Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Микрофлюидная модель некротизирующего энтероколита с включением неонатальных кишечных энтероидов человека и дисбиотического микробиома

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

Этот протокол описывает in vitro модель некротизирующего энтероколита (НЭК), которая может быть использована для механистических исследований патогенеза заболевания. Он представляет собой микрофлюидный чип, засеянный кишечными энтероидами, полученными из кишечника новорожденного человека, эндотелиальными клетками и кишечным микробиомом новорожденного с тяжелой формой НЭК.

Abstract

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является тяжелым и потенциально смертельным заболеванием кишечника, которое трудно изучать из-за его сложного патогенеза, который остается до конца изученным. Патофизиология НЭК включает нарушение плотных соединений кишечника, повышенную проницаемость кишечного барьера, гибель эпителиальных клеток, микробный дисбиоз и нарушение регуляции воспаления. Традиционные инструменты для изучения НЭК включают животные модели, клеточные линии и органоиды кишечника человека или мыши. Несмотря на то, что исследования с использованием этих модельных систем улучшили понимание патофизиологии заболеваний, их способность повторить сложность НЭК человека ограничена. В настоящее время разработана улучшенная модель NEC in vitro с использованием микрофлюидной технологии, получившая название NEC-on-a-chip. Модель NEC-on-a-chip состоит из микрофлюидного устройства, засеянного кишечными энтероидами, полученными от недоношенного новорожденного, культивируемым совместно с эндотелиальными клетками человека и микробиомом младенца с тяжелой формой НЭК. Эта модель является ценным инструментом для механистических исследований патофизиологии НЭК и новым ресурсом для тестирования на открытие лекарств для лечения кишечных заболеваний новорожденных. В данной рукописи будет приведено подробное описание модели NEC-on-a-chip.

Introduction

Некротизирующий энтероколит (НЭК) поражает недоношенных новорожденных с частотой до 10% у рожденных с массой тела < 1500г1. Патофизиология НЭК является комплексной и включает повреждение кишечного эпителия, нарушение плотных соединений кишечника, повышение проницаемости кишечного барьера, иммунную дисрегуляцию и гибель эпителиальных клеток 2,3. Наше понимание механизмов, участвующих в патогенезе НЭК, остается неполным, и, несмотря на десятилетия исследований, до сих пор не существует эффективных таргетных методов лечения.

Существенным препятствием для продвижения исследований NEC является ограниченная доступность и малый размер первичной кишечной ткани, выделенной у младенцев. Кишечная ткань, резецированная у младенцев с НЭК, часто некротизирована и сильно повреждена, что затрудняет изучение механизмов, предшествующих началу заболевания. Например, тонкая кишка младенцев с НЭК наводнена иммунными клетками, а также наблюдается снижение количества кишечных стволовых клеток, снижение пролиферации эпителиальных клеток и повышение апоптоза эпителиальных клеток 4,5,6,7. Это приводит к трудностям в культивировании эпителиальных клеток кишечника из этих образцов и в выделении РНК и белков, которые могут разрушаться в этой враждебной воспалительной среде. Кроме того, поскольку у младенцев с хирургическим НЭК патологический процесс уже запущен, механистические исследования факторов, вызывающих заболевание, невозможны. Эти ограничения привели к тому, что для механистических исследований НЭК стали полагаться на животные модели.

Животные модели НЭК были созданы для мышей, крыс, поросят, кроликов и бабуинов 5,8,9,11. Сильной стороной животных моделей является то, что НЭК-подобное заболевание кишечника индуцируется факторами, связанными с возникновением НЭК у людей, включая дисбиотический микробиом, повторяющиеся эпизоды гипоксии и отсутствие грудного молока 5,8,10,11. Кроме того, воспалительная реакция и патологические изменения, наблюдаемые при экспериментальном НЭК, параллельны заболеваниям человека 5,9,12. Несмотря на то, что эти модели имитируют многие особенности НЭК человека, существуют неотъемлемые различия между патофизиологией НЭК у животных и человека. Например, мышиная модель НЭК индуцируется у мышей, родившихся доношенными, и хотя их развитие кишечника является неполным, патофизиология НЭК по своей сути отличается в этом клиническом контексте. Экспрессия генов кишечника мышей при рождении аналогична экспрессии преджизнеспособного человеческого плода и не приближается к экспрессии генов недоношенного новорожденного на сроке 22-24 недели гестации до 14-го дня (P14)13. Это опровергает мышиную модель NEC, потому что повреждение кишечника, как правило, не может быть индуцировано у мышей после P10. Кроме того, инбредным линиям мышей не хватает иммунологического14 и микробиологического разнообразия новорожденныхчеловека15, что служит еще одним осложняющим фактором. Таким образом, более широкое включение первичных образцов человека в исследования NEC повышает клиническую значимость исследований в этой области.

В исследованиях механизмов НЭК in vitro традиционно использовались монотипические клеточные линии, полученные из взрослых клеток рака кишечника, такихкак клетки колоректальной аденокарциномы (Caco2) и аденокарциномы толстой кишки человека (HT-29). Эти модели удобны, но ограничены в физиологической значимости из-за их роста из взрослых раковых клеток, неполяризованной архитектуры и фенотипических изменений, связанных с повторными пассажами в культуре. Кишечные энтероиды улучшают эти модели, поскольку они могут быть выращены из крипт кишечной ткани, дифференцированы во все подтипы кишечного эпителия и образуют трехмерную (3D) ворсинчатую структуру17,18,19,20. Недавно кишечные энтероиды были объединены с микрофлюидной технологией для разработки модели тонкой кишки на чипе и создания более физиологически значимой модельной системы in vitro 21.

Первые микрофлюидные устройства типа «орган-на-чипе» были представлены в начале 2000-х годов22,23,24. Первой моделью органа-на-чипе было дышащее человеческое легкое на чипе25. За этим последовали многочисленные модели одного органа, такие как кишечник 21, печень 26, почки 27, костный мозг 28, гематоэнцефалический барьер 29 и сердце30. Эти модели «орган-на-чипе» использовались для изучения острых, хронических и редких заболеваний, включая острый лучевой синдром31, хроническую обструктивную болезнь легких32 и нейродегенеративные заболевания33. Поляризованный характер клеток на этих чипах и наличие двух клеточных компартментов, разделенных пористой мембраной, позволяет моделировать сложные физиологические процессы, такие как перфузия, градиенты химической концентрации и хемотаксис иммунных клеток34,35. Таким образом, эти микрофлюидные системы предоставляют новый инструмент для изучения патофизиологии и механизмов заболеваний человека.

Модель тонкой кишки на чипе была описана Kasendra et al. в 2018 г., которые использовали педиатрические (в возрасте 10-14 лет) образцы биопсии тонкой кишки, дифференцированные в энтероиды и культивируемые на микрофлюидном устройстве21. Эндотелиальные клетки сосудов, непрерывный поток среды и растяжение/расслабление также были включены в эту модель. Они наблюдали дифференцировку подтипа кишечного эпителия, формирование 3D-ворсинчатых осей, продукцию слизи и паттерны экспрессии генов в тонком кишечнике21. Эта микрофлюидная модель была применена к неонатальным заболеваниям с разработкой системы NEC-on-a-chip, которая включает в себя неонатальные кишечные энтероиды, эндотелиальные клетки и микробиом новорожденного с NEC36. NEC-on-a-chip повторяет многие критические особенности NEC человека, включая экспрессию воспалительных генов, потерю специализированных эпителиальных клеток и снижение барьерной функции кишечника36. Таким образом, эта модель имеет множество применений при изучении НЭК, включая механистические исследования и открытие лекарств. В данной рукописи представлен подробный протокол работы модели NEC-on-a-chip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Энтероиды были получены из образцов тонкого кишечника недоношенных детей (родившихся на сроке от 22 до 36 недель беременности), полученных во время операции по поводу НЭК или других кишечных заболеваний невоспалительной этиологии. Весь сбор и обработка образцов осуществлялись после информированного согласия и одобрения Институциональных наблюдательных советов Вашингтонского университета в Сент-Луисе (протокол IRB No 201706182 и 201804040) и Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл (протокол IRB No 21-3134).

1. Выделение и покрытие крипт из тонкой кишки новорожденного человека для установления энтероидов

  1. Подготовка материала
    1. Подготовьте все необходимые носители, как описано в таблице 1. Убедитесь, что для приготовления всех сред используется асептическая техника. Фильтр стерилизовать с помощью фильтра 0,2 мкм и хранить при температуре 4 °C до использования.
  2. Промывание и измельчение тканей кишечника
    1. Поместите гидрогель матрикса клеточной культуры на лед, чтобы он оттаял. Получить ткань кишечника человека из операционной. Немедленно поместите образец в 5 мл ледяного средства для мытья тканей, чтобы инактивировать эндогенные протеазы.
    2. Промывайте содержимое кишечника ледяным фосфатным буфером (D-PBS) Dulbecco с помощью шприца объемом 10 мл с обрезанным наконечником дозатора P1000. Перенесите ткань кишечника в чашку диаметром 35 мм, содержащую 5 мл ледяного D-PBS.
    3. Разрежьте ткань кишечника продольно, чтобы обнажить просвет, и нарежьте ее на мелкие кусочки с помощью тонких ножниц. Промойте ткани кишечника, осторожно перемешивая в D-PBS в чашке для культивирования тканей.
    4. Переложите фрагменты ткани в чистую посуду диаметром 35 мм. Измельчите ткань тонкими ножницами. Оптимальный размер – 0,5см2 на штуку. Ткань кишечника должна пройти через обрезанный наконечник пипетки объемом 1 мл.
  3. Диссоциация тканей кишечника
    1. Добавьте в ткань 1 мл предварительно подогретой коллагеназы I. Смешайте ткань с коллагеназой путем пипетирования 10-15 раз и переложите в коническую пробирку объемом 15 мл.
    2. Закрепите трубку горизонтально на шейкере, установленном на 50 об/мин. Встряхивайте в течение 20 минут при комнатной температуре.
    3. После инкубации извлеките пробирки из шейкера и повторно суспендируйте раствор, пипетируя 10-15 раз. Необязательно: Удалите маленькую аликвоту, чтобы проверить наличие единичных крипт с помощью фазово-контрастной микроскопии.
  4. Изоляция кишечных крипт
    1. Отфильтруйте крипты через ситечко 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл на льду. Промойте ситечко 9 мл ледяного средства для мытья салфеток. Перелейте фильтрат в коническую пробирку объемом 15 мл.
    2. Центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C и осторожно удалите надосадочную жидкость. В пробирке останется около 200 мкл среды. Повторно суспендируйте гранулу в 5 мл ледяного средства для мытья тканей.
    3. Центрифуга при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл средства для мытья тканей и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    4. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать крипты. Осторожно и полностью аспирируйте надосадочную жидкость максимально с помощью пипетки. Положите трубку на лед.
  5. Покрытие кишечных крипт
    1. Ресуспендируйте гранулу в гидрогеле матрикса клеточной культуры (20 мкл/лунку 48-луночного планшета для культуры тканей) с помощью предварительно охлажденного наконечника пипетки, чтобы получить однородную суспензию крипт, пока пробирка остается на льду. Избегайте образования пузырьков при пипетировании. Держите тюбик на льду до тех пор, пока он не будет готов к использованию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель матрикса клеточной культуры полимеризуется при температуре выше 8 °C. Крипты, выделенные из кусочка кишечной ткани длиной от 0,5 см до 1 см, обычно помещают в 10 лунок 48-луночного планшета для культивирования тканей.
    2. Поместите суспензию гидрогеля с матрицей крипт/клеточной культуры в предварительно нагретую 48-луночную планшет для культуры тканей. Нагрейте пластину, чтобы ускорить затвердевание матрицы. Поместите суспензию в центр лунки. Избегайте пузырей при нанесении покрытия.
    3. Инкубируйте планшеты в течение 20 минут при 37 °C для полимеризации матрицы. Очень важно, чтобы гидрогель матрикса клеточной культуры полностью полимеризовался перед добавлением среды.
    4. После полимеризации матрицы добавьте в каждую лунку 300 мкл предварительно нагретой 50% среды, кондиционированной L-WRN. Инкубируют при 37 °C, 5%СО2.
    5. Меняйте носитель каждые 2–3 дня. Замените теплой средой с 50%-ным покрытием L-WRN. Прохождение каждые 7-10 дней. Пассажные энтероиды, когда они сливаются на 50%-90% и демонстрируют образование почек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется более частая замена носителя, если он станет желтым. Частота прохождения будет зависеть от плотности энтероидов и скорости роста клеток конкретного пациента. Энтероиды нужно будет пассажировать, если их центры потемнеют на вид.
  6. Пассирование энтероидов
    1. Аккуратно отсасывайте среду из скважин. Тщательно промойте лунки 500 мкл теплого D-PBS. Будьте внимательны, чтобы не потревожить матрицу.
    2. Добавьте 250 мкл раствора для рекуперации холодных камер в каждую лунку. Поцарапайте дно каждой лунки свежим наконечником пипетки, чтобы нарушить гидрогель матрикса клеточной культуры. Инкубируйте пластину на льду в течение 30 минут.
    3. Диссоциировать энтероиды путем энергичного пипетирования (~25-50 раз пипеткой P200) и добавить 500 мкл средства для промывки тканей.
    4. Перелейте энтероидную суспензию в пробирку объемом 15 мл и добавьте дополнительно 5 мл холодного средства для мытья тканей. Пипеткой аккуратно образуется однородный раствор.
    5. Центрифуга при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать энтероиды. Поместите трубку на лед и аспирируйте надосадочную жидкость как можно полнее. В пробирке останется примерно 30-60 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если возникают трудности с расщеплением энтероидов с помощью пипетирования, для облегчения этого процесса можно использовать 0,25% трипсин-ЭДТА или реагент для ферментативной диссоциации.
    6. Ресуспендируйте энтероиды в остаточном объеме промывочной среды с помощью пипетки P200. Избегайте образования пузырьков во время пипетирования.
    7. Добавьте 20 мкл матриксного гидрогеля клеточной культуры на новую лунку 48-луночного планшета к энтероидной суспензии. Разделите энтероиды 1:3, 1:4 или 1:5, в зависимости от их плотности.
    8. Добавьте суспензию в предварительно разогретую 48-луночную пластину. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 20 мин для затвердевания матрицы.
    9. После полимеризации добавьте в каждую лунку 300 мкл предварительно нагретой 50%-ной среды, кондиционированной L-WRN. Инкубируют при 37 °C, 5%СО2.

2. Неонатальная модель кишечника на чипе

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции по обращению с микрофлюидными чипами и использованию этого оборудования см. в протоколе37 о культуре микрофлюидной кишки в кишечнике производителя.

  1. Подготовка материала
    1. Подготовьте все необходимые носители, как описано в таблице 2. Убедитесь, что используется асептическая техника. Фильтр стерилизовать с помощью фильтра 0,2 мкм и хранить при температуре 4 °C до использования.
  2. День (-3): Размораживание и расширение микрососудистых эндотелиальных клеток кишечника человека (HIMECs)
    1. Разморозьте флакон с HIMECs и планшет в соответствии с рекомендациями производителя.
    2. Смазать колбу объемом 25см2 раствором для покрытия на основе желатина на 2 мин. Удалите излишки раствора. Добавьте в колбу HIMECs (примерно 0,5-1 x 10 6 клеток), ресуспендированные в6 мл среды HIMEC. Инкубируют при 37 °C, 5%СО2.
    3. Меняйте носитель HIMEC каждые 48 часов. Добавьте HIMECs в эндотелиальный (нижний) канал чипа в течение 48-72 ч после того, как он станет 100% конфлюэнтным.
  3. День (-1): Активация и покрытие чипов перед добавлением энтероидов
    1. Восстановите порошок реагента для активации чипов 1 (CR-1) для получения раствора CR-1. Убедитесь, что порошок CR-1 и раствор реагента для активации стружки 2 (CR-2) имеют комнатную температуру для этого этапа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда храните порошок CR-1 и раствор CR-1, приготовленный в следующие этапы, в защищенном от света месте. Для этих шагов свет в вытяжке должен быть выключен.
      1. Поместите чип и чип-носитель в подставку для чипов, затем поместите их в чашку для тканевых культур в колпаке для клеточных культур. Надлежащую технологию размещения стружки в носителе37 см. в протоколе изготовителя.
      2. Добавьте 1 мл раствора CR-2 во флакон с порошком CR-1, а затем непосредственно перелейте раствор из флакона с порошком CR-1 в пробирку объемом 15 мл, обернутую алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света. Не смешивайте раствор с пипеткой. Цель состоит в том, чтобы избежать образования пузырей.
      3. Добавьте еще 1 мл раствора CR-2 во флакон CR-1 и перелейте в пробирку объемом 15 мл. Повторите в общей сложности 4 полоскания и в общей сложности 4 мл CR-2, промытых через флакон CR-1. Добавьте крышку во флакон и переверните для последнего полоскания, чтобы удалить остатки порошка.
      4. Добавьте еще 6 мл CR-2 в пробирку объемом 15 мл, содержащую CR-1, чтобы получить окончательный объем 10 мл (0,5 мг/мл). Смешайте этот раствор пипеткой, не вводя пузырьков. Убедитесь, что CR-1 полностью растворен, прежде чем переходить к следующему шагу.
    2. Добавление раствора CR-1 в микросхему
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать появления пузырьков в каналах при добавлении этих решений. На этом этапе раствор CR-1 должен оставаться защищенным от света.
      1. С помощью наконечника пипетки на 200 мкл добавьте 20 мкл раствора CR-1 на входное отверстие нижнего канала до тех пор, пока раствор не начнет выходить из выхода из нижнего канала. Добавьте 50 мкл раствора CR-1 через входное отверстие верхнего канала до тех пор, пока раствор не начнет выходить из выхода из верхнего канала. Удалите излишки раствора CR-1 с поверхности стружки путем осторожной аспирации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы всегда должны добавляться в нижний канал перед верхним. Если наблюдаются пузырьки, промыть оба канала раствором CR-1 и повторить 2.3.2.1.
      2. Если крышка чашки для культуры тканей, содержащая чипсы, находится на месте, снимите ее для этого шага. Поместите чипсы под ультрафиолетовый свет на 15 минут. Удалите CR-1 из верхнего и нижнего каналов.
      3. Повторите шаги с 2.3.2.1 по 2.3.2.2, чтобы выполнить в общей сложности два шага УФ-активации. После этого этапа чипы перестают быть светочувствительными.
      4. Удалите CR-1 из верхнего и нижнего каналов. Промыть оба канала 100 мкл раствора CR-2. Извлеките раствор CR-2 из верхнего и нижнего каналов.
      5. Промойте оба канала 100 мкл стерильного D-PBS. Повторите стирку 2 раза. Добавьте 100 мкл D-PBS к обоим каналам. Удалите излишки с поверхности стружки, но оставьте каналы заполненными.
    3. Оболочка каналов с внеклеточным матриксом.
      1. Разморозьте фибронектин, коллаген IV и гидрогель матрикса клеточной культуры на льду непосредственно перед этим этапом и держите эти растворы на льду до конца этого раздела.
      2. Приготовьте следующие растворы внеклеточного матрикса (ВКМ) для верхнего и нижнего каналов чипа:
        Верхний канал: 100 мкл 200 мкг/мл коллагена IV типа и 100 мкг/мл матричного гидрогеля клеточной культуры в D-PBS на чип.
        Нижний канал: 100 мкл 200 мкг/мл коллагена IV типа и 30 мкг/мл фибронектина в D-PBS на чип.
      3. Полностью удалите D-PBS из верхнего и нижнего каналов. Добавьте 50 мкл ECM на входное отверстие нижнего канала до тех пор, пока на выходе не появится капля. Повторите то же самое для верхнего канала. Убедитесь, что вы используете соответствующие решения ECM для каждого канала и сначала добавьте решение в нижний канал.
      4. Добавьте D-PBS в резервуар для подставки для стружки и закройте крышку планшета для культивирования тканей. Поместите чипсы в инкубатор с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 на ночь.
  4. День (0): Посев чипов с HIMEC и энтероидами
    1. Вакуумное уравновешивание сред
      1. Для завершения эксперимента добавьте необходимый объем среды HIMEC и среды для расширения чипа в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Уравновешивайте среду до 37 °C на водяной бане не менее 1 ч.
      2. Подключите устройство вакуумной фильтрации к пробиркам объемом 50 мл, содержащим нагретую среду. Пробирки должны быть ориентированы так, чтобы предварительно нагретая среда находилась в нижней части конической пробирки объемом 50 мл. Вакуум при -70 кПа или выше в течение 10 с.
      3. Переверните трубки так, чтобы фильтрующий материал прошел через фильтр. Продолжайте пылесосить в течение 5 минут. По завершении вакуумной фильтрации снимите вакуумное фильтрующее устройство и поместите пробирки объемом 50 мл со средой в инкубатор с температурой 37 °C.
    2. Промывка стружки
      1. Промыть эндотелиальный канал путем промывки 100 мкл предварительно подогретой среды HIMEC.
        Промыть эпителиальный канал путем промывки 100 мкл предварительно подогретой среды для расширения чипа. Удалите все среды, которые растекаются по поверхности стружки.
      2. Повторите этап стирки. После этих промывок фильтрующий материал должен оставаться в каналах, а также во впускных и выходных отверстиях. Закройте крышку чашки с культурой, содержащей чипсы, и верните в инкубатор до тех пор, пока она не будет готова к использованию.
    3. Сбор урожая HIMEC
      1. Отсасывайте среду из колбы диаметром 25см2, содержащей HIMECs. Аккуратно постирайте монослой с помощью D-PBS. Добавьте в колбу 2 мл предварительно подогретого 0,05% трипсина-ЭДТА и аккуратно промойте монослой.
      2. Инкубируйте колбу при температуре 37 °C в течение 2-5 мин. Нейтрализуют трипсин с помощью 10 мл среды HIMEC. Ресуспендировать клетки в среде и перенести в пробирку объемом 15 мл.
      3. Отжим при ячейках 150 x g в течение 5 мин. при 4 °C. Ресуспендировать ячейки в 200 мкл среды HIMEC.
      4. Извлеките 10 мкл клеток и поместите пробирку на лед. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Желаемая концентрация HIMECs составляет от 6 x 10 6 до 8 x 106 клеток/мл.
    4. Посев HIMEC на чип
      1. Извлеките чип из инкубатора и занесите его в вытяжку. Отсасывайте все носители, которые могли просочиться на поверхность чипа.
      2. Промойте эпителиальный (верхний) канал чипа 100 мкл предварительно нагретой среды для расширения чипа. Промойте эндотелиальный (нижний) канал чипа 100 мкл предварительно подогретой среды HIMEC.
      3. Осторожно ресуспендируйте HIMEC для получения однородного распределения. Полностью удалить среду из эндотелиального (нижнего) канала. Добавьте 10 мкл HIMECs (~36 000 клеток/чип) в эндотелиальный (нижний) канал.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если при использовании 10 мкл HIMEC трудно заполнить канал HIMEC без образования пузырьков, увеличьте объем добавляемых клеток. На фишку должно приходиться одинаковое количество ячеек.
      4. Добавьте дополнительную органоидную питательную среду в эпителиальный (верхний) канал, если он не заполнен. Проверьте плотность посева HIMEC. Если они распределены неравномерно и не покрывают 80%-90% поверхности стружки, промойте канал и повторите посев.
      5. Инвертируйте чип в подставку для чипсов в чашке для клеточных культур. Добавьте D-PBS в резервуар в подставке для чипов. Закройте чашку с клеточными культурами крышкой и поместите ее в инкубатор.
      6. Оставьте стружку в перевернутом состоянии при температуре 37 °C на 2-3 часа, чтобы HIMEC прикрепились к мембране чипа. После завершения инкубации верните чипс/подставку для чипсов в вертикальное положение.
      7. Аккуратно промойте эндотелиальный (нижний) канал 100 мкл теплой среды HIMEC. Оставьте медиафайлы в канале. Аккуратно промыть эпителиальный (верхний) канал 100 мкл органоидной питательной среды. Оставьте медиафайлы в канале.
      8. Верните стружку в инкубатор с температурой 37 °C, выполняя следующие шаги.
    5. Сбор энтероидов и посев на чип
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чипы засеваются энтероидами, которые были разделены за 10-14 дней до этого, сливаются на 50%-75% и в пассаже 7 и 20. На рисунке 2 показано появление энтероидов в день 0. Время, необходимое для того, чтобы энтероиды были готовы к посеву, будет зависеть от скорости роста клеток конкретного пациента.
      1. Аккуратно отсасывайте среду из скважин. Лунки, содержащие матриксный гидрогель клеточной культуры, тщательно промыть 500 мкл теплого D-PBS. Будьте осторожны, чтобы не потревожить матрикс клеточной культуры гидрогелем.
      2. Добавьте 250 мкл раствора для рекуперации холодных камер в каждую лунку. Поцарапайте дно каждой лунки свежим наконечником пипетки, чтобы разрушить гидрогель матрикса клеточной культуры. Добавьте содержимое лунок в холодную пробирку объемом 15 мл на льду.
      3. Инкубируйте пробирку на льду в течение 45 минут и переворачивайте пробирку каждые 3-5 минут. На этом этапе подготовьте среду для энтероидной диссоциации. Поместите эту среду на водяную баню с температурой 37 °C, когда до конца инкубационного этапа останется 10 минут.
      4. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать энтероиды. Удалите надосадочную жидкость.
      5. Добавьте 2 мл среды для диссоциации энтероидов на собранную пластину к грануле и поместите на водяную баню с температурой 37 °C на 60–120 секунд. Аккуратно закручивайте трубку во время инкубации. Инкубируют достаточно долго, чтобы получить фрагментированные энтероиды, но без диссоциации в одноклеточную суспензию.
      6. После инкубации добавьте 10 мл холодного средства для мытья тканей в каждую пробирку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать энтероиды. Полностью отсосите надосадочную жидкость.
      7. Ресуспендируйте гранулу в 200 мкл среды для расширения чипа. Диссоциировать энтероиды энергичным пипетированием (~25-50 раз пипеткой Р200).
      8. Соедините клетки в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Пипеткой аккуратно образуется однородный раствор. Цель состоит в том, чтобы засеять чип фрагментированными энтероидами в небольшие кластеры по 10-30 клеток.
      9. Удалите 10 мкл клеточной суспензии для подсчета. Поместите оставшуюся клеточную суспензию на лед. Отрегулируйте объем наполнителя для расширения чипа для достижения концентрации 6 x 106 ячеек/мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения требуемой плотности может потребоваться центрифугирование энтероидов и ресуспендирование их в меньшем объеме среды.
      10. Подведите микрофлюидные чипы в колпак и аспирируйте среду из эпителиального (верхнего) канала чипа. Загрузите верхний канал чипа 30 мкл ресуспендированных ячеек (~180 000 ячеек на чип). Обеспечить полное и равномерное покрытие эпителиального канала чипа для формирования монослоя. Если этого не достигнуто, промойте энтероиды через чип и пересейте.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если возникают трудности с получением однородной суспензии при загрузке нескольких чипов, энтероиды могут быть разделены на аликвоты по 40 мкл в отдельных микроцентрифужных пробирках по 1,5 мл. Это позволит свести к минимуму вариабельность количества энтероидов и размера фрагментов по мере загрузки.
      11. Верните чипсы в подставку для чипсов в чашке для клеточных культур (если они были удалены). Добавьте D-PBS в резервуар в подставке для чипов. Закройте чашку для клеточных культур крышкой и поместите чипсы при температуре 37 °C, 5%CO2 на ночь.
  5. День (1): Подготовка стручков и введение потока в чипсы
    1. Занесите стружку в колпак для культуры тканей. Осторожно дважды промойте эпителиальный канал 100 мкл среды для расширения чипа. Осторожно дважды промойте эндотелиальный канал 100 мкл среды HIMEC. Удалите излишки материала с поверхности стружки.
    2. Заправляйте капсулы и регулируйте в соответствии с протоколом производителя37. Добавьте 2 мл подходящей среды во впускные резервуары. Добавьте 300 мкл соответствующей среды в выпускные резервуары. Расход составит 30 мкл/ч. Stretch пока не будет инициирован.
  6. День (2): Мониторинг развития монослоя и смены среды
    1. Приостановите работу модуля культуры и поместите стручки в вытяжку.
    2. Осмотрите стружку и стручок на наличие пузырьков. Исследуют эпителиальный монослой с помощью фазово-контрастного микроскопа. Делайте снимки в согласованных местах по всему чипу, чтобы отслеживать ход работы. Образуйте чипы, пока они остаются в капсулах.
    3. Извлеките фильтрующий материал из верхних впускных резервуаров канала и замените его 2 мл фильтрующего материала для дифференциации стружки. Добавьте 1 мл среды HIMEC в нижний входной резервуар канала. Оставьте достаточное количество среды во впускных резервуарах, чтобы дно резервуара оставалось покрытым тонким слоем среды.
    4. Верните капсулы в культуральный модуль и возобновите поток со скоростью 30 мкл/ч.
  7. День (3): Мониторинг развития монослоя, инициирование растяжения и добавление носителя
    1. Повторите шаги 2.6.1.1. и 2.6.1.2. Добавьте 1 мл фильтрующего материала для дифференциации стружки в верхний входной резервуар канала и 1 мл фильтрующего материала HIMEC в нижний входной резервуар канала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите среду из выпускных резервуаров обоих каналов, как только они начнут достигать 50-75% емкости.
    2. Верните стручки в модуль культуры. Возобновите поток со скоростью 30 мкл/ч и начните растяжение при напряжении 2% и частоте 0,2 Гц.
  8. День (4): Мониторинг развития монослоя, увеличение растяжения и добавление носителя
    1. Повторите шаги 2.6.1.1. и 2.6.1.2. Добавьте 1 мл фильтрующего материала для дифференциации стружки в верхний входной резервуар канала и 1 мл фильтрующего материала HIMEC в нижний входной резервуар канала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите среду из выпускных резервуаров обоих каналов, как только они начнут достигать 50-75% емкости.
    2. Верните стручки в модуль культуры. Возобновите поток со скоростью 30 мкл/ч и увеличьте растяжение до 10% деформации и частоты 0,2 Гц.
  9. День (5) - День (7): Мониторинг разработки монослоев и добавления медиа
    1. Повторите шаги 2.6.1.1. и 2.6.1.2. Добавьте 1 мл фильтрующего материала для дифференциации стружки в верхний входной резервуар канала и 1 мл фильтрующего материала HIMEC в нижний входной резервуар канала.
    2. Верните модули pod в модуль культуры и перезапустите поток и растяжку. После визуализации ворсинчатых осей переходим к модели NEC-on-a-chip.

3. Модель NEC-на-чипе

  1. Бактериологическое исследование кишечных бактерий
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе требуется предварительно титрованный замороженный запас кишечных бактерий от пациента с НЭК, который подготовлен до начала этого протокола. Для этих экспериментов использовали ранее описанную полимикробную кишечную бактериальную суспензию от одного пациента с тяжелой хирургической НЭК38.
    1. Приготовьте 50% глицериновый запас кишечных бактерий и храните в морозильной камере при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
    2. Разморозить аликвоту кишечных бактерий и инокулировать 10 мкл в 3 мл среды Лурия-Бертани (ЛБ). Инкубировать при температуре 37 °C при встряхивании при 150 об/мин в течение ночи.
    3. В тот же день аккуратно промойте каналы 100 мкл предварительно подогретой среды для дифференцировки чипов, не содержащей антибиотиков (верхний канал) или 100 мкл предварительно нагретой среды HIMEC, не содержащей антибиотиков (нижний канал). Полностью отсосите средство и повторите промывку в общей сложности 3 смыва.
    4. После аспирации третьей промывки замените фильтрующий материал в каналах и оставьте на месте.
    5. Промойте верхний и нижний входные резервуары канала стерильным D-PBS, а затем заполните 3 мл соответствующей среды, не содержащей антибиотиков. Загрунтуйте стручки и отрегулируйте, как в 2.5.2.
    6. Верните стружку в модуль культуры и повторно запустите растяжение и поток.
    7. На следующее утро возьмите 1 мл ночной бактериальной культуры и засейте ее в 25 мл свежей среды LB.
    8. Возвращайте эту новую культуру в шейкер с температурой 37 °C до тех пор, пока наружный диаметр600 не достигнет 0,6 ± 0,02, измеренных с помощью кюветы диаметром 1 см. Разбавьте бактериальную культуру до 7 x 10,8 колониеобразующих единиц/мл в среде для расширения чипов, не содержащей антибиотиков.
    9. Сохраните аликвоту этой культуры для подтверждения концентрации посевного материала39. Может потребоваться корректировка концентрации бактерий в зависимости от реакции эпителия.
    10. Извлеките среду из эпителиального (верхнего) канала. Добавьте 30 мкл бактериальной культуры, разведенной в среде для расширения чипов, не содержащей антибиотиков, в верхний канал чипа. Будьте очень осторожны, чтобы избежать перекрестного загрязнения HIMEC (эндотелиального) канала бактериями. Удалите лишний носитель с поверхности чипа.
    11. Оставьте чипсы в статических условиях в течение 30 минут, чтобы облегчить прилипание бактерий к апикальной стороне эпителия новорожденных. После инкубации промойте верхний канал 100 мкл расширительной среды, не содержащей антибиотиков, чтобы удалить неприсоединившиеся бактерии. Верните стружку в модуль культуры и снова запустите растяжение и поток.
    12. Каждые 24 ч извлекайте стручки из модуля культивирования и медленно промывают 100 мкл среды для расширения чипов без антибиотиков через эпителиальный канал. Это поможет предотвратить чрезмерный бактериальный рост.

4. Анализ проницаемости кишечника

ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть выполнено на любом этапе протокола. Если анализ проницаемости кишечника начат во время посева чипсов, он может быть использован для последовательной оценки слияния монослоев. Если этот анализ начинается с добавления кишечных бактерий, он может быть использован для определения влияния кишечных бактерий на целостность монослоя эпителия кишечника.

  1. Извлеките среду из впускного резервуара для эпителиального (верхнего) канала. Добавьте соответствующую среду, содержащую краситель проницаемости (50 мкг/мл), во входной резервуар. Используйте дифференцирующую среду для чипов, не содержащую антибиотиков, для модели NEC-on-a-chip.
  2. Собирайте стоки из эпителиальных и эндотелиальных каналов каждые 24 часа. Количественно определите концентрацию красителя проницаемости с помощью микропланшетного ридера по Lanik et al.36.

5. Иммуногистохимия

  1. Аккуратно промойте нижний и верхний каналы чипа 200 мкл D-PBS. Полностью аспирируйте D-PBS из каналов.
  2. Зафиксируйте ячейки, промыв оба канала 4%-ным параформальдегидом, оставив раствор в каналах. Отсасывайте излишки с поверхности стружки. Выдерживают при комнатной температуре 30 мин.
  3. Промойте оба канала 200 мкл D-PBS. Оставьте D-PBS в нижнем канале и полностью извлеките из верхнего канала.
  4. Пермеабилизацию эпителиального слоя путем промывания верхнего канала 100 мкл 0,1% раствора моющего средства, оставляя раствор в каналах. Отсасывайте излишки с поверхности стружки и инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут.
  5. Промойте оба канала 200 мкл D-PBS. Оставьте D-PBS в нижнем канале и полностью извлеките из верхнего канала.
  6. Добавьте 10% ослиную сыворотку (или соответствующий блокирующий агент) в верхний канал на 1 ч при комнатной температуре. Промойте оба канала 200 мкл D-PBS. Оставьте D-PBS в нижнем канале и полностью извлеките из верхнего канала.
  7. Первичные антитела развести в 5% сыворотке осла и добавить в верхний канал чипа (антитела и концентрации, проверенные ранее, доступны в Lanik et al.36). Выдерживают при температуре 4 °C в течение ночи.
  8. Промойте оба канала 3 раза 200 мкл D-PBS. Оставьте D-PBS в нижнем канале и полностью извлеките из верхнего канала.
  9. Разбавляют флуоресцентно меченные вторичные антитела, разбавленные 1:200 в 5% сыворотке осла в D-PBS и либо Hoechst 33342, либо DAPI (ядерные красители). Добавьте вторичные антитела в верхний канал чипа. Выдерживают при комнатной температуре 1 ч, защищая от света.
  10. Промойте оба канала 3 раза 200 мкл D-PBS. После окончательной стирки оставьте каналы, заполненные D-PBS. Поместите чип в матрицу с D-PBS для получения изображения с помощью конфокальной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированная стружка, окрашенная или неокрашенная, может храниться при температуре 4 °C до 1 недели в PBS. Следите за тем, чтобы каналы не пересыхали в течение этого периода.

6. Выделение РНК, подготовка кДНК и количественная ПЦР в реальном времени

  1. Аккуратно промойте нижний и верхний каналы чипа 200 мкл D-PBS. Полностью аспирируйте D-PBS из каналов.
  2. Извлеките общую РНК из клеток с помощью реагента для экстракции РНК в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы выделить РНК только из эпителия, инфузии проводят только через верхний канал.
  3. Количественная оценка концентрации РНК с помощью нанообъемного спектрофотометра. Обратная транскрибация 1 мкг общей РНК. Выполняйте количественную ПЦР в режиме реального времени. Праймеры, ранее использовавшиеся в этой модели, доступны в Lanik et al. 36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Энтероиды высевали в микрофлюидное устройство (рис. 1) и культивировали, как описано выше. С помощью светлопольной микроскопии контролировали рост энтероидов в матриксном гидрогеле клеточной культуры до посева и последующее расширение монослоя клеток эпителия кишечника после посева устройства (рис. 2). Образовался сливающийся монослой эпителиальных клеток кишечника, который впоследствии развился в зрелую 3D-ворсинчатую структуру (рис. 2). Это микрофлюидное устройство, засеянное энтероидным эпителием кишечника новорожденных и HIMECs, известно как неонатальный кишечник-на-чипе модели36.

Модель NEC-on-a-chip была разработана для повторения микробного дисбактериоза, присутствующего при неонатальном НЭК. Эта модель включает в себя добавление дисбиотического микробиома новорожденного с тяжелой формой НЭК к неонатальной модели кишечника на чипе. С добавлением этого дисбиотического микробиома значительно увеличилась экспрессия ряда провоспалительных цитокинов, включая фактор некроза опухоли альфа (TNFα; 3), обнаружен интерлейкин (ИЛ)-1 бета (ИЛ-1β)36 и ИЛ-8 36. Это увеличение провоспалительных цитокинов отражает то, что наблюдается для NEC36 человека.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение энтероидной культуры и платформы микрофлюидики. Крипты выделяют из хирургически резецированного кусочка кишечника новорожденного, высевают в гидрогель матрикса клеточной культуры и выращивают в кишечные энтероиды. Энтероиды диссоциируют и засеивают в верхний канал устройства микрофлюидики, покрытый внеклеточным матриксом (ВКМ). Затем в нижний канал добавляются эндотелиальные клетки (HIMEC). Фигура создана с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Прогрессия клеток кишечного эпителия, выращенных с использованием модели неонатального кишечника на чипе. Изображения, полученные с помощью светлопольной микроскопии, демонстрируют неонатальные энтероиды на 0-й день, монослой эпителиальных клеток в чипе на 3-й день и видимые ворсинчатые структуры на 7-й день. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Экспрессия мРНК мРНК эпителиальных клеток кишечника NEC-on-a-chip. Сравнение уровней мРНК TNFα при инкубации только со средой (контроль) или дисбиотическим микробиомом у младенца с НЭК (NEC-on-a-chip) в течение 24 ч или 72 ч. **** p < 0,0001 против контроля 24 ч; ** p < 0,005 по сравнению с контролем 72 ч по U-критерию Манна-Уитни. n=9 для контроля 24 ч; n=10 для NEC-on-a-chip 24 ч; n=6 для контроля 72 ч; n=5 для NEC-on-a-chip 72 ч. Данные являются средними ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1. Состав среды для выделения крипты и роста энтероидов. Обратитесь к Van Dussen et al.40 и Miyoshi et al.41 для получения подробных методов, описывающих получение кондиционированных сред L-WRN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2. Состав носителя для модели NEC-on-a-chip. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта система NEC-on-a-chip является новым мощным инструментом, который может быть использован для моделирования патофизиологии NEC. Эта платформа обеспечивает сложную микросреду, которая более близка к кишечной среде in vivo , чем предыдущие модели, за счет включения системы кокультивирования с непрерывным просветным потоком и растяжением. Эти условия способствуют развитию 3D-ворсинчатой архитектуры, выстланной высокополяризованным эпителием, состоящим из зрелых эпителиальных подтипов и плотных соединений (рис. 2)36. Кроме того, поверхность апикального эпителия легко доступна для воздействия экспериментальных стимулов, таких как микробиота пациента или новые терапевтические средства. Наконец, эта модель может быть использована для изучения различных воспалительных и невоспалительных заболеваний кишечника, а также механизмов нормального развития кишечного эпителия с использованием энтероидов, полученных из соответствующих популяций пациентов. Эта модель позволяет максимально эффективно собирать данные из одной выборки пациента, что крайне важно, учитывая ограниченную доступность и размер образцов кишечника новорожденных.

С помощью этой модели наблюдались многие физиологические изменения в эпителии кишечника, происходящие при НЭК у младенцев. Добавление дисбиотического микробиома у пациента с тяжелой формой НЭК приводило к повышению регуляции воспалительных цитокинов (рис. 3), увеличению проницаемости барьерного барьера «кишечник-на-чипе», усилению клеточной гибели, снижению пролиферации и потере зрелых эпителиальных подтипов36. Таким образом, будущие исследования, использующие эту модель, могут быть сосредоточены на определении механизмов, лежащих в основе развития НЭК, и возможных терапевтических вмешательств.

Существуют неотъемлемые ограничения при реализации сложной модели, такой как NEC-on-a-chip. Эта система требует специализированного оборудования, реагентов и обучения работе с платформой микрофлюидики. Кроме того, модель требует пристального внимания к деталям с тщательной подготовкой различных сред, правильной затравкой чипа и поддержанием стерильной техники, что имеет решающее значение для успеха. Исследователи также должны иметь доступ к образцам кишечника или энтероидам неонатальных пациентов, которые, как правило, доступны только в центрах четвертичного ухода с детскими хирургами, если только они не получены от сотрудников. Наконец, включение в патофизиологию НЭК дополнительных важных компонентов, таких как иммунные клетки или гипоксия, еще больше усложняет эту модель, хотя и повышает физиологическую значимость.

Подводя итог, можно сказать, что NEC-on-a-chip является важным достижением в области исследований NEC, которое повысит качество механистических исследований и облегчит тестирование новых терапевтических средств для NEC. Конечной целью этого исследования является разработка и тестирование таргетной терапии, которая улучшает результаты лечения младенцев с воспалением кишечника и НЭК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с данной рукописью.

Acknowledgments

Эта рукопись была поддержана R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) и R01HD105301 (MG) из Национальных институтов здравоохранения, грантом Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), премией Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), грантом UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) благодаря щедрой поддержке доноров Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл, и кафедра педиатрии Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Tags

Микрофлюидная модель Некротизирующий энтероколит Кишечные энтероиды новорожденного человека Дисбиотический микробиом Сложный патогенез Плотные соединения кишечника Проницаемость кишечного барьера Гибель эпителиальных клеток Микробный дисбактериоз Дисрегулируемое воспаление Животные модели Клеточные линии Кишечные органоиды Модель in vitro Микрофлюидная технология NEC-on-a-chip Недоношенный новорожденный Эндотелиальные клетки человека Тестирование на открытие лекарств
Микрофлюидная модель некротизирующего энтероколита с включением неонатальных кишечных энтероидов человека и дисбиотического микробиома
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter