak içeriğini buz gibi Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (D-PBS) ile yıkayın. Bağırsak dokusunu 5 mL buz gibi D-PBS içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın.
    3. Lümeni ortaya çıkarmak için bağırsak dokusunu uzunlamasına kesin ve ince makas kullanarak küçük parçalar halinde kesin. Doku kültürü kabında D-PBS'de hafifçe çalkalayarak bağırsak dokusunu durulayın.
    4. Doku parçalarını 35 mm'lik temiz bir tabağa aktarın. İnce makasla dokuyu kıyın. En uygun boyut, parça başına 0,5cm2'dir . Bağırsak dokusu kesilmiş 1 mL'lik bir pipet ucundan geçmelidir.
  3. Bağırsak dokusunun ayrışması
    1. Dokuya 1 mL önceden ısıtılmış kollajenaz I ekleyin. Dokuyu kollajenaz ile 10-15 kez pipetleyerek karıştırın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
    2. Boruyu 50 rpm'ye ayarlanmış bir çalkalayıcıya yatay olarak sabitleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika çalkalayın.
    3. İnkübasyondan sonra, tüpleri çalkalayıcıdan çıkarın ve 10-15 kez pipetleyerek çözeltiyi tekrar süspanse edin. İsteğe bağlı: Faz kontrast mikroskobu kullanarak tek kriptlerin varlığını doğrulamak için küçük bir alikotu çıkarın.
  4. Bağırsak kriptlerinin izolasyonu
    1. Kriptleri 70 μm'lik bir süzgeçten geçirerek buz üzerinde 50 mL'lik konik bir tüpe filtreleyin. Süzgeci 9 mL buz gibi soğuk mendil yıkama ortamıyla yıkayın. Süzüntüyü 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
    2. 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı yavaşça çıkarın. Tüpte yaklaşık 200 μL ortam kalacaktır. Pelet, buz gibi soğuk mendil yıkama ortamının 5 mL'sinde yeniden süspanse edilir.
    3. 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Peleti 1 mL doku yıkama ortamında yeniden süspanse edin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    4. Kriptoları peletlemek için 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı mümkün olduğunca dikkatlice ve tamamen aspire edin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
  5. Bağırsak kriptlerinin kaplanması
    1. Tüp buz üzerinde kalırken homojen bir kript süspansiyonu yapmak için önceden soğutulmuş bir pipet ucu kullanarak peleti hücre kültürü matris hidrojelinde (20 μL/48 oyuklu bir doku kültürü plakasının oyuğu) yeniden süspanse edin. Pipetleme sırasında kabarcık oluşturmaktan kaçının. Tüpü kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
      NOT: Hücre kültürü matris hidrojeli, 8 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda polimerize olacaktır. 0.5 cm-1 cm uzunluğundaki bir bağırsak dokusu parçasından izole edilen kriptler genellikle 48 oyuklu bir doku kültürü plakasının 10 oyuğuna kaplanır.
    2. Kript/hücre kültürü matrisi hidrojel süspansiyonunu önceden ısıtılmış 48 oyuklu bir doku kültürü plakasında kaplayın. Matrisin katılaşmasına yardımcı olmak için plakayı ısıtın. Süspansiyonu kuyunun ortasına yerleştirin. Kaplama sırasında kabarcıklardan kaçının.
    3. Matrisi polimerize etmek için plakaları 37 °C'de 20 dakika inkübe edin. Hücre kültürü matris hidrojelinin ortam eklemeden önce tamamen polimerize olması esastır.
    4. Matris polimerize olduktan sonra, her bir oyuğa 300 μL önceden ısıtılmış %50 L-WRN şartlandırılmış ortam ekleyin. 37 °C'de inkübe edin,% 5 CO2.
    5. Medyayı her 2 ila 3 günde bir değiştirin. Sıcak% 50 L-WRN şartlandırılmış ortamla değiştirin. Her 7 ila 10 günde bir geçiş. Geçiş enteroidleri% 50 -% 90 birleştiğinde ve tomurcuk oluşumu sergilediklerinde.
      NOT: Ortam sararırsa daha sık değiştirilmesi gerekebilir. Geçiş sıklığı, enteroid yoğunluğuna ve belirli bir hastanın hücrelerinin büyüme hızına bağlı olacaktır. Merkezleri görünüşte koyulaşırsa enteroidlerin geçirilmesi gerekecektir.
  6. Enteroidlerin geçirilmesi
    1. Medyayı kuyulardan nazikçe aspire edin. Kuyuları 500 μL ılık D-PBS ile dikkatlice yıkayın. Matrisi bozmamaya dikkat edin.
    2. Her kuyucuğa 250 μL soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Hücre kültürü matrisi hidrojelini bozmak için her bir kuyucuğun altını yeni bir pipet ucuyla çizin. Plakayı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
    3. Enteroidleri kuvvetli pipetleme ile ayırın (P200 pipet ile ~ 25-50 kez) ve 500 μL doku yıkama ortamı ekleyin.
    4. Enteroid süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve ilave 5 mL soğuk doku yıkama ortamı ekleyin. Homojen bir çözelti oluşturmak için hafifçe pipetleyin.
    5. Enteroidleri peletlemek için 400 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve süpernatanı mümkün olduğunca tamamen aspire edin. Tüpte yaklaşık 30-60 μL kalacaktır.
      NOT: Enteroidlerin pipetleme ile parçalanmasında zorluklar varsa, bu işlemi kolaylaştırmak için% 0.25 tripsin-EDTA veya enzimatik ayrışma reaktifi kullanılabilir.
    6. Kalan yıkama ortamı hacmindeki enteroidleri bir P200 pipeti ile yeniden süspanse edin. Pipetleme sırasında kabarcık oluşumundan kaçının.
    7. Enteroid süspansiyona 48 oyuklu bir plakanın yeni oyuğu başına 20 μL hücre kültürü matris hidrojeli ekleyin. Yoğunluklarına bağlı olarak enteroidleri 1: 3, 1: 4 veya 1: 5'e bölün.
    8. Süspansiyonu önceden ısıtılmış 48 oyuklu bir plakaya ekleyin. Matrisi katılaştırmak için plakayı 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    9. Polimerizasyondan sonra, her bir oyuğa 300 μL önceden ısıtılmış %50 L-WRN şartlandırılmış ortam ekleyin. 37 °C'de inkübe edin,% 5 CO2.

2. Yenidoğan çip üzerinde bağırsak modeli

NOT: Mikroakışkan çiplerin kullanılması ve bu ekipmanın kullanılmasıyla ilgili ayrıntılı talimatlar için lütfen üreticinin duodenum bağırsak çip kültürü protokolü37'ye bakın.

  1. Medya hazırlığı
    1. Gerekli tüm ortamları Tablo 2'de açıklandığı gibi hazırlayın. Aseptik tekniğin kullanıldığından emin olun. Filtre, ortamı 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin ve kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
  2. Gün (-3): İnsan bağırsak mikrovasküler endotel hücrelerinin (HIMEC'ler) çözülmesi ve genişletilmesi
    1. Üreticinin tavsiyelerine göre bir HIMEC şişesini ve plakayı çözdürün.
    2. 25cm2'lik bir şişeyi 2 dakika boyunca jelatin bazlı kaplama solüsyonu ile kaplayın. Fazla çözeltiyi çıkarın. Şişeye 6 mL HIMEC ortamında yeniden süspanse edilmiş HIMEC'leri (yaklaşık 0,5-1 x 106 hücre) ekleyin. 37 °C'de inkübe edin,% 5 CO2.
    3. HIMEC ortamını her 48 saatte bir değiştirin. %100 birleştikten sonraki 48-72 saat içinde çipin endotelyal (alt) kanalına HIMEC'ler ekleyin.
  3. Gün (-1): Enteroidlerin eklenmesinden önce çiplerin aktive edilmesi ve kaplanması
    1. CR-1 çözeltisi yapmak için çip aktivasyon reaktifi 1 (CR-1) tozunu sulandırın. Bu adım için CR-1 tozu ve çip aktivasyon reaktifi 2 (CR-2) çözeltisinin oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
      NOT: Aşağıdaki adımlarda hazırlanan CR-1 tozunu ve CR-1 solüsyonunu her zaman ışıktan koruyun. Bu adımlar için davlumbazdaki ışık kapalı olmalıdır.
      1. Çipi ve talaş taşıyıcıyı çip yuvasına yerleştirin, ardından bunları hücre kültürü kapağındaki bir doku kültürü kabına yerleştirin. Taşıyıcıya çip yerleştirmek için uygun teknik için üreticinin protokolüne bakın37.
      2. CR-1 tozu şişesine 1 mL CR-2 çözeltisi ekleyin ve daha sonra çözeltiyi doğrudan CR-1 toz şişesinden ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılmış 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Çözeltiyi pipetle karıştırmayın. Amaç kabarcık oluşumunu önlemektir.
      3. CR-1 şişesine 1 mL daha CR-2 çözeltisi ekleyin ve 15 mL'lik tüpe aktarın. CR-1 şişesinden toplam 4 durulama ve toplam 4 mL CR-2 durulayın. Kapağı şişeye ekleyin ve kalan tozu çıkarmak için son durulama için ters çevirin.
      4. 10 mL (0.5 mg / mL) nihai hacim için CR-1 içeren 15 mL tüpe 6 mL CR-2 ekleyin. Bu çözeltiyi kabarcıklar oluşturmadan bir pipetle karıştırın. Bir sonraki adıma geçmeden önce CR-1'in tamamen çözüldüğünden emin olun.
    2. Çipe CR-1 çözümünün eklenmesi
      NOT: Bu çözümleri eklerken kanallara kabarcık girmekten kaçınmak çok önemlidir. CR-1 çözeltisi bu adım için ışıktan korunmalıdır.
      1. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, çözelti alt kanal çıkışından çıkmaya başlayana kadar alt kanal girişine 20 μL CR-1 çözeltisi ekleyin. Çözelti üst kanal çıkışından çıkmaya başlayana kadar üst kanal girişinden 50 μL CR-1 çözeltisi ekleyin. Fazla CR-1 çözeltisini çipin yüzeyinden hafifçe aspire ederek çıkarın.
        NOT: Çözümler her zaman üst kanaldan önce alt kanala eklenmelidir. Kabarcıklar fark edilirse, her iki kanalı da CR-1 solüsyonu ile yıkayın ve 2.3.2.1'i tekrarlayın.
      2. Cipsleri içeren doku kültürü kabının kapağı yerindeyse, bu adım için çıkarın. Cipsleri 15 dakika boyunca UV ışığı altında yerleştirin. CR-1'i üst ve alt kanallardan çıkarın.
      3. Toplam iki UV aktivasyon adımı için 2.3.2.1'den 2.3.2.2'ye kadar olan adımları tekrarlayın. Bu adımdan sonra çipler artık ışığa duyarlı değildir.
      4. CR-1'i üst ve alt kanallardan çıkarın. Her iki kanalı da 100 μL CR-2 solüsyonu ile yıkayın. CR-2 çözeltisini üst ve alt kanallardan çıkarın.
      5. Her iki kanalı da 100 μL steril D-PBS ile yıkayın. Yıkamaları 2 kez tekrarlayın. Her iki kanala da 100 μL D-PBS ekleyin. Talaşların yüzeyindeki fazlalığı alın, ancak kanalları dolu bırakın.
    3. Kanalları hücre dışı matris ile kaplayın.
      1. Bu adımdan hemen önce fibronektin, kollajen IV ve hücre kültürü matris hidrojelini buz üzerinde çözdürün ve bu çözeltileri bu bölümün geri kalanında buz üzerinde tutun.
      2. Çipin üst ve alt kanalları için aşağıdaki hücre dışı matris (ECM) çözümlerini hazırlayın:
        Üst Kanal: Çip başına D-PBS'de 100 μL 200 μg/mL tip IV kollajen ve 100 μg/mL hücre kültürü matris hidrojeli.
        Alt Kanal: Çip başına 100 μL 200 μg/mL tip IV kollajen ve D-PBS'de 30 μg/mL fibronektin.
      3. D-PBS'yi üst ve alt kanallardan tamamen çıkarın. Çıkışta bir damla görünene kadar alt kanal girişine 50 μL ECM ekleyin. Üst kanal için tekrarlayın. Her kanal için uygun ECM çözümlerini kullandığınızdan emin olun ve çözümü önce alt kanala ekleyin.
      4. D-PBS'yi çip yuvası haznesine ekleyin ve doku kültürü plakasının kapağını değiştirin. Cipsleri gece boyunca nemlendirilmiş 37 °C, %5CO2 inkübatöre koyun.
  4. Gün (0): HIMEC'ler ve enteroidler ile tohumlama cipsleri
    1. Ortamın vakum dengelemesi
      1. Deneyi tamamlamak için gerekli hacimde HIMEC ortamı ve talaş genişletme ortamı 50 mL'lik steril bir konik tüpe ekleyin. Ortamı en az 1 saat su banyosunda 37 °C'ye dengeleyin.
      2. Vakum filtrasyon cihazını, ısıtılmış ortam içeren 50 mL'lik tüplere bağlayın. Tüpler, 50 mL konik tüpün altındaki önceden ısıtılmış ortam ile yönlendirilmelidir. 10 s boyunca -70 kPa veya daha yüksek sıcaklıkta vakumlayın.
      3. Tüpleri, ortam filtreden geçecek şekilde çevirin. 5 dakika boyunca vakumlamaya devam edin. Vakumlu filtrasyon tamamlandıktan sonra, vakumlu filtrasyon cihazını çıkarın ve ortam içeren 50 mL'lik tüpleri 37 °C inkübatöre yerleştirin.
    2. Cipsleri yıkamak
      1. Endotel kanalını 100 μL önceden ısıtılmış HIMEC ortamı ile yıkayarak yıkayın.
        Epitel kanalını 100 μL önceden ısıtılmış talaş genişletme ortamı ile yıkayarak yıkayın. Talaşların yüzeyine yayılan tüm ortamları çıkarın.
      2. Yıkama adımını tekrarlayın. Bu yıkamalardan sonra medya, kanallarda ve giriş ve çıkış portlarında kalmalıdır. Cipsleri içeren kültür kabının kapağını değiştirin ve kullanıma hazır olana kadar inkübatöre geri dönün.
    3. HIMEC'leri hasat etme
      1. HIMEC'leri içeren 25cm2'lik şişeden aspire ortamı. Tek katmanı D-PBS ile nazikçe yıkayın. Şişeye 2 mL önceden ısıtılmış %0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve tek tabaka üzerinde hafifçe durulayın.
      2. Şişeyi 37 °C'de 2-5 dakika inkübe edin. Tripsini 10 mL HIMEC ortamı ile nötralize edin. Ortamdaki hücreleri yeniden süspanse edin ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
      3. 150 x g hücrelerde 4 °C'de 5 dakika döndürün. Hücreleri 200 μL HIMEC ortamında yeniden süspanse edin.
      4. 10 μL hücreyi çıkarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. İstenen HIMEC konsantrasyonu 6 x 10 6 ila 8 x 106 hücre/mL'dir.
    4. HIMEC'leri çip üzerine yerleştirme
      1. Çipi inkübatörden çıkarın ve kaputun içine getirin. Çipin yüzeyine sızmış olabilecek tüm ortamları aspire edin.
      2. Çipin epitel (üst) kanalını 100 μL önceden ısıtılmış çip genişletme ortamı ile yıkayın. Çipin endotelyal (alt) kanalını 100 μL önceden ısıtılmış HIMEC ortamı ile yıkayın.
      3. Homojen bir dağılım elde etmek için HIMEC'leri yavaşça yeniden askıya alın. Ortamı endotelyal (alt) kanaldan tamamen çıkarın. Endotelyal (alt) kanala 10 μL HIMEC (~ 36.000 hücre / çip) ekleyin.
        NOT: 10 μL HIMEC kullanırken HIMEC kanalını kabarcık oluşmadan doldurmak zorsa, eklenen hücrelerin hacmini artırın. Çip başına aynı sayıda hücre olmalıdır.
      4. Dolu değilse epitelyal (üst) kanala ek organoid büyüme ortamı ekleyin. HIMEC'lerin tohumlama yoğunluğunu kontrol edin. Düzgün dağılmamışlarsa ve talaş yüzeyinin% 80 -% 90'ını kaplamıyorlarsa, kanalı yıkayın ve tohumlamayı tekrarlayın.
      5. Çipi, hücre kültürü kabındaki çip yuvasına ters çevirin. D-PBS'yi talaş yuvasındaki hazneye ekleyin. Kapağı hücre kültürü kabına yerleştirin ve inkübatöre yerleştirin.
      6. HIMEC'lerin çip membranına yapışmasını sağlamak için çipi 37 °C'de 2-3 saat ters çevirin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra çip/talaş kızağını dik konuma getirin.
      7. Endotelyal (alt) kanalı 100 μL ılık HIMEC ortamı ile nazikçe yıkayın. Medyayı kanalda bırakın. Epitelyal (üst) kanalı 100 μL organoid büyüme ortamı ile nazikçe yıkayın. Medyayı kanalda bırakın.
      8. Sonraki adımları tamamlarken çipleri 37 °C inkübatöre geri koyun.
    5. Enteroidlerin toplanması ve çip üzerinde tohumlama
      NOT: Cipsler, 10-14 gün önce bölünmüş, %50-75 birleşik ve 7. ve 20. pasajlarda enteroidlerle tohumlanır. 0. Günde enteroidlerin görünümü için lütfen Şekil 2'ye bakınız. Enteroidlerin tohumlamaya hazır olması için gereken süre, belirli bir hastanın hücrelerinin büyüme hızına bağlı olacaktır.
      1. Medyayı kuyulardan nazikçe aspire edin. Hücre kültürü matris hidrojeli içeren kuyucukları 500 μL ılık D-PBS ile dikkatlice yıkayın. Hücre kültürü matris hidrojelini rahatsız etmemeye dikkat edin.
      2. Her kuyucuğa 250 μL soğuk hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Hücre kültürü matris hidrojelini bozmak için her bir kuyucuğun altını yeni bir pipet ucuyla çizin. Kuyucukların içeriğini buz üzerinde 15 mL'lik soğuk bir tüpe ekleyin.
      3. Tüpü buz üzerinde 45 dakika inkübe edin ve tüpü her 3-5 dakikada bir ters çevirin. Bu adım sırasında, enteroid ayrışma ortamını hazırlayın. İnkübasyon adımında 10 dakika kaldığında bu ortamı 37 °C su banyosuna yerleştirin.
      4. Enteroidleri peletlemek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
      5. Peletlere hasat edilen plaka başına 2 mL enteroid ayrışma ortamı ekleyin ve 60 s ila 120 s boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun. İnkübasyon sırasında tüpü hafifçe döndürün. Parçalanmış enteroidler elde etmek için yeterince uzun süre inkübe edin, ancak tek bir hücre süspansiyonuna ayrışmadan.
      6. İnkübasyondan sonra, her 15 mL'lik tüpe 10 mL soğuk doku yıkama ortamı ekleyin. Enteroidleri peletlemek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin.
      7. Peletin 200 μL talaş genişletme ortamında yeniden süspanse edilmesi. Enteroidleri kuvvetli pipetleme ile ayırın (P200 pipet ile ~ 25-50 kez).
      8. Hücreleri steril bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Homojen bir çözelti oluşturmak için hafifçe pipetleyin. Amaç, çipi 10-30 hücreden oluşan küçük kümeler halinde parçalanmış enteroidlerle tohumlamaktır.
      9. Saymak için 10 μL hücre süspansiyonunu çıkarın. Kalan hücre süspansiyonunu buzun üzerine yerleştirin. 6 x 106 hücre/mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için çip genişletme ortamının hacmini ayarlayın.
        NOT: Gerekli yoğunluğu elde etmek için enteroidleri santrifüjlemek ve daha küçük bir ortam hacminde yeniden süspanse etmek gerekebilir.
      10. Mikroakışkan çipleri kaputun içine getirin ve medyayı çipin epitel (üst) kanalından aspire edin. Çipin üst kanalına 30 μL yeniden askıya alınmış hücre (~180.000 hücre/çip) yükleyin. Tek tabaka oluşumu için çipin epitel kanalının tam ve düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlayın. Bu sağlanamazsa, enteroidleri çip boyunca durulayın ve yeniden tohumlayın.
        NOT: Birden fazla çip yüklerken düzgün bir süspansiyon elde etmede zorluklar varsa, enteroidler ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 40 μL'lik alikotlara ayrılabilir. Bu, yükleme ilerledikçe enteroid sayılarındaki ve parça boyutundaki değişkenliği en aza indirecektir.
      11. Çipleri hücre kültürü kabındaki çip yuvasına geri koyun (çıkarılmışlarsa). D-PBS'yi talaş yuvasındaki hazneye ekleyin. Kapağı hücre kültürü kabına yerleştirin ve cipsleri gece boyunca 37 °C, %5CO2'ye yerleştirin.
  5. Gün (1): Bölmelerin hazırlanması ve talaşlara akışın tanıtılması
    1. Cipsleri doku kültürü başlığına getirin. Epitel kanalını 100 μL çip genişletme ortamı ile iki kez nazikçe yıkayın. Endotel kanalını 100 μL HIMEC ortamı ile iki kez nazikçe yıkayın. Fazla medyayı talaş yüzeyinden çıkarın.
    2. Bölmeleri hazırlayın ve üreticinin protokolüne göre düzenleyin37. Giriş rezervuarlarına 2 mL uygun ortam ekleyin. Çıkış rezervuarlarına 300 μL uygun ortam ekleyin. Akış hızı 30 μL/h olacaktır. Esneme henüz başlatılmayacak.
  6. Gün (2): Tek katmanlı gelişimin ve değişen medyanın izlenmesi
    1. Kültür modülünü duraklatın ve bölmeleri kaputun içine getirin.
    2. Cipslerde ve bölmelerde kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak epitelyal tek tabakayı inceleyin. İlerlemeyi izlemek için çip üzerinde tutarlı konumlarda görüntüler yakalayın. Bölmelerde kalırken çipleri görüntüleyin.
    3. Medyayı üst kanal giriş rezervuarlarından çıkarın ve 2 mL talaş farklılaştırma medyası ile değiştirin. Alt kanal giriş haznesine 1 mL HIMEC ortamı ekleyin. Rezervuarın tabanının ince bir ortam tabakası ile kaplı kalmasını sağlamak için giriş rezervuarlarında yeterli ortam bırakın.
    4. Bölmeleri kültür modülüne geri koyun ve akışı 30 μL/s'de yeniden başlatın.
  7. Gün (3): Tek katmanlı geliştirmeyi izleme, esneme işlemini başlatma ve ortam ekleme
    1. 2.6.1.1 adımlarını tekrarlayın. ve 2.6.1.2. Üst kanal giriş haznesine 1 mL talaş farklılaştırma ortamı ekleyin ve alt kanal giriş haznesine 1 mL HIMEC ortamı ekleyin.
      NOT: %50-75 kapasiteye ulaşmaya başladıklarında her iki kanalın çıkış rezervuarlarından ortamı çıkarın.
    2. Bölmeleri kültür modülüne geri döndürün. Akışı 30 μL/s'de yeniden başlatın ve %2 gerinimde ve 0,2 Hz frekansta esnemeyi başlatın.
  8. Gün (4): Tek katmanlı gelişmeyi izleme, esnemeyi artırma ve ortam ekleme
    1. 2.6.1.1 adımlarını tekrarlayın. ve 2.6.1.2. Üst kanal giriş haznesine 1 mL talaş farklılaştırma ortamı ekleyin ve alt kanal giriş haznesine 1 mL HIMEC ortamı ekleyin.
      NOT: %50-75 kapasiteye ulaşmaya başladıklarında her iki kanalın çıkış rezervuarlarından ortamı çıkarın.
    2. Bölmeleri kültür modülüne geri döndürün. Akışı 30 μL/s'de yeniden başlatın ve esnemeyi %10 gerinim ve 0,2 Hz frekansa yükseltin.
  9. Gün (5) - Gün (7): Tek katmanlı geliştirmeyi izleme ve medya ekleme
    1. 2.6.1.1 adımlarını tekrarlayın. ve 2.6.1.2. Üst kanal giriş haznesine 1 mL talaş farklılaştırma ortamı ekleyin ve alt kanal giriş haznesine 1 mL HIMEC ortamı ekleyin.
    2. Bölmeleri kültür modülüne geri döndürün ve akışı yeniden başlatın ve gerdirin. Villus benzeri eksenler görselleştirildikten sonra, çip üzerinde NEC modeline geçin.

3. Çip üzerinde NEC modeli

  1. Bağırsak bakteri kültürü
    NOT: Bu adım, bu protokolü başlatmadan önce hazırlanmış, NEC'li bir hastadan önceden titre edilmiş donmuş bir enterik bakteri stoğu gerektirir. Bu deneyler için, şiddetli cerrahi NEC'li bir hastadan daha önce tarif edilmiş bir polimikrobiyal enterik bakteri bulamacı kullanıldı38.
    1. %50 gliserol enterik bakteri stoğu yapın ve daha fazla kullanılana kadar -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
    2. Bağırsak bakterilerinin bir kısmını çözün ve 10 μL'yi 3 mL Luria-Bertani (LB) ortamına aşılayın. Gece boyunca 150 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de inkübe edin.
    3. Aynı gün, kanalları 100 μL önceden ısıtılmış antibiyotiksiz çip farklılaştırma ortamı (üst kanal) veya 100 μL önceden ısıtılmış antibiyotiksiz HIMEC ortamı (alt kanal) ile nazikçe yıkayın. Ortamı tamamen aspire edin ve toplam 3 yıkama için yıkamayı tekrarlayın.
    4. Üçüncü yıkamayı aspire ettikten sonra, medyayı kanallara yerleştirin ve yerinde bırakın.
    5. Üst ve alt kanal giriş rezervuarlarını steril D-PBS ile durulayın ve ardından 3 mL uygun antibiyotiksiz ortamla doldurun. Bölmeleri hazırlayın ve 2.5.2'deki gibi düzenleyin.
    6. Çipi kültür modülüne geri koyun ve esnetme ve akışı yeniden başlatın.
    7. Ertesi sabah, gece boyunca 1 mL bakteri kültürü alın ve 25 mL taze LB ortamına aşılayın.
    8. OD600 , 1 cm'lik bir küvet kullanılarak ölçülen 0,6 ± 0,02'ye ulaşana kadar bu yeni kültürü 37 °C çalkalayıcıya geri koyun. Bakteri kültürünü, antibiyotik içermeyen talaş genişletme ortamında 7 x 108 koloni oluşturan birim / mL'ye seyreltin.
    9. Aşının konsantrasyonunu doğrulamak için bu kültürün bir alikotunu saklayın39. Epitelin tepkisine bağlı olarak bakteri konsantrasyonunu ayarlamak gerekebilir.
    10. Ortamı epitelyal (üst) kanaldan çıkarın. Antibiyotik içermeyen çip genişletme ortamında seyreltilmiş 30 μL bakteri kültürünü çipin üst kanalına ekleyin. HIMEC (endotelyal) kanalının bakterilerle çapraz kontaminasyonunu önlemek için çok dikkatli olun. Çipin yüzeyindeki fazla ortamları çıkarın.
    11. Yenidoğan epitelinin apikal tarafına bakteri yapışmasını kolaylaştırmak için çiplerin 30 dakika boyunca statik koşullar altında kalmasına izin verin. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış bakterileri uzaklaştırmak için üst kanalı 100 μL antibiyotik içermeyen genleşme ortamı ile yıkayın. Talaşları kültür modülüne geri koyun ve esneme ve akışı yeniden başlatın.
    12. Her 24 saatte bir, bölmeleri kültür modülünden çıkarın ve 100 μL antibiyotiksiz çip genişletme ortamını epitel kanalından yavaşça yıkayın. Bu, bakteri üremesini önlemeye yardımcı olacaktır.

4. Bağırsak geçirgenlik testi

NOT: Bu, protokol sırasında herhangi bir adımda gerçekleştirilebilir. Cipsler tohumlandığında başlatılırsa, bağırsak geçirgenlik testi, tek tabaka birleşmesini seri olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Bağırsak bakterilerinin eklenmesiyle başlatılırsa, bu test bağırsak bakterilerinin bağırsak epitelyal tek tabaka bütünlüğü üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılabilir.

  1. Epitelyal (üst) kanal için ortamı giriş haznesinden çıkarın. Giriş haznesine geçirgenlik boyası (50 μg/mL) içeren uygun ortam ekleyin. Çip üzerinde NEC modeli için antibiyotik içermeyen çip farklılaştırma ortamı kullanın.
  2. Atık suları her 24 saatte bir epitel ve endotel kanallarından toplayın. Lanik ve ark.36'ya göre bir mikroplaka okuyucu kullanarak geçirgenlik boyasının konsantrasyonunu ölçün.

5. İmmünohistokimya

  1. Çipin alt kanalını ve üst kanalını 200 μL D-PBS ile nazikçe yıkayın. D-PBS'yi kanallardan tamamen aspire edin.
  2. Her iki kanalı da %4 paraformaldehit ile yıkayarak hücreleri sabitleyin ve kanallarda çözelti bırakın. Talaş yüzeyindeki fazlalığı aspire edin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  3. Her iki kanalı da 200 μL D-PBS ile yıkayın. D-PBS'yi alt kanalda bırakın ve üst kanaldan tamamen çıkarın.
  4. Üst kanalı 100 μL% 0.1 deterjan çözeltisi ile yıkayarak epitel tabakasını geçirgen hale getirin ve çözeltiyi kanallarda bırakın. Talaş yüzeyindeki fazlalığı aspire edin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
  5. Her iki kanalı da 200 μL D-PBS ile yıkayın. D-PBS'yi alt kanalda bırakın ve üst kanaldan tamamen çıkarın.
  6. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca üst kanala% 10 eşek serumu (veya uygun bir bloke edici madde) ekleyin. Her iki kanalı da 200 μL D-PBS ile yıkayın. D-PBS'yi alt kanalda bırakın ve üst kanaldan tamamen çıkarın.
  7. Primer antikorları %5 eşek serumu ile seyreltin ve çipin üst kanalına ekleyin (daha önce test edilen antikorlar ve konsantrasyonlar Lanik ve ark.36'da mevcuttur). Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  8. Her iki kanalı da 3x 200 μL D-PBS ile yıkayın. D-PBS'yi alt kanalda bırakın ve üst kanaldan tamamen çıkarın.
  9. D-PBS'de% 5 eşek serumunda 1:200 oranında seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikorları ve Hoechst 33342 veya DAPI'yi (nükleer lekeler) seyreltin. Çipin üst kanalına ikincil antikorlar ekleyin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  10. Her iki kanalı da 3x 200 μL D-PBS ile yıkayın. Son yıkamadan sonra D-PBS ile dolu kanalları bırakın. Konfokal mikroskopi kullanarak görüntü elde etmek için çipi D-PBS'li bir görüntüleme kabına yerleştirin.
    NOT: Lekeli veya lekesiz sabit talaşlar, PBS'de 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir. Bu süre zarfında kanalların kurumadığından emin olun.

6. RNA'nın izolasyonu, cDNA'nın hazırlanması ve kantitatif gerçek zamanlı PCR

  1. Çipin alt kanalını ve üst kanalını 200 μL D-PBS ile nazikçe yıkayın. D-PBS'yi kanallardan tamamen aspire edin.
  2. Üreticinin talimatlarına göre bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanarak hücrelerden toplam RNA'yı çıkarın. RNA'yı sadece epitelden izole etmek için, sadece üst kanaldan infüze edin.
  3. Nano hacimli bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün. 1 μg toplam RNA'yı ters çevirin. Kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. Bu modelde daha önce kullanılan primerler Lanik ve ark. 36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enteroidler mikroakışkan cihaza ekildi (Şekil 1) ve yukarıda tarif edildiği gibi kültürlendi. Tohumlamadan önce hücre kültürü matris hidrojelindeki enteroidlerin büyümesi ve daha sonra cihazın tohumlanmasından sonra bağırsak epitel hücresi tek tabakasının genişlemesi, parlak alan mikroskobu ile izlendi (Şekil 2). Birleşen bir bağırsak epitel hücresi tek tabakası oluştu ve daha sonra olgun bir 3D villus benzeri yapıya dönüştü (Şekil 2). Enteroid kaynaklı yenidoğan bağırsak epiteli ve HIMEC'ler ile tohumlanan bu mikroakışkan cihaz, çip üzerinde yenidoğan bağırsak modeli36 olarak bilinir.

Çip üzerinde NEC modeli, yenidoğan NEC sırasında mevcut olan mikrobiyal disbiyozu özetlemek için geliştirilmiştir. Bu model, şiddetli NEC'li bir yenidoğandan çip üzerinde yenidoğan bağırsak modeline disbiyotik bir mikrobiyomun eklenmesini içerir. Bu disbiyotik mikrobiyomun eklenmesiyle, tümör nekroz faktörü alfa (TNFa; Şekil 3), interlökin (IL)-1 beta (IL-1β)36 ve IL-8 36 tespit edildi. Proinflamatuar sitokinlerdeki bu artış, insan NEC36 için gözlemlenenleri yansıtmaktadır.

Figure 1
Şekil 1: Enteroid kültürün ve mikroakışkan platformunun şematik gösterimi. Kriptler, cerrahi olarak rezeke edilen bir yenidoğan bağırsak parçasından izole edilir ve hücre kültürü matris hidrojelinde tohumlanır ve bağırsak enteroidlerine dönüştürülür. Enteroidler, hücre dışı matris (ECM) ile kaplanmış mikroakışkan cihazın üst kanalında ayrıştırılır ve tohumlanır. Endotel hücreleri (HIMEC'ler) daha sonra alt kanala eklenir. Biorender.com ile oluşturulan figür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Yenidoğan çip üzerinde bağırsak modeli kullanılarak büyütülen bağırsak epitel hücrelerinin ilerlemesi. Brightfield mikroskobu kullanılarak elde edilen görüntüler, 0. günde yenidoğan enteroidlerini, 3. günde çipte bir epitel hücresi tek tabakasını ve 7. günde görünür villus benzeri yapıları göstermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Çip üzerinde NEC, bağırsak epitel hücresi TNFα mRNA ekspresyonu. 24 saat veya 72 saat boyunca NEC'li bir bebekten (çip üzerinde NEC) tek başına medya (kontrol) veya disbiyotik mikrobiyom ile inkübasyon üzerine TNFα mRNA seviyelerinin karşılaştırılması. **** p < 0.0001 ve kontrol 24 saat; ** p < 0.005 ve Mann-Whitney U testi ile 72 saat kontrol. 24 saat kontrol için n=9; 24 saat çip üzerinde NEC için n=10; 72 saat kontrol için n=6; Çip üzerinde NEC için n=5 72 saat. Veriler SEM ± ortalamadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Kript izolasyonu ve enteroid büyümesi için ortam bileşimi. L-WRN şartlandırılmış ortamın hazırlanmasını açıklayan ayrıntılı yöntemler için Van Dussen ve ark.40 ve Miyoshi ve ark.41'e bakın. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2. NEC-on-a-chip modeli için ortam kompozisyonu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çip üzerinde NEC sistemi, NEC'nin patofizyolojisini modellemek için kullanılabilecek güçlü ve yeni bir araçtır. Bu platform, sürekli luminal akış ve esneme ile bir ko-kültür sistemi dahil ederek önceki modellere göre in vivo bağırsak ortamına daha çok benzeyen karmaşık bir mikro ortam sağlar. Bu koşullar, olgun epitelyal alt tiplerden ve sıkı bağlantılardan oluşan oldukça polarize bir epitel ile kaplı 3D villus benzeri mimarinin gelişimini teşvik eder (Şekil 2)36. Ek olarak, apikal epitel yüzeyine, hasta kaynaklı mikrobiyota veya yeni terapötikler gibi deneysel uyaranlara maruz kalmak için kolayca erişilebilir. Son olarak, bu model, ilgili hasta popülasyonlarından türetilen enteroidleri kullanarak, çeşitli enflamatuar ve inflamatuar olmayan bağırsak hastalıklarının yanı sıra normal bağırsak epitel gelişim mekanizmalarını incelemek için de kullanılabilir. Bu model, yenidoğan bağırsak örneklerinin sınırlı mevcudiyeti ve boyutu göz önüne alındığında gerekli olan tek bir hasta örneğinden veri toplamanın en üst düzeye çıkarılmasına izin verir.

Bu model kullanılarak, bebeklerde NEC sırasında meydana gelen bağırsak epitelinde meydana gelen fizyolojik değişikliklerin çoğu gözlenmiştir. Şiddetli NEC'li bir hastadan disbiyotik mikrobiyomun eklenmesi, inflamatuar sitokinlerin yukarı regülasyonuna (Şekil 3), çip üzerinde bağırsak bariyer geçirgenliğinin artmasına, hücre ölümünün artmasına, proliferasyonun azalmasına ve olgun epitel alt tiplerinin kaybına yol açtı36. Bu nedenle, bu modeli kullanan gelecekteki çalışmalar, NEC'nin gelişiminin altında yatan mekanizmaları ve olası terapötik müdahaleleri belirlemeye odaklanabilir.

Çip üzerinde NEC gibi karmaşık bir modelin uygulanmasında doğal sınırlamalar vardır. Bu sistem, mikroakışkan platformunu kullanmak için özel ekipman, reaktifler ve eğitim gerektirir. Ek olarak, model, çeşitli ortamların doğru bir şekilde hazırlanması, çipin uygun şekilde tohumlanması ve steril tekniğin sürdürülmesi ile başarı için kritik öneme sahip ayrıntılara çok dikkat edilmesini gerektirir. Araştırmacılar ayrıca, işbirlikçiler aracılığıyla elde edilmedikçe, genellikle yalnızca pediatrik cerrahlarla dördüncül bakım merkezlerinde bulunan yenidoğan hastalardan alınan bağırsak örneklerine veya enteroidlere erişebilmelidir. Son olarak, NEC'nin patofizyolojisine immün hücreler veya hipoksi gibi ek önemli bileşenlerin dahil edilmesi, fizyolojik uygunluğu arttırmakla birlikte, bu modelin zorluğunu daha da artırmaktadır.

Özetle, NEC-on-a-chip, mekanik çalışmaların kalitesini artıracak ve NEC için yeni terapötiklerin test edilmesini kolaylaştıracak NEC araştırması alanında önemli bir ilerlemedir. Bu araştırmanın nihai amacı, bağırsak iltihabı ve NEC'li bebekler için sonuçları iyileştiren hedefe yönelik tedaviler tasarlamak ve test etmektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bu makale ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgments

Bu makale, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) ve R01HD105301 (MG), Chan Zuckerberg Girişimi Hibesi 2022-316749 (MG), Thrasher Araştırma Fonu Erken Kariyer Ödülü (LCF), Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi'ne bağışçıların cömert desteğiyle UNC Çocuk Gelişimi Erken Kariyer Araştırmacısı Hibesi (LCF) tarafından desteklenmiştir. ve Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi Pediatri Bölümü.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Tags

Mikroakışkan Model Nekrotizan Enterokolit İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidleri Disbiyotik Mikrobiyom Kompleks Patogenez Bağırsak Sıkı Bağlantıları Bağırsak Bariyeri Geçirgenliği Epitel Hücre Ölümü Mikrobiyal Disbiyoz Düzensiz İnflamasyon Hayvan Modelleri Hücre Hatları Bağırsak Organoidleri In Vitro Model Mikroakışkan Teknolojisi Çip Üzerinde NEC Preterm Yenidoğan İnsan Endotel Hücreleri İlaç Keşif Testi
İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter