Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

Abstract

Necrotizing enterocolitis (NEC) היא מחלת מעיים חמורה וקטלנית שקשה לחקור בשל הפתוגנזה המורכבת שלה, שנותרה מובנת לחלוטין. הפתופיזיולוגיה של NEC כוללת הפרעה בצמתים ההדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, מוות של תאי אפיתל, דיסביוזיס מיקרוביאלי ודלקת לא מווסתת. הכלים המסורתיים לחקר NEC כוללים מודלים של בעלי חיים, קווי תאים ואורגנואידים של מעיים אנושיים או עכברים. בעוד שמחקרים המשתמשים במערכות מודל אלה שיפרו את הבנת התחום של פתופיזיולוגיה של מחלות, יכולתם לשחזר את המורכבות של NEC אנושי מוגבלת. כעת פותח מודל משופר במבחנה של NEC בטכנולוגיה מיקרופלואידית, בשם NEC-on-a-chip. מודל NEC-on-a-chip מורכב ממכשיר מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם ביילוד מוקדם, בתרבית משותפת עם תאי אנדותל אנושיים ובמיקרוביום מתינוק עם NEC חמור. מודל זה הוא כלי רב ערך למחקרים מכניסטיים על הפתופיזיולוגיה של NEC ומשאב חדש לבדיקות גילוי תרופות למחלות מעיים בילוד. בכתב יד זה יסופק תיאור מפורט של מודל NEC-on-a-chip.

Introduction

Necrotizing enterocolitis (NEC) משפיע על פגים, עם שכיחות של עד 10% אצל אלה שנולדו במשקל < 1500 גרם1. הפתופיזיולוגיה של NEC מורכבת וכוללת נזק לאפיתל המעי, הפרעה בצמתים הדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, חוסר ויסות חיסוני ומוות תאי אפיתל 2,3. הבנתנו את המנגנונים המעורבים בפתוגנזה של NEC נותרה חלקית, ולמרות עשרות שנים של מחקר, עדיין אין טיפולים ממוקדים יעילים.

חסם משמעותי לקידום מחקר ה-NEC הוא הזמינות המוגבלת והגודל הקטן של רקמת המעי הראשונית שבודדה מתינוקות אנושיים. רקמת מעי שנכרתה מתינוקות עם NEC היא לעתים קרובות נמקית ופגומה קשות, מה שמסבך מחקרים על מנגנונים שמקדימים את הופעת המחלה. לדוגמה, המעי הדק של תינוקות עם NEC מוצף בתאי מערכת החיסון, ומספר מופחת של תאי גזע במעי, ירידה בשגשוג תאי אפיתל ואפופטוזיס מוגבר של תאי אפיתל נצפים גם הם 4,5,6,7. זה מוביל לקשיים בגידול תאי אפיתל מעיים מדגימות אלה ובבידוד RNA וחלבונים, שיכולים להתפרק בסביבה דלקתית עוינת זו. בנוסף, מכיוון שתהליך המחלה כבר מתקדם בתינוקות עם NEC ניתוחי, מחקרים מכניסטיים על גורמים הגורמים למחלה אינם ישימים. מגבלות אלה הובילו להסתמכות על מודלים של בעלי חיים למחקרים מכניסטיים של NEC.

מודלים של בעלי חיים של NEC הוקמו עבור עכברים, חולדות, חזרזירים, ארנבות ובבונים 5,8,9,11. חוזק של מודלים של בעלי חיים הוא שמחלת מעיים דמוית NEC נגרמת על ידי גורמים הקשורים להופעת NEC בבני אדם, כולל מיקרוביום דיסביוטיקה, אפיזודות חוזרות ונשנות של היפוקסיה, והיעדר חלב אם מזין 5,8,10,11. בנוסף, התגובה הדלקתית והשינויים הפתולוגיים שנצפו במהלך ניסוי NEC מקביל למחלה אנושית 5,9,12. בעוד מודלים אלה מחקים רבים מהמאפיינים של NEC אנושי, ישנם הבדלים מובנים בין הפתופיזיולוגיה של NEC בבעלי חיים ובבני אדם. לדוגמה, מודל מורין של NEC מושרה בעכברים שנולדו לטווח מלא, ולמרות שהתפתחות המעי שלהם אינה שלמה, הפתופיזיולוגיה של NEC שונה מטבעה בהקשר קליני זה. ביטוי גנים במעי מורין בלידה דומה לעובר אנושי בר קיימא ואינו מתקרב לזה של פג בהריון של 22-24 שבועות עד היום ה-14 (P14)13. זה מבלבל את מודל NEC מורין מכיוון שבדרך כלל לא ניתן לגרום לפגיעה במעיים בעכברים לאחר P10. בנוסף, זנים גזעיים של עכברים חסרים את המגוון החיסוני14 והמיקרוביולוגי של יילודים אנושיים15, המשמש גורם מבלבל נוסף. לפיכך, שילוב מוגבר של דגימות אנושיות ראשוניות במחקר NEC משפר את הרלוונטיות הקלינית של מחקרים בתחום זה.

מחקרים על המנגנונים של NEC במבחנה השתמשו באופן מסורתי בשורות תאים מונוטיפיים שמקורם בתאי סרטן מעיים בוגרים, כגון אדנוקרצינומה של המעי הגס (Caco2) ותאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי (HT-29)16. מודלים אלה נוחים אך מוגבלים ברלוונטיות הפיזיולוגית שלהם בשל גדילתם מתאי סרטן בוגרים, ארכיטקטורה לא מקוטבת ושינויים פנוטיפיים הקשורים למעברים חוזרים ונשנים בתרבית. אנטרואידים במעיים משפרים מודלים אלה מכיוון שניתן לגדל אותם מהקריפטות של רקמת המעי, להתמיין לכל תת-סוגי אפיתל המעי, וליצור מבנה תלת ממדי (3D) דמוי וילוס17,18,19,20. לאחרונה, אנטרואידים במעי שולבו עם טכנולוגיה מיקרופלואידית כדי לפתח מודל מעי דק על שבב ולספק מערכת מודל במבחנה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית21.

המכשירים המיקרופלואידים הראשוניים של איבר על שבב הוצגו בתחילת שנות ה-200022,23,24. המודל הראשון של איבר על שבב היה ריאות על שבב25. אחריו הופיעו מודלים רבים של איברים בודדים כגון מעי 21, כבד 26, כליות 27, מח עצם 28, מחסום דם-מוח 29 ולב30. מודלים אלה של איבר על שבב שימשו לחקר מחלות חריפות, כרוניות ונדירות, כולל תסמונת קרינה חריפה,31 מחלת ריאות חסימתית כרונית,32 ומחלות נוירודגנרטיביות 33. האופי המקוטב של התאים על שבבים אלה ונוכחותם של שני תאי תאים המופרדים על ידי קרום נקבובי מאפשר מידול של תהליכים פיזיולוגיים מורכבים כגון זילוח, שיפועי ריכוז כימיים וכימוטקסיס34,35 של תאי מערכת החיסון. מערכות מיקרופלואידיות אלה מספקות אפוא כלי חדש לחקר הפתופיזיולוגיה והמנגנונים של מחלות אנושיות.

מודל המעי הדק על שבב תואר על ידי Kasendra et al. בשנת 2018, שהשתמשו בדגימות ביופסיה של מעי דק ילדים (גילאי 10-14) שהתמיינו לאנטרואידים וגודלו בתרבית במכשיר מיקרופלואידי21. תאי אנדותל של כלי הדם, זרימת מדיה רציפה ומתיחה/הרפיה שולבו גם הם במודל זה. הם צפו בהתמיינות תת-סוג אפיתל במעי, היווצרות צירים תלת-ממדיים דמויי וילוס (villus), ייצור ריר ודפוסי ביטוי גנים במעי הדק21. מודל מיקרופלואידי זה יושם על מחלות יילודים עם פיתוח מערכת NEC-on-a-chip, המשלבת אנטרואידים של מעיים בילוד, תאי אנדותל ואת המיקרוביום מיילוד עם NEC36. NEC-on-a-chip משחזר רבים מהמאפיינים הקריטיים של NEC אנושי, כולל ביטוי גנים דלקתיים, אובדן תאי אפיתל מיוחדים ותפקוד מופחת של מחסום המעי36. לפיכך, למודל זה יש יישומים רבים בחקר NEC, כולל מחקרים מכניסטיים וגילוי תרופות. בכתב יד זה מסופק פרוטוקול מפורט לביצוע מודל NEC-on-a-chip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אנטרואידים נגזרו מדגימות מעיים קטנות מפגים (שנולדו בשבוע 22 עד 36 להריון) שהתקבלו בזמן הניתוח ל- NEC או למחלות מעיים אחרות עם אטיולוגיות לא דלקתיות. כל איסוף הדגימות ועיבודן בוצעו לאחר הסכמה מדעת ואישור מוועדות הביקורת המוסדיות באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס (מספרי פרוטוקול IRB 201706182 ו-201804040) ואוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל (פרוטוקול IRB מספר 21-3134).

1. בידוד וציפוי של קריפטות מהמעי הדק של היילוד האנושי כדי להקים אנטרואידים

  1. הכנת מדיה
    1. הכן את כל חומרי ההדפסה הנדרשים כמתואר בטבלה 1. ודא טכניקה אספטית משמש להכנת כל המדיה. יש לסנן, לעקר מדיה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  2. שטיפה וטחינה של רקמת מעיים
    1. הניחו את מטריצת תרבית התאים הידרוג'ל על קרח כדי להפשיר. להשיג רקמת מעי אנושית מחדר הניתוח. הניחו מיד את הדגימה ב -5 מ"ל של מדיה לשטיפת רקמות קרה כקרח כדי להשבית פרוטאזות אנדוגניות.
    2. יש לשטוף את תכולת המעי במי מלח חוצצי פוספט (D-PBS) קרים כקרח של Dulbecco באמצעות מזרק בנפח 10 מ"ל המצויד בקצה פיפטה P1000 גזוז. מעבירים את רקמת המעי לצלחת 35 מ"מ המכילה 5 מ"ל D-PBS קר כקרח.
    3. חותכים את רקמת המעי לאורך כדי לחשוף את לומן, ולחתוך אותו לחתיכות קטנות באמצעות מספריים עדינים. יש לשטוף את רקמת המעי על ידי התסיסה העדינה ב-D-PBS בצלחת תרבית הרקמה.
    4. מעבירים שברי רקמות לצלחת נקייה בקוטר 35 מ"מ. טחון רקמה עם מספריים עדינים. הגודל האופטימלי הוא 0.5 ס"מ2 לכל חתיכה. רקמת המעי צריכה לעבור דרך קצה פיפטה גזוז 1 מ"ל.
  3. ניתוק רקמת המעי
    1. הוסף 1 מ"ל של collagenase שחומם מראש I לרקמה. מערבבים רקמות עם collagenase על ידי pipetting 10-15 פעמים, ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל.
    2. הדקו את הצינור בצורה אופקית באמצעות שייקר שנקבע ב-50 סל"ד. נערו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לאחר הדגירה, להסיר את הצינורות מן השייקר, ולהשעות מחדש את הפתרון על ידי pipetting 10-15 פעמים. אופציונלי: הסר aliquot קטן כדי לאמת את נוכחותם של crypts בודדים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
  4. בידוד של crypts מעיים
    1. מסננים קריפטות דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל על קרח. לשטוף את המסננת עם 9 מ"ל של חומר שטיפת רקמות קר כקרח. מעבירים את התסנין לצינור חרוטי 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, ובעדינות להסיר את supernatant. בצינור יישארו כ-200 מיקרוליטר של מדיה. להשעות מחדש את הגלולה ב 5 מ"ל של חומר שטיפת רקמות קר כקרח.
    3. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיה לשטיפת רקמות ולהעביר צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
    4. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי pellet את הקריפטים. בזהירות ובשלמות שאפו את הסופרנאטנט ככל האפשר באמצעות פיפטה. מניחים את הצינור על קרח.
  5. ציפוי קריפטים במעיים
    1. השהה מחדש את הגלולה בהידרוג'ל מטריצת תרבית תאים (20 מיקרוליטר / באר של צלחת תרבית רקמה של 48 בארות) באמצעות קצה פיפטה מקורר מראש כדי ליצור תרחיף הומוגני של קריפטות בזמן שהצינור נשאר על קרח. הימנע יצירת בועות בעת pipetting. יש לשמור את הצינור על קרח עד שהוא מוכן לשימוש.
      הערה: הידרוג'ל מטריצת תרבית התאים יתפלמר בטמפרטורות מעל 8 מעלות צלזיוס. קריפטות שבודדו מחתיכת רקמת מעיים באורך 0.5-1 ס"מ מצופות בדרך כלל ב-10 בארות של צלחת תרבית רקמה בת 48 בארות.
    2. לוחים את תרחיף ההידרוג'ל מטריצת קריפטה/תרבית תאים בצלחת תרבית רקמה מחוממת מראש של 48 בארות. מחממים את הצלחת כדי לסייע בהתמצקות המטריצה. מניחים את המתלה במרכז הבאר. הימנעו מבועות בעת הציפוי.
    3. דגרו על הלוחות במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37°C כדי לפלמר את המטריצה. זה חיוני עבור הידרוג'ל מטריצת תרבית התא פילמור מלא לפני הוספת מדיה.
    4. לאחר שהמטריצה מתפלמרת, יש להוסיף 300 μL של מדיה מותנית 50% L-WRN שחוממה מראש לכל באר. יש לדגור ב-37°C, 5% CO2.
    5. שנה מדיה כל יומיים עד שלושה. החלף במדיה ממוזגת L-WRN חמה 50%. מעבר כל 7 עד 10 ימים. מעבר enteroids כאשר הם 50%-90% confluent ולהציג היווצרות ניצנים.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את המדיה בתדירות גבוהה יותר אם היא הופכת לצהובה. תדירות המעבר תהיה תלויה בצפיפות האנטרואיד ובקצב הצמיחה של תאי חולה מסוים. יהיה צורך לעבור אנטרואידים אם המרכזים שלהם הופכים כהים במראה.
  6. העברת האנטרואידים
    1. שאפו בעדינות את התקשורת מהבארות. בזהירות לשטוף בארות עם 500 μL של חם D-PBS. היזהר לא להפריע למטריצה.
    2. הוסף 250 μL של תמיסת שחזור תאים קרים לכל באר. מגרדים את תחתית כל באר עם קצה פיפטה טרי כדי לשבש את מטריצת תרבית התא הידרוג'ל. דוגרים צלחת על קרח במשך 30 דקות.
    3. נתק אנטרואידים על ידי פיפטינג נמרץ (~ 25-50 פעמים עם פיפטה P200) והוסף 500 μL של מדיה לשטיפת רקמות.
    4. מעבירים את המתלה האנטרואידי לצינור של 15 מ"ל ומוסיפים 5 מ"ל נוספים של מדיה לשטיפת רקמות קרות. פיפטה בעדינות כדי ליצור פתרון הומוגני.
    5. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי pellet enteroids. מניחים את הצינור על קרח ושאפו את הסופרנאטנט בצורה מלאה ככל האפשר. יישארו כ-30-60 מיקרוליטר בצינור.
      הערה: אם יש קשיים לפרק את enteroids עם pipetting, 0.25% טריפסין-EDTA או מגיב דיסוציאציה אנזימטית ניתן להשתמש כדי להקל על תהליך זה.
    6. Resuspend enteroids בנפח השיורי של מדיה לשטוף עם פיפטה P200. הימנע היווצרות בועות בזמן pipetting.
    7. הוסף 20 μL של הידרוג'ל מטריצת תרבית תאים לכל באר חדשה של צלחת 48 באר לתרחיף האנטרואידים. פצל את האנטרואידים 1:3, 1:4 או 1:5, בהתאם לצפיפותם.
    8. מוסיפים את המתלים לצלחת שחוממה מראש עם 48 בארות. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות כדי למצק את המטריצה.
    9. לאחר פילמור, יש להוסיף 300 μL של מדיה מותנית 50% L-WRN שחוממה מראש לכל באר. יש לדגור ב-37°C, 5% CO2.

2. מודל מעי על שבב יילודים

הערה: לקבלת הוראות מפורטות לטיפול בשבבים המיקרופלואידים ולשימוש בציוד זה, עיין בפרוטוקול תרבית שבב המעי התריסריון37 של היצרן.

  1. הכנת מדיה
    1. הכן את כל חומרי ההדפסה הדרושים כמתואר בטבלה 2. ודא שנעשה שימוש בטכניקה אספטית. יש לסנן, לעקר מדיה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  2. יום (-3): הפשרה והרחבה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במעי האנושי (HIMECs)
    1. הפשירו בקבוקון של HIMECs וצלחות בהתאם להמלצות היצרן.
    2. מצפים בקבוקבקוטר 25 ס"מ בתמיסת ציפוי על בסיס ג'לטין למשך 2 דקות. הסר תמיסה עודפת. הוסף HIMECs (בערך 0.5-1 x 106 תאים) resuspended ב 6 מ"ל של מדיה HIMEC לצלוחית. יש לדגור ב-37°C, 5% CO2.
    3. שנה מדיה HIMEC כל 48 שעות. הוסף HIMECs לערוץ האנדותל (התחתון) של השבב תוך 48-72 שעות מרגע הפיכתו ל-100% קונפלואנטי.
  3. יום (-1): הפעלה וציפוי השבבים לפני הוספת האנטרואידים
    1. הרכיבו מחדש את אבקת מגיב הפעלת השבב 1 (CR-1) כדי לייצר תמיסת CR-1. ודא שתמיסת מגיב הפעלת אבקת CR-1 ושבב 2 (CR-2) נמצאת בטמפרטורת החדר עבור שלב זה.
      הערה: יש להגן על אבקת CR-1 ועל תמיסת CR-1 המוכנה בשלבים הבאים מפני אור בכל עת. האור צריך להיות כבוי במכסה המנוע עבור שלבים אלה.
      1. הניחו את השבב ואת נשא השבב בעריסה ולאחר מכן הניחו אותם בצלחת תרבית רקמות במכסה המנוע של תרבית התא. עיין בפרוטוקול היצרן לקבלת הטכניקה הנכונה למיקום שבבים במוביל37.
      2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת CR-2 לבקבוקון של אבקת CR-1 ולאחר מכן העבר ישירות את התמיסה מבקבוקון האבקה CR-1 לצינור של 15 מ"ל עטוף ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. אין לערבב את הפתרון עם פיפטה. המטרה היא למנוע היווצרות בועות.
      3. הוסף עוד 1 מ"ל של תמיסת CR-2 לבקבוקון CR-1, והעבר לצינור 15 מ"ל. יש לחזור על הפעולה במשך 4 שטיפות ו-4 מ"ל של CR-2 שנשטפו דרך בקבוקון CR-1. הוסיפו את הפקק לבקבוקון והפכו לשטיפה האחרונה כדי להסיר שאריות אבקה.
      4. הוסף 6 מ"ל נוספים של CR-2 לצינור של 15 מ"ל המכיל CR-1 לקבלת נפח סופי של 10 מ"ל (0.5 מ"ג/מ"ל). מערבבים פתרון זה עם פיפטה מבלי להציג בועות. ודא ש-CR-1 מומס במלואו לפני שתמשיך לשלב הבא.
    2. הוספת פתרון CR-1 לשבב
      הערה: חשוב להימנע מהכנסת בועות לערוצים בעת הוספת פתרונות אלה. פתרון CR-1 אמור להישאר מוגן מפני אור בשלב זה.
      1. באמצעות קצה פיפטה של 200 μL, הוסף 20 μL של תמיסת CR-1 לכניסת הערוץ התחתון עד שהתמיסה מתחילה לצאת משקע הערוץ התחתון. הוסף 50 μL של תמיסת CR-1 דרך כניסת הערוץ העליונה עד שהפתרון מתחיל לצאת משקע הערוץ העליון. הסר כל תמיסת CR-1 עודפת מפני השטח של השבב על ידי שאיפה עדינה.
        הערה: תמיד יש להוסיף פתרונות לערוץ התחתון לפני הערוץ העליון. אם צוינו בועות, שטוף את שני הערוצים בתמיסת CR-1 וחזור על 2.3.2.1.
      2. אם המכסה של צלחת תרבית הרקמה המכילה את הצ'יפס נמצא במקומו, הסר אותו לשלב זה. מניחים את השבבים תחת אור UV למשך 15 דקות. הסר את CR-1 מהערוצים העליונים והתחתונים.
      3. חזור על שלבים 2.3.2.1 עד 2.3.2.2 לקבלת שני שלבים כוללים של הפעלת UV. לאחר שלב זה, השבבים כבר אינם רגישים לאור.
      4. הסר את CR-1 מהערוצים העליונים והתחתונים. שטפו את שני התעלות בתמיסת CR-2 בנפח 100 מיקרוליטר. הסר את פתרון CR-2 מהערוצים העליונים והתחתונים.
      5. שטפו את שני הערוצים עם 100 μL של D-PBS סטרילי. חזור על הכביסה 2x. הוסף 100 μL של D-PBS לשני הערוצים. הסר עודף מפני השטח של השבבים אך השאר את הערוצים מלאים.
    3. תעלות מעיל עם המטריצה החוץ תאית.
      1. הפשירו פיברונקטין (fibronectin), קולגן IV והידרוג'ל מטריצת תרבית תאים על קרח מיד לפני שלב זה, ושמרו את התמיסות הללו על קרח למשך שארית חלק זה.
      2. הכן את פתרונות המטריצה החוץ תאית (ECM) הבאים עבור הערוצים העליונים והתחתונים של השבב:
        ערוץ עליון: 100 μL של 200 מיקרוגרם/מ"ל של קולגן מסוג IV ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של הידרוג'ל מטריצת תרבית תאים ב-D-PBS לכל שבב.
        ערוץ תחתון: 100 μL של 200 מיקרוגרם/מ"ל קולגן מסוג IV ו-30 מיקרוגרם/מ"ל של פיברונקטין ב-D-PBS לכל שבב.
      3. הסר לחלוטין את D-PBS מהערוצים העליונים והתחתונים. הוסף 50 μL של ECM לכניסת הערוץ התחתון עד שתופיע טיפה על השקע. חזור על הפעולה עבור הערוץ העליון. הקפד להשתמש בפתרונות ECM המתאימים לכל ערוץ והוסף תחילה את הפתרון לערוץ התחתון.
      4. הוסף D-PBS למאגר עריסת השבב והחלף את המכסה בצלחת תרבית הרקמה. מניחים את השבבים באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך הלילה.
  4. יום (0): זריעת שבבים עם HIMECs ו enteroids
    1. שיווי משקל ואקום של מדיה
      1. הוסף את הנפח הנדרש של מדיה HIMEC ומדיה הרחבת שבב, כדי להשלים את הניסוי, לצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. יש לאזן את המדיה ל-37°C באמבט מים למשך שעה אחת לפחות.
      2. חבר את מכשיר סינון הוואקום לצינורות 50 מ"ל המכילים מדיה מחוממת. הצינורות צריכים להיות מכוונים עם המדיה המחוממת מראש בתחתית הצינור החרוטי 50 מ"ל. יש לשאוב אבק במהירות של -70 kPa ומעלה למשך 10 שניות.
      3. הפוך את הצינורות כך שהמדיה תעבור דרך המסנן. ממשיכים לשאוב במשך 5 דקות. עם השלמת סינון הוואקום, הסר את מכשיר סינון הוואקום והנח את צינורות 50 מ"ל המכילים מדיה לתוך האינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
    2. שטיפת הצ'יפס
      1. לשטוף את תעלת האנדותל על ידי שטיפה עם 100 μL של מדיה HIMEC שחומם מראש.
        שטפו את תעלת האפיתל על ידי שטיפה עם 100 μL של מדיה להרחבת שבב שחומם מראש. הסר כל מדיה שהתפשטה על פני השטח של השבבים.
      2. חזור על שלב הכביסה. המדיה צריכה להישאר בערוצים, כמו גם ביציאות הכניסה והמוצא לאחר שטיפות אלה. מחליפים את מכסה צלחת התרבית המכילה את הצ'יפס ומחזירים לאינקובטור עד שהוא מוכן לשימוש.
    3. קציר HIMECs
      1. יש לשאוב מדיה מבקבוק25 ס"מ 2 המכיל HIMECs. שטפו את השכבה החד-שכבתית בעדינות עם D-PBS. הוסיפו 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA שחומם מראש לבקבוק ושטפו בעדינות על החד-שכבתי.
      2. לדגור על הבקבוק ב 37 ° C במשך 2-5 דקות. נטרול טריפסין עם 10 מ"ל של מדיה HIMEC. להשעות תאים במדיה ולהעביר צינור 15 מ"ל.
      3. סחרור בתאים 150 x גרם במשך 5 דקות ב- 4 ° C. תאי השעיה מחדש ב 200 μL של מדיה HIMEC.
      4. הסר 10 μL של תאים ומניחים את הצינור על קרח. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. הריכוז הרצוי של HIMECs הוא 6 x 106 עד 8 x 106 תאים / מ"ל.
    4. זריעת HIMECs על השבב
      1. מוציאים את השבב מהאינקובטור ומכניסים אותו למכסה המנוע. שאפו לכל מדיה שאולי דלפה על פני השבב.
      2. שטפו את תעלת האפיתל (העליונה) של השבב ב-100 מיקרוליטר של מדיית הרחבת שבב שחוממה מראש. שטפו את תעלת האנדותל (התחתונה) של השבב עם 100 μL של מדיה HIMEC שחוממה מראש.
      3. השהה מחדש בעדינות HIMECs כדי להשיג התפלגות הומוגנית. הסר לחלוטין את המדיה מערוץ האנדותל (התחתון). הוסף 10 μL של HIMECs (~ 36,000 תאים / שבב) לערוץ האנדותל (התחתון).
        הערה: אם קשה למלא את ערוץ HIMEC ללא היווצרות בועות בעת שימוש ב- 10 μL של HIMECs, הגדל את נפח התאים שנוספו. זה צריך להיות אותו מספר תאים לכל שבב.
      4. הוסף מצע גידול אורגנואידי נוסף לערוץ האפיתל (העליון) אם הוא אינו מלא. בדוק את צפיפות הזריעה של HIMECs. אם הם אינם מפוזרים באופן אחיד ואינם מכסים 80%-90% משטח השבב, שוטפים את התעלה וחוזרים על הזריעה.
      5. הפכו את השבב לעריסת השבב בצלחת תרבית התא. הוסף D-PBS למאגר בעריסה השבב. מחליפים את המכסה לצלחת תרבית התאים ומניחים אותה באינקובטור.
      6. השאירו את השבב הפוך בטמפרטורה של 37°C למשך 2-3 שעות כדי לאפשר ל-HIMECs להתחבר לקרום השבב. לאחר השלמת הדגירה, החזירו את עריסת השבב/שבב למצב זקוף.
      7. שטפו בעדינות את תעלת האנדותל (התחתונה) עם 100 מיקרוליטר של מדיה חמה של HIMEC. השאר מדיה בערוץ. שטפו בעדינות את תעלת האפיתל (העליונה) עם 100 מיקרוליטר של מצע גידול אורגנואידים. השאר מדיה בערוץ.
      8. להחזיר שבבים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס תוך השלמת השלבים הבאים.
    5. קצירת אנטרואידים וזריעה על שבב
      הערה: שבבים נזרעים עם אנטרואידים שפוצלו 10-14 יום לפני כן, הם 50%-75% במפגש, ובמעבר 7 ו -20. ראו איור 2 להופעת אנטרואידים ביום 0. הזמן הדרוש עבור enteroids להיות מוכן זריעה יהיה תלוי בקצב הצמיחה של תאים של חולה מסוים.
      1. שאפו בעדינות את התקשורת מהבארות. בזהירות לשטוף בארות המכילות הידרוג'ל מטריצת תרבית תאים עם 500 μL של D-PBS חם. היזהר לא להפריע הידרוג'ל מטריצת תרבית התא.
      2. הוסף 250 μL של תמיסת שחזור תאים קרים לכל באר. גרדו את תחתית כל באר עם קצה פיפטה טרי כדי לשבש הידרוג'ל מטריצת תרבית תאים. הוסף תכולת בארות לצינור קר של 15 מ"ל על קרח.
      3. דוגרים על צינור על קרח במשך 45 דקות, והופכים את הצינור כל 3-5 דקות. במהלך שלב זה, להכין מדיה דיסוציאציה enteroid . מקם מדיה זו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס כאשר נותרו 10 דקות בשלב הדגירה.
      4. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי pellet enteroids. הסר את supernatant.
      5. הוסף 2 מ"ל של מדיה דיסוציאציה אנטרואידית לכל צלחת שנקטפה לגלולה ומניחים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות עד 120 שניות. מערבלים בעדינות את הצינור במהלך הדגירה. לדגור מספיק זמן כדי להשיג אנטרואידים מקוטעים אך ללא דיסוציאציה לתרחיף תא יחיד.
      6. לאחר הדגירה, הוסף 10 מ"ל של מדיה לשטיפת רקמות קרות לכל צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי pellet enteroids. שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין.
      7. להשעות מחדש את הגלולה ב 200 μL של מדיה הרחבת שבב. לנתק enteroids על ידי pipetting נמרץ (~ 25-50 פעמים עם פיפטה P200).
      8. שלב תאים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל. פיפטה בעדינות כדי ליצור פתרון הומוגני. המטרה היא לזרוע את השבב עם enteroids מקוטעים באשכולות קטנים של 10-30 תאים.
      9. הסר 10 μL של תרחיף התא לספירה. מניחים את תרחיף התא הנותר על קרח. התאם את נפח מדיית הרחבת השבב כדי להשיג ריכוז של 6 x 106 תאים/מ"ל.
        הערה: ייתכן שיהיה צורך לצנטריפוגה את האנטרואידים ולהשעות אותם מחדש בנפח קטן יותר של מדיה כדי להשיג את הצפיפות הנדרשת.
      10. הכניסו את השבבים המיקרופלואידים למכסה המנוע ושאפו את המדיה מערוץ האפיתל (העליון) של השבב. טען את הערוץ העליון של השבב עם 30 μL של תאים מרחפים (~ 180,000 תאים / שבב). להבטיח כיסוי מלא ואחיד של ערוץ אפיתל של השבב להיווצרות monolayer. אם זה לא מושגת, לשטוף את enteroids דרך השבב reseed.
        הערה: אם יש קשיים בהשגת השעיה אחידה בעת טעינת שבבים מרובים, ניתן להפריד את האנטרואידים לאליציטוטים של 40 μL בצינורות מיקרוצנטריפוגות בודדות של 1.5 מ"ל. פעולה זו תמזער את השונות במספרי האנטרואידים ובגודל המקטע ככל שהטעינה מתקדמת.
      11. מחזירים את הצ'יפס לעריסת השבב בצלחת תרבית התאים (אם הוסרו). הוסף D-PBS למאגר בעריסה השבב. החליפו את המכסה לצלחת תרבית התא, והניחו את הצ'יפס בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך הלילה.
  5. יום (1): הכנת תרמילים והחדרת זרימה לשבבים
    1. הכניסו את השבבים למכסה המנוע של תרבית הרקמות. שטפו בעדינות את תעלת האפיתל פעמיים עם 100 מיקרוליטר של מדיית הרחבת שבב. שטפו בעדינות את תעלת האנדותל פעמיים עם 100 μL של מדיה HIMEC. הסר מדיה עודפת משטח השבב.
    2. קפסולות פריים ומווסתות לפי פרוטוקול היצרן37. הוסף 2 מ"ל של מדיה מתאימה למאגרי הכניסה. הוסף 300 μL של המדיה המתאימה למאגרי היציאה. קצב הזרימה יהיה 30 μL/h. מתיחה עדיין לא תתחיל.
  6. יום (2): מעקב אחר התפתחות חד-שכבתית ושינוי מדיה
    1. השהה את מודול התרבית והכנס את התרמילים למכסה המנוע.
    2. בדוק שבבים ותרמילים עבור בועות. בדוק את monolayer אפיתל באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. צלם תמונות במיקומים עקביים ברחבי השבב כדי לפקח על ההתקדמות. דמיינו את השבבים בזמן שהם נשארים בתרמילים.
    3. הסר את המדיה ממאגרי הכניסה של הערוץ העליון והחלף אותה ב -2 מ"ל של מדיית בידול שבבים. הוסף 1 מ"ל של מדיה HIMEC למאגר הכניסה התחתון של הערוץ. השאירו מספיק מדיה במאגרי הכניסה כדי להבטיח שתחתית המאגר תישאר מכוסה בשכבה דקה של מדיה.
    4. החזירו את התרמילים למודול התרבית והפעילו מחדש את הזרימה במהירות של 30 μL/h.
  7. יום (3): מעקב אחר התפתחות חד-שכבתית, ייזום מתיחה והוספת מדיה
    1. חזור על שלבים 2.6.1.1. ו-2.6.1.2. הוסף 1 מ"ל של מדיית בידול שבבים למאגר כניסת הערוץ העליון והוסף 1 מ"ל של מדיית HIMEC למאגר כניסת הערוץ התחתון.
      הערה: הסר מדיה ממאגרי המוצא של שני הערוצים ברגע שהם מתחילים להגיע לקיבולת של 50-75%.
    2. החזירו את התרמילים למודול התרבית. הפעל מחדש את הזרימה במהירות 30 μL/h, והתחל מתיחה במאמץ של 2% ובתדירות של 0.2 הרץ.
  8. יום (4): מעקב אחר התפתחות חד-שכבתיים, הגדלת מתיחה והוספת מדיה
    1. חזור על שלבים 2.6.1.1. ו-2.6.1.2. הוסף 1 מ"ל של מדיית בידול שבבים למאגר כניסת הערוץ העליון והוסף 1 מ"ל של מדיית HIMEC למאגר כניסת הערוץ התחתון.
      הערה: הסר מדיה ממאגרי המוצא של שני הערוצים ברגע שהם מתחילים להגיע לקיבולת של 50-75%.
    2. החזירו את התרמילים למודול התרבית. הפעל מחדש את הזרימה במהירות של 30 μL/h והגדל את המתיחה למאמץ של 10% ולתדר של 0.2 הרץ.
  9. יום (5) עד יום (7): מעקב אחר התפתחות חד-שכבתית והוספת מדיה
    1. חזור על שלבים 2.6.1.1. ו-2.6.1.2. הוסף 1 מ"ל של מדיית בידול שבבים למאגר כניסת הערוץ העליון והוסף 1 מ"ל של מדיית HIMEC למאגר כניסת הערוץ התחתון.
    2. החזירו את התרמילים למודול התרבית, והפעילו מחדש את הזרימה והמתיחה. לאחר הדמיה של צירים דמויי וילוס (villus), המשך למודל NEC-on-a-chip.

3. דגם NEC-on-a-chip

  1. תרבית חיידקי מעיים
    הערה: שלב זה דורש מלאי קפוא מראש של חיידקים אנטריים ממטופל עם NEC שהוכן מראש לפני תחילת פרוטוקול זה. עבור ניסויים אלה, נעשה שימוש בתרחיף חיידקים אנטריים פולימיקרוביאליים שתואר קודם לכן מחולה אחד עם NEC כירורגי חמור38.
    1. הכינו מלאי גליצרול של 50% חיידקים אנטריים ואחסנו במקפיא בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
    2. הפשיר aliquot של חיידקי המעי ולחסן 10 μL לתוך 3 מ"ל של Luria-Bertani (LB) מדיה. יש לדגור ב-37°C עם רעידות ב-150 סל"ד למשך הלילה.
    3. באותו יום, שטפו בעדינות תעלות עם 100 μL של אמצעי התמיינות שבבים ללא אנטיביוטיקה שחוממו מראש (ערוץ עליון) או 100 μL של מדיה HIMEC ללא אנטיביוטיקה שחוממה מראש (ערוץ תחתון). יש לשאוף את המדיום במלואו ולחזור על השטיפה במשך 3 כביסות בסך הכל.
    4. לאחר שאיפה את השטיפה השלישית, להחליף את המדיה בערוצים ולהשאיר במקום.
    5. יש לשטוף את מאגרי הכניסה של התעלה העליונה והתחתונה ב-D-PBS סטרילי ולאחר מכן למלא ב-3 מ"ל של המדיה המתאימה ללא אנטיביוטיקה. קפסולות פריים ומווסתות כמו ב-2.5.2.
    6. החזר את השבב למודול התרבית, והתחל מחדש מתיחה וזרימה.
    7. למחרת בבוקר, קח 1 מ"ל של תרבית חיידקים לילה וחסן אותו לתוך 25 מ"ל של מדיה LB טרי.
    8. החזירו את התרבית החדשה לשייקר של 37°C עד שה-OD600 יגיע ל-0.6 ±-0.02 שנמדד באמצעות קובטה של 1 ס"מ. לדלל את תרבית החיידקים ל 7 x 108 יחידות יוצרות מושבה / מ"ל במצע הרחבת שבב ללא אנטיביוטיקה.
    9. שמור aliquot של תרבות זו כדי לאשר את הריכוז של החיסון39. ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז החיידקים בהתאם לתגובה של האפיתל.
    10. הסר את המדיה מערוץ האפיתל (העליון). הוסף 30 μL של תרבית חיידקים מדולל במצע הרחבת שבב ללא אנטיביוטיקה לערוץ העליון של השבב. היזהר מאוד כדי למנוע זיהום צולב של ערוץ HIMEC (אנדותל) עם חיידקים. הסר כל מדיה נוספת מפני השטח של השבב.
    11. אפשרו לשבבים להישאר בתנאים סטטיים למשך 30 דקות כדי להקל על היצמדות חיידקים לצד האפי של אפיתל היילוד. לאחר הדגירה, שטפו את התעלה העליונה ב-100 מיקרוליטר של מדיית התפשטות נטולת אנטיביוטיקה כדי להסיר חיידקים לא מחוברים. להחזיר שבבים למודול התרבית וליזום מחדש מתיחה וזרימה.
    12. כל 24 שעות, הסירו את התרמילים ממודול התרבית, ושטפו באיטיות 100 מיקרוליטר של מצע הרחבת שבב ללא אנטיביוטיקה דרך תעלת האפיתל. זה יסייע במניעת צמיחת יתר של חיידקים.

4. בדיקת חדירות מעיים

הערה: ניתן לבצע זאת בכל שלב במהלך הפרוטוקול. אם מופעל כאשר שבבים נזרעים, בדיקת חדירות המעי ניתן להשתמש כדי להעריך סדרתית מפגש monolayer. אם יזם עם תוספת של חיידקי מעיים, בדיקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את ההשפעה של חיידקי מעיים על שלמות monolayer אפיתל המעי.

  1. הסר מדיה ממאגר הכניסה עבור ערוץ האפיתל (העליון). הוסף מדיה מתאימה המכילה צבע חדירות (50 מיקרוגרם/מ"ל) למאגר הכניסה. השתמש במדיית בידול שבבים ללא אנטיביוטיקה עבור מודל NEC-on-a-chip.
  2. לאסוף את הקולחים מתעלות האפיתל והאנדותל כל 24 שעות. כמת את ריכוז צבע החדירות באמצעות קורא microplate לפי Lanik et al.36.

5. אימונוהיסטוכימיה

  1. שטפו בעדינות את הערוץ התחתון ואת הערוץ העליון של השבב עם 200 μL של D-PBS. לגמרי לשאוף D-PBS מן הערוצים.
  2. תקן את התאים על ידי שטיפת שני הערוצים עם 4% paraformaldehyde, משאיר תמיסה בתעלות. לשאוף עודף משטח השבב. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. שטפו את שני הערוצים עם 200 μL של D-PBS. השאר את D-PBS בערוץ התחתון והסר לחלוטין מהערוץ העליון.
  4. לחדור את שכבת האפיתל על ידי שטיפת הערוץ העליון עם 100 μL של 0.1% תמיסת דטרגנט, משאיר תמיסה בתעלות. יש לשאוף עודפים מפני השטח של השבב, ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות.
  5. שטפו את שני הערוצים עם 200 μL של D-PBS. השאר את D-PBS בערוץ התחתון והסר לחלוטין מהערוץ העליון.
  6. הוסיפו סרום חמור 10% (או חומר חוסם מתאים) לתעלה העליונה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את שני הערוצים עם 200 μL של D-PBS. השאר את D-PBS בערוץ התחתון והסר לחלוטין מהערוץ העליון.
  7. לדלל נוגדנים ראשוניים בסרום חמור 5% ולהוסיף לערוץ העליון של השבב (נוגדנים וריכוזים שנבדקו בעבר זמינים Lanik et al.36). יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  8. שטפו את שני הערוצים 3x עם 200 μL של D-PBS. השאר את D-PBS בערוץ התחתון והסר לחלוטין מהערוץ העליון.
  9. נוגדנים משניים מדוללים בעלי תווית פלואורסצנטית מדוללים בקנ"מ 1:200 בסרום חמור 5% ב-D-PBS וב-Hoechst 33342 או DAPI (כתמים גרעיניים). הוסף נוגדנים משניים לערוץ העליון של השבב. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, מוגן מפני אור.
  10. שטפו את שני הערוצים 3x עם 200 μL של D-PBS. השאירו תעלות מלאות D-PBS לאחר השטיפה הסופית. הניחו את השבב בצלחת הדמיה עם D-PBS לרכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: שבבים קבועים, מוכתמים או לא מוכתמים, ניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבוע אחד ב- PBS. ודא שהערוצים אינם מתייבשים במהלך תקופה זו.

6. בידוד RNA, הכנת cDNA ו-PCR כמותי בזמן אמת

  1. שטפו בעדינות את הערוץ התחתון ואת הערוץ העליון של השבב עם 200 μL של D-PBS. לגמרי לשאוף D-PBS מן הערוצים.
  2. חלץ את סך הרנ"א מהתאים באמצעות מגיב מיצוי RNA בהתאם להוראות היצרן. כדי לבודד RNA מהאפיתל בלבד, יש להחדיר דרך התעלה העליונה בלבד.
  3. כמת את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-נפח. תעתיק לאחור 1 מיקרוגרם של סך RNA. ביצוע PCR כמותי בזמן אמת. פריימרים ששימשו בעבר במודל זה זמינים ב- Lanik et al. 36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנטרואידים נזרעו על המכשיר המיקרופלואידי (איור 1) וגודלו בתרבית כפי שתואר לעיל. גדילת האנטרואידים במטריצת הידרוג'ל של תרבית תאים לפני הזריעה, ולאחר מכן ההתרחבות של חד-שכבה של תאי אפיתל המעי לאחר הזריעה, נוטרו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2). חד-שכבה חד-שכבתית של תאי אפיתל במעי נוצרה ולאחר מכן התפתחה למבנה בוגר דמוי וילוס תלת-ממדי (איור 2). מכשיר מיקרופלואידי זה שנזרע עם אפיתל מעיים בילוד שמקורו אנטרואידים ו- HIMECs ידוע בשם מודל המעי על שבבבילוד 36.

מודל NEC-on-a-chip פותח כדי לשחזר את הדיסביוזה המיקרוביאלית הקיימת במהלך NEC בילוד. מודל זה כולל הוספה של מיקרוביום דיסביוטי מיילוד עם NEC חמור למודל המעי על שבב של היילוד. עם הוספת המיקרוביום הדיסביוטי הזה, ביטוי מוגבר באופן משמעותי של מגוון ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל גורם נמק גידולי אלפא (TNFα; איור 3), אינטרלוקין (IL)-1 בטא (IL-1β)36, ו-IL-8 זוהו 36. עלייה זו בציטוקינים מעודדי דלקת משקפת את מה שנצפה עבור NEC36 אנושי.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של תרבית אנטרואידית ופלטפורמת המיקרופלואידיקה. קריפטים מבודדים מחתיכה כירורגית של מעי ילודים, והם נזרעים בהידרוג'ל מטריצת תרבית תאים ומגודלים לאנטרואידים במעי. אנטרואידים מנותקים ונזרעים בערוץ העליון של מכשיר המיקרופלואידיקה המצופה במטריצה חוץ-תאית (ECM). תאי אנדותל (HIMECs) מתווספים לאחר מכן לערוץ התחתון. איור שנוצר באמצעות Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התקדמות תאי אפיתל במעי שגדלו באמצעות מודל מעי על שבב בילוד. תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר מדגימות אנטרואידים בילוד ביום 0, חד-שכבה של תאי אפיתל בשבב ביום 3, ומבנים דמויי וילוס נראים לעין ביום 7. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. ביטוי TNFα mRNA של תא אפיתל מעי NEC-on-a-chip. השוואה של רמות TNFα mRNA לאחר הדגירה עם מדיה בלבד (בקרה) או מיקרוביום דיסביוטי מתינוק עם NEC (NEC-on-a-chip) למשך 24 שעות או 72 שעות. **** p < 0.0001 לעומת ביקורת 24 שעות; ** p < 0.005 לעומת שליטה 72 שעות על ידי מבחן Mann-Whitney U. n = 9 לשליטה 24 שעות; n = 10 עבור NEC-on-a-chip 24 שעות; n = 6 עבור שליטה 72 שעות; n=5 עבור NEC-on-a-chip 72 שעות. הנתונים הם ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1. הרכב מדיה לבידוד קריפטה וצמיחה אנטרואידית. עיין ב- Van Dussen et al.40 וב- Miyoshi et al.41 לקבלת שיטות מפורטות המתארות את הכנת המדיה המותנית L-WRN. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2. הרכב מדיה עבור מודל NEC-on-a-chip. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת NEC-on-a-chip זו היא כלי חדש רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי למדל את הפתופיזיולוגיה של NEC. פלטפורמה זו מספקת מיקרו-סביבה מורכבת הדומה יותר לסביבת המעי in vivo מאשר דגמים קודמים על ידי שילוב מערכת תרבות משותפת עם זרימה ומתיחות לומינליות רציפות. התנאים האלה מקדמים את התפתחותה של ארכיטקטורה תלת-ממדית דמוית וילוס המרופדת על-ידי אפיתל מקוטב מאוד המורכב מתתי-סוגים בוגרים של אפיתל וצמתים הדוקים (איור 2)36. בנוסף, משטח האפיתל האפי נגיש בקלות לחשיפה לגירויים ניסיוניים, כגון מיקרוביוטה שמקורה במטופל או טיפולים חדשניים. לבסוף, מודל זה יכול לשמש גם לחקר מגוון מחלות מעיים דלקתיות ולא דלקתיות, כמו גם מנגנונים של התפתחות אפיתל מעיים נורמלית, על ידי שימוש באנטרואידים שמקורם באוכלוסיות החולים הרלוונטיות. מודל זה מאפשר למקסם את איסוף הנתונים מדגימת חולה יחידה, דבר חיוני בהתחשב בזמינות ובגודל המוגבלים של דגימות מעי יילודים.

באמצעות מודל זה נצפו רבים מהשינויים הפיזיולוגיים באפיתל המעי המתרחשים במהלך NEC אצל תינוקות. הוספת המיקרוביום הדיסביוטי מחולה עם NEC חמור הובילה להגברת הרגולציה של ציטוקינים דלקתיים (איור 3), לעלייה בחדירות מחסום המעי על שבב, למוות מוגבר של תאים, לירידה בהתרבות ולאובדן תת-סוגים בוגרים של אפיתל36. לפיכך, מחקרים עתידיים המשתמשים במודל זה יכולים להתמקד בקביעת המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות NEC והתערבויות טיפוליות אפשריות.

ישנן מגבלות מובנות ביישום מודל מורכב כגון NEC-on-a-chip. מערכת זו דורשת ציוד מיוחד, ריאגנטים והכשרה לשימוש בפלטפורמת המיקרופלואידיקה. בנוסף, המודל דורש תשומת לב רבה לפרטים עם הכנה מדויקת של המדיות השונות, זריעה נכונה של השבב, ושמירה על טכניקה סטרילית, להיות קריטי להצלחה. לחוקרים חייבת להיות גם גישה לדגימות מעיים או אנטרואידים מחולים בילודים, אשר בדרך כלל זמינים רק במרכזי טיפול רבעוניים עם מנתחי ילדים, אלא אם כן הושגו באמצעות משתפי פעולה. לבסוף, שילוב של מרכיבים חשובים נוספים בפתופיזיולוגיה של NEC, כגון תאים חיסוניים או היפוקסיה, מגדיל עוד יותר את הקושי של מודל זה אם כי מגביר את הרלוונטיות הפיזיולוגית.

לסיכום, NEC-on-a-chip מהווה התקדמות חשובה בתחום מחקר ה-NEC אשר תשפר את איכות המחקרים המכניסטיים ותקל על בדיקת טיפולים חדשניים עבור NEC. המטרה הסופית של מחקר זה היא לתכנן ולבדוק טיפולים ממוקדים המשפרים את התוצאות עבור תינוקות עם דלקת מעיים ו- NEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים הקשורים לכתב יד זה.

Acknowledgments

כתב יד זה נתמך על ידי R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) ו-R01HD105301 (MG) מהמכונים הלאומיים לבריאות, מענק יוזמת צ'אן צוקרברג 2022-316749 (MG), פרס קריירה מוקדמת של קרן המחקר Thrasher Research Fund (LCF), מענק חוקר קריירה מוקדמת של התפתחות ילדים של UNC (LCF) באמצעות תמיכתם הנדיבה של תורמים לאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, והמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Tags

מודל מיקרופלואידי אנטרוקוליטיס נמקית אנטרואידים במעי ילודים אנושיים מיקרוביום דיסביוטי פתוגנזה מורכבת צמתים הדוקים של המעי חדירות מחסום המעי מוות של תאי אפיתל דיסביוזיס מיקרוביאלי דלקת לא מווסתת מודלים של בעלי חיים קווי תאים אורגנואידים של המעי מודל מבחנה טכנולוגיה מיקרופלואידית NEC-on-a-chip יילוד מוקדם תאי אנדותל אנושיים בדיקות גילוי תרופות
מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter