Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الحقن المجهري للفيروس القهقري RCAS (A) المؤتلف في عدسة الدجاج الجنينية

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65727
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

Summary

تصف ورقة البروتوكول هذه منهجية الحقن المجهري لعدسة الدجاج الجنينية لفيروس RCAS (A) كأداة لدراسة الوظيفة في الموقع والتعبير عن البروتينات أثناء نمو العدسة.

Abstract

الدجاج الجنيني (Gallus domesticus) هو نموذج حيواني راسخ لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف الأعضاء ، نظرا لدرجة تشابهها العالية مع العدسة البشرية. RCAS (A) هو فيروس ارتجاعي دجاج مؤهل للتكاثر يصيب الخلايا المنقسمة ، والذي يعمل كأداة قوية لدراسة التعبير في الموقع ووظيفة البروتينات البرية والطافرة أثناء تطوير العدسة عن طريق الحقن المجهري في التجويف الفارغ لحويصلة العدسة في مراحل النمو المبكرة ، مما يقصر عمله على خلايا العدسة المتكاثرة المحيطة. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى ، مثل النماذج المعدلة وراثيا والثقافات خارج الجسم الحي ، فإن استخدام الفيروس القهقري للطيور RCAS (A) المختص بالتكرار يوفر نظاما فعالا للغاية وسريعا وقابلا للتخصيص للتعبير عن البروتينات الخارجية في أجنة الصيصان. على وجه التحديد ، يمكن أن يقتصر نقل الجينات المستهدف على خلايا ألياف العدسة التكاثرية دون الحاجة إلى محفزات خاصة بالأنسجة. في هذه المقالة ، سنلقي نظرة عامة موجزة على الخطوات اللازمة لإعداد RCAS (A) للفيروس القهقري المؤتلف ، ونقدم نظرة عامة مفصلة وشاملة على إجراء الحقن المجهري ، ونقدم نتائج عينة من التقنية.

Introduction

الهدف من هذا البروتوكول هو وصف منهجية الحقن المجهري لعدسة الدجاج الجنينية ل RCAS (A) (ساركوما الطيور / الفيروس القهقري A المختص بالتكرار). لقد ثبت أن التوصيل الفعال للفيروسات القهقرية في عدسة الدجاج الجنينية أداة واعدة للدراسة في الجسم الحي للآلية الجزيئية ووظيفة بنية بروتينات العدسة في فسيولوجيا العدسة الطبيعية والحالات المرضية والتطور. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج التجريبي لتحديد الأهداف العلاجية وفحص الأدوية لحالات مثل إعتام عدسة العين الخلقي البشري. إجمالا ، يهدف هذا البروتوكول إلى وضع الخطوات اللازمة لتطوير منصة قابلة للتخصيص لدراسة بروتينات العدسة.

الكتاكيت الجنينية (Gallus domesticus) ، بسبب تشابهها في بنية العدسة ووظيفتها مع العدسة البشرية ، هي نموذج حيواني راسخ لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف الأعضاء1،2،3،4. يعتبر استخدام الفيروس القهقري للطيور RCAS (A) المختص بالتكرار نظاما فعالا للغاية وسريعا وقابلا للتخصيص للتعبير عن البروتينات الخارجية في أجنة الصيصان. والجدير بالذكر أن لديها قدرة فريدة على حصر نقل الجينات المستهدفة في خلايا ألياف العدسة التكاثرية دون الحاجة إلى محفزات خاصة بالأنسجة ، باستخدام الإطار الزمني الفريد للتطور الجنيني الذي يسمح فيه وجود تجويف العدسة الفارغ بالحقن المجهري RCAS (A) في الموقع المقيد للتعبير عن البروتينات الخارجية داخل خلايا ألياف العدسة التكاثرية5 ، 6,7,8.

يعتمد إجراء الحقن المجهري لجنين الفرخ ، الموصوف بعمق هنا ، جزئيا في الأصل على عمل Fekete et. al.6 وتطويرها كذلك من قبل جيانغ وآخرون. AL.8 وقد تم استخدامه كوسيلة لإدخال كل من البلازميدات الفيروسية وغير الفيروسية في عدسة الكتاكيت الجنينية1،9،10،11،12،13. بشكل عام ، يوضح العمل السابق إمكانية استخدام هذه المنهجية لدراسة تطور العدسة ، والتمايز ، والاتصال الخلوي ، وتطور المرض ، واكتشاف واختبار الأهداف العلاجية للحالات المرضية للعدسة مثل إعتام عدسة العين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا لقانون رعاية الحيوان واللوائح التنفيذية لرعاية الحيوان وفقا لمبادئ دليل رعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو. للحصول على نظرة عامة على البروتوكول ، انظر الشكل 1 ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تجريبي. 1 . تتمثل الخطوة الأولى للبروتوكول في تحديد بروتين (بروتينات) مستهدف محدد ، وتحديد تسلسل (تسلسلات) الجينات المرتبطة ، وتوليد شظايا الحمض النووي. 2 . استنساخ تسلسل (تسلسلات) الجينات في ناقل فيروسي رجعي عن طريق الاستنساخ الأولي إلى ناقل محول ، 3. يليه ناقل فيروسي . 4 . تحضير جزيئات فيروسية عالية العيار باستخدام خلايا التعبئة والتغليف للحصاد والتركيز. 5 . الخطوة الأخيرة ، ومحور هذا البروتوكول ، هي الحقن المجهري لعدسة الدجاج للجزيئات الفيروسية RCAS (A) في تجويف العدسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تحضير الفيروسات القهقرية المؤتلفة عالية العيار

  1. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لصنع شظايا الحمض النووي للبروتين المستهدف
    ملاحظة: يهدف هذا القسم إلى تضخيم تسلسل الحمض النووي المقابل لبروتين العدسة المستهدف. لمزيد من التفاصيل، انظر 7,8.
    1. تصميم الاشعال ل PCR ، المقابلة للبروتين محل الاهتمام ، لجعل شظايا الحمض النووي مع كربوكسيل تيرميني في الإطار مع أو بدون تسلسل FLAG epitope (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3') ، وكودون توقف ، وموقع إنزيم تقييد (أي EcoRI) موجود داخل منطقة polylinker من CLa12NCO)) وفقا للمواصفات المذكورة في البروتوكولات المنشورة سابقا ، مع تسلسل لإنزيمات التقييد الكافية1 ، 7،8،10،11.
    2. أداء تفاعل PCR10. اجمع بين 100 pmol من الحس ومضاد الإحساس للبادئات المصممة مع 0.5 ميكروغرام من connexin cDNA (مثل Cx50 أو Cx43 أو مجموعات Cx50 * 43L الوهمية) ، إلى المخزن المؤقت لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المفضل. قم بإجراء 30 دورة تتكون كل منها من 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 58 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، متبوعة بتمديد نهائي لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية.
    3. عزل وتنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية الهلام.
    4. هضم منتجات PCR المنقاة باستخدام إنزيمات التقييد المفضلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. استنساخ إدراج الحمض النووي في محول البلازميد
    ملاحظة: إدخال شظايا الحمض النووي في ناقل محول يلغي الحاجة إلى الخلايا / الفيروسات المساعدة لزيادة استقرار ناقل RCAS (A)14. لمزيد من التفاصيل، انظر 7,8.
    1. شظايا الحمض النووي المستنسخة في محول البلازميد ، Cla12NCO باستخدام تفاعل ربط النهاية اللزجة. امزج شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل مع إنزيمات القطع و Cla12NCO بنسبة 2-5: 1. إجراء الربط وتحويل الحمض النووي باستخدام الخلايا المختصة.
    2. عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي.
    3. تسلسل الحمض النووي لضمان الدقة.
  3. الاستنساخ في الناقل الفيروسي RCAS (A)
    ملاحظة: يتم إدخال شظايا الحمض النووي في مركبة (RCAS (A) retrovirus) من أجل النقل المستقر للجين إلى الخلايا في جنين الفرخالنامي 14,15. لمزيد من التفاصيل ، انظر7،8،15.
    1. هضم جزء Cla12NCO-DNA من المتجه المحتوي على الفائدة باستخدام ClaI (وحدة واحدة لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي) وعزل الأجزاء الهلامية.
    2. قم باستنساخ شظايا الحمض النووي إلى بلازميد RCAS (A) خطي ClaI. استخدم إنزيم القطع SalI لتمييز موقع ClaI على بلازميد RCAS (A).
    3. تأكيد الاتجاه الصحيح للشظايا المدرجة على التركيبات عن طريق الهضم باستخدام إنزيمات تقييد ClaI و SalI.
    4. عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي.
    5. تحديد تركيز الحمض النووي (DNA).
  4. نقل خلايا الخلايا الليفية الجنينية للكتاكيت (CEF) وحصاد RCAS (A)
    ملاحظة: تستخدم خلايا تغليف الفيروسات ، CEFs ، للحصول على / حصاد وسائط زراعة الخلايا التي تحتوي على جزيئات فيروسية15,16. لمزيد من التفاصيل ، انظر7،8،15.
    1. نقل خلايا CEF مع تركيبات الحمض النووي الفيروسي القهقري المؤتلف باستخدام عامل النقل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. أداء النشاف الغربي للخلايا المنقولة لفحص تعبيرها عن البروتين محل الاهتمام.
    3. عندما تصل الخلايا المنقولة إلى نقطة التقاء ، ابدأ في جمع الوسط الطافي ، ومعالجته / ترشيحه بشكل مناسب (لإزالة أي حطام خلوي باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر) ، وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للتركيز.
  5. تركيز ومعايرة المخزونات الفيروسية
    ملاحظة: يجب تصفية الحبيبات والكميات الكبيرة من الوسائط المشتقة من الخلايا التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء فحص عيار فيروسي لتحديد قوة الفيروس ضد الخلايا المضيفة. لمزيد من التفاصيل ، انظر6،7،8،15.
    1. قم بإذابة وسائط الثقافة التي تحتوي على الفيروسات.
    2. قم بتدوير وسائط الاستزراع عند 72000 × جم لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    3. صب المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات الفيروسية بالوسط المتبقي (~ 50 ميكرولتر) وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام ، في ~ 10 ميكرولتر من المخزون الفيروسي.
    4. للمعايرة ، باستخدام خلايا QT-6 أو CEF ، قم بنقل الخلايا بتخفيف تسلسلي للمخزون الفيروسي.
    5. بعد التقاء ، إصلاح الخلايا باستخدام 4 ٪ الفورمالديهايد.
    6. Immunostain لبروتينات هفوة الفيروسية أو عملية الفوسفاتيز القلوي نسيجيكيميائيا للحصول على عيار ، يعرف بأنه (وحدات تشكيل مستعمرة) CFU لكل مليلتر (CFU / mL).

Figure 2
الشكل 2: الأدوات والإعداد للحقن المجهري لعدسة الفرخ . (أ) مجتذب ماصة ميكروماصة عمودية عمودية P-30. (1) ملحق داخلي يظهر ماصة زجاجية يتم سحبها. ب: (2) حاضنة البيض. احتضان بيضة الدجاج لمدة ~ 65-68 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية للوصول إلى المرحلة 18 (مع تجويف مركزي مغلق وفارغ) لحقن الفيروس القهقري. (ج) إعداد الحقن المجهري. (3) معدات الإضاءة ، (4) Pico-Injector ، (5) مجهر تشريح ، (6) Drummond micromanipulator ، (7) كمبيوتر / كاميرا للتصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الحقن المجهري لعدسة الفرخ

  1. إعداد اللوازم
    1. تحضير الماصات الزجاجية الدقيقة للحقن المجهري17
      ملاحظة: تستخدم الشعيرات الدموية الزجاجية لصنع ماصات زجاجية دقيقة بنقطة طرف وقطر خارجي (OD) ~ 11 ميكرومتر للحقن المجهري. يظهر الإعداد في الشكل 2 أ.
      1. قم بتوصيل الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات بالمشابك المبطنة بالمطاط في مجتذب الماصة العمودي اليدوي.
      2. اضبط درجة حرارة الحرارة (HEAT 1) على 950 درجة مئوية وقم بإجراء السحب المسبق للحصول على شعيرات زجاجية أرق وأكثر نعومة.
      3. اضبط درجة حرارة الحرارة (HEAT 2) على 790 درجة مئوية وقم بإجراء سحب ثانوي لإنتاج ماصات دقيقة نهائية.
      4. باستخدام مطحنة micropipette ، شحذ فتحة الطرف إلى OD ~ 11 ميكرومتر.
      5. للتجارب المستقبلية ، احتفظ بالماصات الزجاجية الدقيقة في وسادة تثبيت إسفنجية داخل وعاء زجاجي.
    2. حضانة البويضات المخصبة حتى مرحلة التطوير 18
      ملاحظة: أثناء تطوير العدسة ، عند ~ 65-68 ساعة من التطور الجنيني ، تنفصل العدسة عن الأديم الظاهر وتشكل حويصلة محكمة الغلق ذات تجويف مركزي ؛ الحقن في هذا التجويف العدسة الفارغ يستعد للتعبير المقيد لخلايا العدسة التكاثرية7،8،18.
      1. احتضان بيض الدجاج المخصب لمدة ~ 65-68 ساعة في حاضنة هزازة مرطبة 37 درجة مئوية (الشكل 2 ب).
  2. فتح بيضة الدجاج
    ملاحظة: تصف هذه الخطوة تحديد الجنين وتعرضه للحقن المجهري. لمزيد من التفاصيل، انظر 7,8.
    1. امسح منطقة العمل جيدا باستخدام 70٪ إيثانول.
    2. أخرج البيض من الحاضنة ، ورشه بشدة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واتركه يجف في الهواء.
    3. ضع البيضة ، بحيث يكون الطرف الأكبر من البيضة متجها لأعلى ، على حامل البيض.
    4. باستخدام زوج من الملقط ذو الأسنان الحادة ، قم بإنتاج ثقب قطره ~ 2 سم على الطرف الأكبر من البيضة عن طريق النقر بعناية على قشر البيض وإزالة شظايا قشر البيض (الشكل 3 أ).
    5. باستخدام مجهر تشريح ، حدد موقع الجنين.
    6. بمجرد تحديد موقع الجنين وعدسة الفرخ ، استخدم مجهر التشريح والملقط والمقص الدقيق لقطع الغشاء الأمنيوسي الذي يغطي الجزء العلوي من الجنين على الفور (الشكل 3 ب).
      ملاحظة: لا تقطع على نطاق واسع (يكفي فقط لفضح الجنين ~ 0.5 سم × 0.5 سم) ، وإلا فقد تغرق الأجنة في كتلة صفار البيض ؛ تجنب أيضا لمس الأوعية الدموية ، إن أمكن.
    7. غطي فتحة البيضة بطبق بتري 60 مم استعدادا للخطوات التالية.
  3. الحقن المجهري للمخزون الفيروسي المركز
    ملاحظة: يتم إدخال الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على شظايا الحمض النووي للبروتين المستهدف للتنبيغ في الخلايا داخل تجويف العدسة. يظهر الإعداد في الشكل 2C. لمزيد من التفاصيل ، انظر6،7،8.
    1. ذوبان مخزون الأسهم الفيروسية على الجليد.
    2. لتصور المخزون الفيروسي أثناء الحقن ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من 10x أخضر سريع في قنينة واحدة من المخزون الفيروسي تحتوي على 10 ميكرولتر.
    3. لضمان عدم وجود قطع كبيرة من المواد غير المذابة التي يمكن أن تسد الماصة الزجاجية الدقيقة ، قم بطرد المحاليل لمدة 10 ثوان عند 10000 × جم عند 4 درجات مئوية لحبيبات "قطع كبيرة" ونقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة ، كل ذلك مع الحفاظ على المحاليل على الجليد.
    4. على طبق استزراع 35 مم × 10 مم ، ضع بارافيلم مختبري ممتد وأضف 1 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم (PBS) أعلى الفيلم (غير معقم ، مع اعتبار الجانب المغطى "نظيفا").
    5. قم بتوصيل ماصة زجاجية معدة بحاقن بيكو أوتوماتيكي.
    6. اضغط على وضع التعبئة لملء المحلول الملحي المعقم (PBS) في ماصة زجاجية دقيقة ، ثم استخدم وضع الحقن لاختبار 1 ميكرولتر المخصصة من السائل.
    7. ضع بارافيلم مختبري ممتد ثان على سطح طبق زراعة خلايا جديد مقاس 35 مم × 10 مم وأضف 1 ميكرولتر من المخزون الفيروسي سريع اللون باللون الأخضر فوق الفيلم.
    8. اخفض طرف الماصة الدقيقة في المخزون الفيروسي واضغط على نموذج التعبئة لملء الماصة الزجاجية الدقيقة ب ~ 1 ميكرولتر من المخزون الفيروسي.
      ملاحظة: لتجنب الجفاف ، ضع طرف الماصة المملوءة في محلول ملحي معقم (PBS) كلما كان هناك توقف مؤقت في الإجراء.
    9. قم بخفض الماصة الزجاجية المملوءة ، المتصلة بحاقن أوتوماتيكي ، في المنطقة المستهدفة من تجويف عدسة الجنين بمساعدة مجهر تشريح.
    10. اضبط مصدر الضوء لضمان رؤية واضحة لمخطط حويصلة العدسة.
      ملاحظة: عادة ما يستخدم تجويف العدسة اليمنى (متجها لأعلى) للحقن ويتم الحفاظ على اليسار (متجها لأسفل) سليما كعنصر تحكم مقابل.
    11. بمجرد التأكد من أن موضع الماصة الدقيقة يقع في الموقع الصحيح داخل تجويف العدسة ، قم بحقن 5-40 nL من المخزون الفيروسي (الشكل 3C).
      ملاحظة: الممارسة ضرورية جدا لوضع الحقن الأمثل.
    12. انتظر ~ 45 ثانية ثم قم بإزالة الماصة الزجاجية برفق.
    13. تحقق من نجاح الحقن المجهري في تجويف العدسة باستخدام مجهر التشريح من خلال فحص صبغة Fast Green التي يجب أن تبقى في التجويف الفارغ للعدسة دون أي تسرب.
    14. بعد إجراء الحقن ، أغلق فتحة قشر البيض بشريط سكوتش.
    15. أعد الجنين إلى الحاضنة المرطبة 37 درجة مئوية ، دون أي حركة دوارة ، حتى يتم الوصول إلى العمر الجنيني المطلوب لتشريح العدسة.

Figure 3
الشكل 3: إعداد كتكوت الحقن الدقيق والتخطيطي. أ: فتح بيضة دجاج. ب: قطع الغشاء السلوي. (ج) الحقن المجهري لعدسة الدجاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد تحديد بروتين (بروتينات) مستهدف محدد وتحديد تسلسل (تسلسلات) الجينات المرتبطة به ، يتضمن النهج التجريبي الشامل استنساخ تسلسل (تسلسلات) الجينات في ناقل RCAS (A) للفيروسات القهقرية عن طريق الاستنساخ الأولي إلى ناقل محول ، يليه ناقل فيروسي. ثانيا ، يتم تحضير الجسيمات الفيروسية عالية العيار باستخدام خلايا التعبئة لحصاد وتركيز الفيروسات. تم وصف هاتين الخطوتين الرئيسيتين الأوليين إلى حد كبير وعرض النتائج التمثيلية في مكان آخر6،7،8،14،16.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، فإن مجال التركيز الرئيسي هو خطوة الحقن المجهري. من الضروري تحديد نجاح الحقن المجهري في الموقع للجسيمات الفيروسية RCAS (A) التي تحتوي على شظايا الحمض النووي للبروتين المستهدف محل الاهتمام ، سواء في وقت الحقن أو بعد عزل العدسة. يوضح الشكل 4 صورة لتجويف العدسة قبل وبعد الحقن للنواقل الفيروسية المصبوغة باللون الأخضر السريع للتصور وتأكيد التوطين المناسب في تجويف العدسة. Fast Green هي صبغة ذات درجة عالية من الأمان ومعتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية كمادة مضافة للون تستخدم لتلوين الأطعمة والأدوية ومستحضرات التجميل19.

يوضح الشكل 5 التقييم النسيجي من خلال التألق المناعي للبروتين المستهدف ، connexin الخيمري Cx50 * 43L ، والذي تم إدخاله في الفيروسات القهقرية المؤتلفة عالية العيار ، وحقنه الدقيق في تجويف العدسة وتقييمه. نظرا لأن C-termini للمتصلات الخيمرية كانت موسومة بتسلسلات FLAG ، فقد تم استخدام العلامات المضادة للعلم لتحديد الوصلات الخارجية من تلك الداخلية ، باستخدام منهجية التلوين القياسية ، مع المقاطع السهمية والإكليلية (السهمي الموضح هنا) ، كما هو موضح في Liu et al.10 على الرغم من أن Cx50 * 43L موضعي على غشاء البلازما ، بسبب اتجاه أقسام الأنسجة المحضرة ، يبدو أنه يتوضع داخل العدسة في مناطق معينة. في هذه الدراسة ، تم تقييم التفاعل بين مجال الحلقة بين الخلايا ل Cx50 و AQP0 وتلطيخه وفقا لذلك10.

Figure 4
الشكل 4: مثال على الحقن المجهري في تجويف عدسة الدجاج. أ: الحقن المسبق في تجويف العدسة. ب: بعد الحقن في تجويف العدسة. السهم = موقع الحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الحقن المجهري والتقييم النسيجي. في المرحلة 18 من التطور الجنيني ، والتي هي ~ 65-68 ساعة من التطور الجنيني ، تم إجراء حقن دقيق للفيروسات القهقرية المؤتلفة التي تحتوي على متحولة Cx50 * 43L الوهمية في التجويف الفارغ لعدسة الفرخ. قمنا بفحص عمليات التشريح المبردة لعدسات الكتاكيت التي تم تشريحها في اليوم الجنيني 18 ، والتي تم تصنيفها مناعيا بأجسام مضادة FLAG (خضراء) و AQP0 (حمراء). تم استخدام IgG المضاد للفأر المترافق بالفلوريسئين للكشف عن الأجسام المضادة الأولية ضد مضاد FLAG ، بينما تم استخدام IgG المضاد للأرانب المترافق بالرودامين للكشف عن الأجسام المضادة الأولية ضد مضاد AQP0. تم إجراء تصور للتلطيخ المناعي باستخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر. يمكن رؤية الصور المدمجة المقابلة ، المسماة "مدمجة" ، على اليمين. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا النموذج التجريبي الفرصة للتعبير عن البروتين (البروتينات) ذات الأهمية في العدسة السليمة مما يؤدي إلى دراسة الأهمية الوظيفية لهذه البروتينات في بنية العدسة ووظيفتها. يعتمد نموذج الحقن المجهري للفرخ الجنيني جزئيا على عمل Fekete et. al.6 وتم تطويره بواسطة Jiang et. al.8 وقد تم استخدامه كوسيلة لإدخال كل من البلازميدات الفيروسية والعوامل مثل المنبهات والحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) والببتيدات في عدسة الكتاكيت1،9،10،11،12،13. هذه المنصة مثالية للتحقيق في الآليات التي تؤدي إلى تطور المرض إلى جانب اختبار أهداف الأدوية المحتملة للحالات المرضية للعدسات مثل إعتام عدسة العين الخلقي. مع تحسن فهمنا للحالات المرضية للعدسة وتحديد الطفرات الجينية أو المكتسبة ، يسمح هذا النموذج الحيواني الفعال من حيث التكلفة بدراسة الآليات الأساسية المحيطة بتطور هذه الحالات أو نتائج الطفرات ، والتي يمكن أن تساعد في تلبية الحاجة الطبية الكبيرة لأنظمة العلاج غير الجراحية والموثوقة لحالاتالعدسة 1. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا النظام نظاما في الجسم الحي لتوصيف البروتينات من النوع البري والمتحور فيما يتعلق بتجميع البروتين وتجميعه ، كما هو موضح مؤخرا1،11. يمكن تطبيق هذا النموذج للاستخدام على نطاق واسع خارج العدسة.

RCAS (A) هو فيروس ارتجاعي للطيور8 مؤهل للتكرار. يعتبر استخدامه ، بالاشتراك مع عدسة الدجاج الجنينية (نموذج حيواني راسخ لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف الأعضاء1،2،3،4) ، وسيلة فريدة وفعالة للتعبير عن البروتينات الخارجية في أجنة الفرخ. بالنظر إلى الجدول الزمني الفريد لنمو الفرخ الجنيني وهيكله ، مع العدسة ، في مرحلة التطوير 18 (~ 65-68 ساعة التطور الجنيني) ، تنفصل عن الأديم الظاهر وتشكل حويصلة محكمة الغلق ذات تجويف مركزي ، فإن هذا يهيئ للحقن المجهري في تجويف العدسة الفارغ هذا لتقييد التعبير لخلايا العدسة التكاثرية7،8،18. على الرغم من أنه في الغالب قوة لغرضنا ، إلا أنه يمثل أيضا قيدا ملحوظا نظرا لطبيعة الحقن بالفيروسات القهقرية ، يتم تغيير الخلايا التكاثرية فقط من خلال هذه المنهجية. إن النقل (الحقن) بواسطة الفيروسات القهقرية ليس تعبيرا عابرا ويتم دمج الجينات الخارجية في الجينوم. نهج توصيل الجينات هذا فعال للغاية وتظهر البيانات السابقة أن جميع الخلايا التكاثرية تقريبا يمكن أن تصاببالعدوى 8,10. والجدير بالذكر أن دراساتنا السابقة أظهرت أن الحقن المجهري وحده لا يسبب ضررا واضحا للعدسة كما هو محدد من خلال مورفولوجيا العدسة وعدم تكوين إعتام عدسة العين عند نقطة الحقن1.

على عكس هذا النهج ، يمكن استخدام الأساليب في المختبر باستخدام خلايا العدسة المستزرعة ، ولكنها تقتصر على تلخيص المراحل المبكرة من تطوير ألياف العدسة20،21،22،23،24. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام أنظمة زراعة العدسات خارج الجسم الحي على نطاق واسع كوسيلة لدراسة تمايز العدسة وإعتام عدسة العين25,26. هذا النموذج وثقافات كبسولة العدسة ذات الصلة27 ، على الرغم من قوتها ، هي نماذج ثقافة مبسطة ، لها قيود وتعقيدات اعتمادا على تطبيقهاالمقصود 24,26. كان لاستخدام الأساليب المعدلة وراثيا في عدسة الفئران أو الدجاج قيود مختلفة ، حيث لا تشترك عدسة الفئران في أوجه تشابه كبيرة مع العدسة البشرية1،2،3،4 ، وكان لعدسات الدجاج قيود في الكفاءة والاستقرار28.

عند تنفيذ البروتوكول ، يجب توخي الحذر الشديد لضمان التضخيم الكافي لشظايا الحمض النووي ، ومعايرة الفيروسات القهقرية ، والنقل ، والتحضير المعقم للمخزونات الفيروسية لأن التلوث البكتيري والخميرة في الحقن المجهري يمكن أن يسبب الفتك لأجنة الكتاكيت7. بالنسبة للحقن المجهري نفسه ، تتمثل الخطوات الحاسمة في التوطين الصحيح لجنين الفرخ والعدسة جنبا إلى جنب مع وضع الماصة الدقيقة في تجويف العدسة ويجب إيلاء اهتمام دقيق لعدم ملء كبسولة العدسة أثناء الحقن. بشكل عام ، يجب أن تتم الممارسة مع تدوين دقيق للمواقع التشريحية ويجب تحضير البيض الإضافي للتجربة لحساب الخطأ. يجب ملاحظة الحالات الشاذة أثناء عملية الحقن المجهري ، مثل التمزق العرضي للأوعية الدموية ، وتجنب استخدام تلك الأجنة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مراعاة قيود نظام RCAS للفيروسات القهقرية ، مثل قدرته على إنشاء تعبير خارج الرحم لجين خارج نافذة أو موقع محدد ، وعدم سهولة تنظيم مستوى التعبير ، وأخيرا ، هناك قيود على حجم الإدراج ، خاصة >2 كيلو بايت15,29. وأخيرا، ينبغي توخي الحذر في اختيار النقطة الزمنية للتقييم. في هذه التجربة ، اخترنا ما يصل إلى اليوم الجنيني 18 الذي يقترب من فقس البيض ، لتحديد التأثير الكلي للتعبير الجيني الخارجي على العدسة السليمة. بعد الحقن ، يكون معدل الفقس منخفضا جدا ولا تستطيع معظم الأجنة البقاء على قيد الحياة بسبب اضطراب غشاء vitelline.

في الختام ، يقدم استخدام نموذج الحقن المجهري لعدسة الدجاج RCAS (A) نظاما فعالا للغاية وسريعا وقابلا للتخصيص للتعبير عن البروتينات الخارجية للسماح بتصميم البروتينات والتعبير عنها لمعالجة وظيفتها في فسيولوجيا العدسة وتطورها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH): RO1 EY012085 (إلى JXJ) و F32DK134051 (إلى F.M.A) ، ومنحة مؤسسة ويلش: AQ-1507 (إلى JXJ). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم إنشاء الأرقام جزئيا باستخدام Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Filter Corning 431118 For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish FisherScientific 50-202-030 For using during microinjection
Centrifuge Fisherbrand 13-100-676 Spinning down solution
Constructs GENEWIZ - For generation of constructs
Dissecting microscope AmScope SM-4TZ-144A Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers Integrated DNA Technologies - Generation of primers:

Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-50WY Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen For cell culture
Egg Holder - - Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator GQF Manufacturing Company Inc. 1502 For incubation of fertilized eggs
Fast Green Fisher scientific F99-10 For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs Texas A&M University N/A Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone Laboratories For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-095-003 For anti-FLAG  1:500
Forceps FisherScientific 22-327379 For moving things around and isolation
Glass capillaries Sutter Instruments B100-75-10 Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine Invitrogen L3000001 For transfection
Manual vertical micropipette puller Sutter Instruments P-30 To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes FisherScientific 02-682-004 Dissolving solution
Microscope Keyence BZ-X710 For imaging staining
Parafilm FisherScientific 03-448-254 Placing solution
Penicillin/Streptomycin Invitrogen For cell culture
Pico-Injector Harvard Apparatus PLI-100 For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0 Self generated - Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody Rockland Immunichemicals 600-401-383 For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch 111-295-003 For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad Sutter Instruments BX10 For storage of glass micropipette

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
  2. Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
  3. Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
  4. McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
  5. Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
  6. Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
  7. Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
  8. Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
  9. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
  10. Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
  11. Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
  12. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
  13. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
  14. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  15. Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
  16. Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
  17. Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  19. Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
  20. Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
  21. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
  23. Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
  24. Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
  25. West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
  26. Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
  27. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
  28. Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
  29. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).

Tags

الحقن المجهري ، الفيروس القهقري RCAS (A) المؤتلف ، الدجاج الجنيني ، تطوير العدسة ، علم وظائف الأعضاء ، النموذج الحيواني ، التعبير في الموقع ، البروتينات الطافرة ، مراحل النمو المبكرة ، حويصلة العدسة ، خلايا العدسة المتكاثرة ، النماذج المعدلة وراثيا ، مزارع خارج الجسم الحي ، الفيروس القهقري للطيور ، نقل الجينات المستهدفة ، خلايا ألياف العدسة التكاثرية
الحقن المجهري للفيروس القهقري RCAS (A) المؤتلف في عدسة الدجاج الجنينية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Acosta, F. M., Ma, B., Gu, S.,… More

Acosta, F. M., Ma, B., Gu, S., Jiang, J. X. Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens. J. Vis. Exp. (199), e65727, doi:10.3791/65727 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter