Summary
В данном протокольном документе описывается методология микроинъекции ретровируса RCAS(A) в эмбриональный хрусталик курицы в качестве инструмента для изучения функции in situ и экспрессии белков во время развития хрусталика.
Abstract
Эмбрион курицы (Gallus domesticus) является хорошо зарекомендовавшей себя животной моделью для изучения развития и физиологии хрусталика, учитывая его высокую степень сходства с человеческим хрусталиком. RCAS(A) — это ретровирус курицы, способный к репликации, который инфицирует делящиеся клетки, что служит мощным инструментом для изучения in situ экспрессии и функции белков дикого типа и мутантных белков во время развития хрусталика путем микроинъекции в пустой просвет везикулы хрусталика на ранних стадиях развития, ограничивая его действие окружающими пролиферирующими клетками хрусталика. По сравнению с другими подходами, такими как трансгенные модели и культуры ex vivo , использование RCAS(A), компетентного к репликации, представляет собой высокоэффективную, быструю и настраиваемую систему экспрессии экзогенных белков в эмбрионах цыплят. В частности, таргетный перенос генов может быть ограничен пролиферативными клетками волокон хрусталика без необходимости использования тканеспецифичных промоторов. В этой статье мы кратко рассмотрим этапы, необходимые для получения рекомбинантного ретровируса RCAS(A), предоставим подробный, всесторонний обзор процедуры микроинъекций и предоставим образцы результатов методики.
Introduction
Целью данного протокола является описание методологии микроинъекции хрусталика эмбриона цыпленка RCAS(A) (репликационно-компетентный ретровирус саркомы птицы/лейкоза А). Было продемонстрировано, что эффективная ретровирусная доставка в хрусталик эмбриона курицы является многообещающим инструментом для изучения in vivo молекулярного механизма и структурно-функциональной функции белков хрусталика при нормальной физиологии хрусталика, патологических состояниях и развитии. Кроме того, эта экспериментальная модель может быть использована для идентификации терапевтических мишеней и скрининга лекарств при таких состояниях, как врожденная катаракта человека. В целом, этот протокол направлен на то, чтобы изложить необходимые шаги для разработки настраиваемой платформы для изучения белков хрусталика.
Эмбриональные цыплята (Gallus domesticus), благодаря их сходству в строении и функциях хрусталика с человеческим, являются хорошо зарекомендовавшей себя животной моделью для изучения развития и физиологии хрусталика 1,2,3,4. Использование репликаторно-компетентного ретровируса птиц RCAS(A) было расценено как высокоэффективная, быстрая и настраиваемая система для экспрессии экзогенных белков в эмбрионах цыплят. Примечательно, что он обладает уникальной способностью ограничивать перенос гена-мишени на пролиферативные клетки волокон хрусталика без необходимости использования тканеспецифических промоторов, используя уникальные временные рамки эмбрионального развития, в которых наличие пустого просвета хрусталика позволяет in situ микроинъекцию RCAS(A) в ограниченный участок для экспрессии экзогенных белков в клетках пролиферативных волокон хрусталика5, 6,7,8.
Процедура микроинъекции эмбриона цыпленка, подробно описанная здесь, первоначально частично основана на работе Fekete et. al.6 и далее развиты Jiang et. al.8 и был использован в качестве средства введения как вирусных, так и невирусных плазмид в хрусталик эмбриональных цыплят 1,9,10,11,12,13. В целом, предыдущая работа демонстрирует потенциал использования этой методологии для изучения развития хрусталика, дифференцировки, клеточной коммуникации и прогрессирования заболевания, а также для обнаружения и тестирования терапевтических мишеней для лечения патологических состояний хрусталика, таких как катаракта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в соответствии с Законом о благополучии животных и Положением о защите животных в соответствии с принципами Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию. Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Научном центре здоровья Техасского университета в Сан-Антонио. Обзор протокола см. на рисунке 1; см. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе.
Рисунок 1: Схема эксперимента. 1 . Первым этапом протокола является определение специфического белка(ов-мишеней), идентификация ассоциированной последовательности (последовательностей) генов и генерация фрагментов ДНК. 2 . Клонирование последовательности (последовательностей) гена в ретровирусный вектор путем первоначального клонирования в адапторный вектор с последующим вирусным вектором. 4 . Подготовка высокотитровых вирусных частиц с использованием упаковочных ячеек для сбора и концентрирования. 5 . Заключительным этапом и фокусом этого протокола является микроинъекция вирусных частиц RCAS(A) в просвет хрусталика курицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
1. Получение высокотитровых рекомбинантных ретровирусов
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для получения фрагментов ДНК белка-мишени
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел направлен на амплификацию последовательности ДНК, соответствующей белку-мишени хрусталика. Подробнее см. 7,8.- Разработка праймеров для ПЦР, соответствующих интересующему белку, для получения фрагментов ДНК с их карбоксильными концами в рамке с эпитопной последовательностью FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), стоп-кодоном и сайтом фермента рестрикции (т.е. EcoRI), присутствующим внутри полилинкерной области CLa12NCO)) в соответствии со спецификациями, указанными в ранее опубликованных протоколах, с последовательностями для адекватных ферментов рестрикции1, 7,8,10,11.
- Провести реакцию ПЦР10. Соедините 100 пмоль смысловых и антисмысловых частиц разработанных праймеров с 0,5 мкг коннексиновой кДНК (например, Cx50, Cx43 или химерных комбинаций Cx50*43L) в выбранный буфер реакции ПЦР. Выполните 30 циклов, каждый из которых состоит из 94 °C в течение 1 мин, 58 °C в течение 1 мин и 72 °C в течение 1 мин с последующим окончательным расширением в течение 10 минут при 72 °C.
- Изолируйте и очищайте продукты ПЦР с помощью набора для очистки геля.
- Расщепляют очищенные продукты ПЦР с использованием ферментов рестрикции по выбору в соответствии с инструкциями производителя.
- Клонирование вставок ДНК в адапторную плазмиду
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставка фрагментов ДНК в адапторный вектор устраняет необходимость в клетках-хелперах/вирусах для повышения стабильности вектора RCAS(A)14. Подробнее см. 7,8.- Субклонирование фрагментов ДНК в адаптерную плазмиду Cla12NCO с использованием реакции лигирования липким концом. Фрагменты ПЦР смешивают с ферментами рестрикции и Cla12NCO в соотношении 2-5:1. Провести лигирование и трансформацию ДНК с использованием компетентных клеток.
- Выделите ДНК с помощью набора для выделения ДНК.
- Секвенирование ДНК для обеспечения точности.
- Клонирование в вирусный вектор RCAS(A)
ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты ДНК вставляются в транспортное средство (ретровирус RCAS(A)) для стабильной трансдукции гена в клетки развивающегося эмбриона цыпленка14,15. Подробнее см. 7,8,15.- Расщепляют фрагмент Cla12NCO-ДНК интересующего вектора с помощью ClaI (1 единица на 1 мкг ДНК) и изолируют фрагменты гелем.
- Субклонирование фрагментов ДНК в ClaI-линеаризованную плазмиду RCAS(A). Используйте фермент рестрикции SalI, чтобы различить сайт ClaI на плазмиде RCAS(A).
- Подтверждение правильности ориентации вставленных фрагментов на конструкциях путем расщепления ферментами рестрикции ClaI и SalI.
- Выделите ДНК с помощью набора для выделения ДНК.
- Определите концентрацию ДНК.
- Трансфекция клеток эмбриональных фибробластов (CEF) цыплят и забор RCAS(A)
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки упаковки вирусов, CEF, используются для получения/сбора питательных сред клеток, содержащих вирусные частицы15,16. Подробнее см. 7,8,15.- Трансфектировать клетки CEF рекомбинантными ретровирусными ДНК-конструкциями с помощью трансфекционного агента в соответствии с инструкцией производителя.
- Проведите вестерн-блоттинг трансфицированных клеток, чтобы изучить их экспрессию интересующего белка.
- Когда трансфицированные клетки достигают слияния, начинают собирать надосадочную среду, обрабатывают/фильтруют ее соответствующим образом (для удаления клеточного мусора с помощью фильтра 0,22 мкм) и хранят при -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к концентрированию.
- Концентрация и титрование вирусных запасов
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы и большие объемы среды, полученные из клеток, содержащих вирусные частицы, должны быть отфильтрованы. Кроме того, необходимо провести анализ на титр вируса, чтобы установить силу вируса по отношению к клеткам хозяина. Подробнее см. 6,7,8,15.- Разморозьте питательные среды, содержащие вирионы.
- Отжим питательные среды при 72 000 × г в течение 2 ч при 4 °C.
- Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте вирусную гранулу с остаточной средой (~50 мкл) и храните при -80 °C до использования в вирусных запасах ~10 мкл.
- Для титрования, используя клетки QT-6 или CEF, трансфицируют клетки последовательным разведением вирусных запасов.
- После слияния зафиксируйте ячейки с помощью 4% формальдегида.
- Иммуноокрашивание для вирусных gag-белков или гистохимический процесс для щелочной фосфатазы для получения титра, определяемого как (колониеобразующие единицы) КОЕ на миллилитр (КОЕ/мл).
Рисунок 2: Инструменты и оборудование для микроинъекций хрусталика цыплят . (A) Ручной вертикальный съемник микроэлектродов для микропипеток P-30. (1) Врезка, показывающая вытягивание стеклянной микропипетки. (B) (2) Инкубатор для яиц. Инкубируйте куриное яйцо в течение ~65-68 ч в инкубаторе при температуре 37 °C до достижения стадии 18 (с герметичным, пустым центральным просветом) для инъекции ретровируса. (C) Установка микровпрыска. (3) осветительное оборудование, (4) пикоинжектор, (5) препарирующий микроскоп, (6) микроманипулятор Драммонда, (7) компьютер/камера для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
2. Микроинъекция хрусталика цыпленка
- Подготовка расходных материалов
- Подготовка стеклянных микропипеток к микроинъекциям17
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные капилляры используются для изготовления стеклянных микропипеток с наконечником и наружным диаметром (OD) ~11 мкм для микроинъекций. Настройка показана на рисунке 2A.- Прикрепите капилляр боросиликатного стекла к резиновым амортизирующим зажимам в ручном вертикальном съемнике для микропипеток.
- Установите температуру нагрева (HEAT 1) на 950 °C и выполните предварительную вытягивание, чтобы получить более тонкий и мягкий стеклянный капилляр.
- Установите температуру нагрева (HEAT 2) на 790 °C и выполните вторичное вытягивание, чтобы получить окончательные микропипетки.
- С помощью шлифовальной машины для микропипеток заточите отверстие наконечника до наружного диаметра ~11 мкм.
- Для будущих экспериментов храните стеклянные микропипетки в губчатой зажимной подушечке внутри стеклянной банки.
- Инкубация оплодотворенных яиц до стадии развития 18
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время развития хрусталика, на ~65-68 ч эмбрионального развития, хрусталик отделяется от эктодермы и образует герметичный везикулу с центральным просветом; Инъекция в этот пустой просвет хрусталика для ограниченной экспрессии пролиферативных клеток хрусталика 7,8,18.- Инкубируют оплодотворенные куриные яйца в течение ~65-68 ч в увлажненном инкубаторе-качающемся с температурой 37 °C (рис. 2B).
- Подготовка стеклянных микропипеток к микроинъекциям17
- Вскрытие куриного яйца
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается идентификация и экспозиция эмбриона для микроинъекции. Подробнее см. 7,8.- Тщательно протрите рабочую зону 70% этиловым спиртом.
- Выньте яйца из инкубатора, обильно опрыскайте их 70% этиловым спиртом и дайте им высохнуть на воздухе.
- Поместите яйцо большим концом вверх на держатель для яиц.
- Используя пару щипцов с острыми зубьями, сделайте отверстие диаметром ~2 см на большем конце яйца, осторожно постукивая по яичной скорлупе и удаляя фрагменты яичной скорлупы (Рисунок 3A).
- С помощью препарирующего микроскопа найдите эмбрион.
- После того, как эмбрион и хрусталик цыпленка будут найдены, используйте препарирующий микроскоп и тонкие препарирующие щипцы и ножницы, чтобы отрезать амнионную оболочку, непосредственно покрывающую верхнюю часть эмбриона (Рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не разрезайте слишком широко (ровно настолько, чтобы обнажить зародыш ~0,5 см x 0,5 см), иначе эмбрионы могут погрузиться в желточную массу; Также по возможности избегайте прикосновения к кровеносным сосудам. - Накройте отверстие яйца чашкой Петри диаметром 60 мм, готовясь к следующим шагам.
- Микроинъекция концентрированного вирусного материала
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные частицы, содержащие фрагменты ДНК белка-мишени для трансдукции, вводятся в клетки внутри просвета хрусталика. Настройка показана на рисунке 2C. Подробнее см. 6,7,8.- Разморозьте вирусные запасы на льду.
- Для визуализации вирусного запаса во время инъекции разведите 1 мкл 10x Fast green в одном флаконе вирусного запаса, содержащем 10 мкл.
- Чтобы убедиться в отсутствии больших кусков нерастворенного материала, которые могут засорить стеклянную микропипетку, центрифугируйте растворы в течение 10 с при 10 000 × g при 4 °C, чтобы гранулировать «большие куски», и переложите надосадочную жидкость в новые пробирки, сохраняя растворы на льду.
- На чашку для культивирования размером 35 мм x 10 мм поместите растянутую лабораторную парапленку и добавьте 1 мкл стерильного физиологического раствора (PBS) поверх пленки (нестерилизованной, с закрытой стороной, считающейся «чистой»).
- Подсоедините подготовленную стеклянную микропипетку к автоматическому пико-инъектору.
- Нажмите режим заполнения , чтобы наполнить стерильный физиологический раствор (PBS) в стеклянную микропипетку, а затем используйте режим инъекции для тестирования выделенного 1 мкл жидкости.
- Поместите вторую растянутую лабораторную парапленку на поверхность новой чашки с клеточными культурами размером 35 мм x 10 мм и добавьте поверх пленки 1 мкл вирусных запасов, окрашенных в зеленый цвет Fast.
- Опустите кончик микропипетки в вирусный сток и нажмите на fill-model, чтобы заполнить стеклянную микропипетку ~1 мкл вирусного стока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание высыхания помещайте кончик заполненной микропипетки в стерильный физиологический раствор (PBS) всякий раз, когда в процедуре есть пауза. - С помощью препарирующего микроскопа опустите заполненную стеклянную микропипетку, подключенную к автоматическому инъектору, в целевую область просвета хрусталика эмбриона.
- Отрегулируйте источник света, чтобы обеспечить четкую визуализацию контура пузырька хрусталика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Просвет правой линзы (направленной вверх) обычно используется для инъекции, а левый (направленный вниз) остается нетронутым в качестве контралатерального контроля. - Убедившись, что микропипетка расположена в правильном месте в просвете хрусталика, введите 5-40 нл вирусного запаса (рис. 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального размещения инъекции очень важна практика. - Подождите ~45 с, а затем аккуратно извлеките стеклянную микропипетку.
- Проверьте успешность микроинъекции в просвет хрусталика с помощью препарирующего микроскопа, изучив краситель Fast Green, который должен оставаться в пустом просвете хрусталика без какой-либо утечки.
- После процедуры инъекции заклейте отверстие яичной скорлупы скотчем.
- Верните эмбрион в инкубатор, увлажненный при температуре 37 °C, без каких-либо вращательных движений, до тех пор, пока не будет достигнут желаемый эмбриональный возраст для препарирования хрусталика.
Рисунок 3: Микроинъекционная подготовка цыплят и схема . (А) Вскрытие куриного яйца. (Б) Разрезание амниотической оболочки. (C) Схема микроинъекции просвета хрусталика курицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После определения специфического белка(ов) мишени и идентификации ассоциированной последовательности (последовательностей) генов, общий экспериментальный подход включает клонирование последовательности (последовательностей) гена в ретровирусный вектор RCAS(A) путем первоначального клонирования в адапторный вектор с последующим вирусным вектором. Во-вторых, высокотитровые вирусные частицы получают с использованием клеток-упаковщиков для сбора и концентрации вирионов. Эти первые два основных шага были в значительной степени описаны, и репрезентативные результаты представлены в других статьях 6,7,8,14,16.
Для этого протокола основным направлением является этап микроинъекции. Крайне важно определить успешность микроинъекции in situ вирусных частиц RCAS(A), содержащих фрагменты ДНК интересующего белка-мишени, как во время инъекции, так и после выделения хрусталика. На рисунке 4 показано изображение просвета хрусталика до и после инъекции вирусных векторов, окрашенных Fast Green для визуализации и подтверждения правильной локализации в просвете хрусталика. Fast Green - это краситель с высокой степенью безопасности, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в качестве красящей добавки, используемой для окрашивания продуктов питания, лекарств и косметики19.
На рисунке 5 показана гистологическая оценка методом иммунофлуоресценции белка-мишени, химерного коннексина Cx50*43L, который вводили в высокотитровые рекомбинантные ретровирусы, микроинжектировали в просвет хрусталика и оценивали. Поскольку С-концы химерных коннексинов были эпитопно помечены последовательностями FLAG, для идентификации экзогенных коннексинов от эндогенных использовали анти-флаговое мечение, используя стандартную методологию окрашивания, с сагиттальным и корональным срезами (сагиттальный показан здесь), как описано в Liu et al.10 Хотя Cx50*43L локализуется на плазматической мембране, из-за ориентации подготовленных срезов ткани, По-видимому, он локализуется внутри хрусталика в определенных областях. В этом исследовании было оценено и окрашено взаимодействие между межклеточным петлевым доменом Cx50 и AQP010.
Рисунок 4: Пример микроинъекции в просвет хрусталика курицы. (A) Предварительный впрыск в просвет хрусталика. (B) После инъекции в просвет хрусталика. Стрелка = место инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Микроинъекция и гистологическая оценка. На 18-й стадии эмбрионального развития, т.е. ~65-68 ч эмбрионального развития, в пустой просвет хрусталика цыпленка делали микроинъекцию рекомбинантных ретровирусов, содержащих химерный мутант Cx50*43L. Мы исследовали криосрезы хрусталиков цыплят, препарированных на 18-й день эмбриона, которые были иммуномечены антителами FLAG (зеленый) и AQP0 (красный). Флуоресцеин-конъюгированный антимышиный IgG использовался для обнаружения первичных антител против анти-FLAG, в то время как родамин-конъюгированный антикроличий IgG использовался для обнаружения первичных антител против анти-AQP0. Визуализацию иммуноокрашивания проводили с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Соответствующие объединенные изображения, помеченные как «Объединенные», можно увидеть справа. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта экспериментальная модель дает возможность экспрессировать интересующие белки в интактном хрусталике, что приводит к изучению функциональной значимости этих белков в структуре и функции хрусталика. Модель микроинъекции эмбрионального цыпленка частично основана на работе Fekete et. al.6 и был в дальнейшем развит Jiang et. al.8 и был использован в качестве средства для вставки как вирусных плазмид, так и агентов, таких как агонисты, малые интерферирующие РНК (миРНК) и пептиды в хрусталик цыплят 1,9,10,11,12,13. Эта платформа идеально подходит для изучения механизмов, запускающих развитие заболевания, а также для тестирования возможных лекарственных мишеней для патологических состояний хрусталика, таких как врожденная катаракта. По мере того, как наше понимание патологических состояний хрусталика улучшается, а генетические или приобретенные мутации выявляются, эта экономически эффективная модель на животных позволяет изучать основные механизмы, связанные с развитием этих состояний или исходов мутаций, что может помочь удовлетворить большую медицинскую потребность в нехирургических и надежных схемахлечения заболеваний хрусталика. Кроме того, эта система предлагает систему in vivo для характеристики белков дикого типа и мутировавших белков в отношении сборки и агрегации белков, как недавно описано 1,11. Эта модель может быть применена для широкого использования за пределами объектива.
RCAS(A) является репликационно-компетентным птичьим ретровирусом8. Его использование в сочетании с эмбриональным хрусталиком курицы (хорошо зарекомендовавшая себя животная модель для изучения развития и физиологии хрусталика 1,2,3,4) рассматривается как уникальное и эффективное средство экспрессии экзогенных белков в куриных эмбрионах. Учитывая уникальную временную шкалу и структуру эмбрионального развития цыпленка, при этом хрусталик на стадии развития 18 (~65-68 ч эмбрионального развития) отделяется от эктодермы и образует герметичный везикул с центральным просветом, это подготавливает микроинъекцию в этот пустой просвет хрусталика, чтобы ограничить экспрессию пролиферативных клеток хрусталика 7,8,18. Несмотря на то, что это в основном является преимуществом для нашей цели, это также является существенным ограничением, поскольку из-за природы ретровирусной инъекции с помощью этой методики изменяются только пролиферативные клетки. Трансфекция (инъекция) ретровирусов не является транзиторной экспрессией, и экзогенные гены включены в геном. Этот подход к доставке генов очень эффективен, и предыдущие данные показывают, что почти все пролиферативные клетки могутбыть инфицированы. Примечательно, что наши предыдущие исследования показали, что микроинъекция сама по себе не вызывает видимого повреждения хрусталика, что определяется морфологией хрусталика и отсутствием образования катаракты в месте инъекции1.
В отличие от этого подхода, можно использовать подходы in vitro с использованием культивируемых клеток хрусталика, но они ограничены рекапитуляцией ранних стадий развития волокон хрусталика 20,21,22,23,24. Кроме того, системы эксплантов хрусталика ex vivo также широко используются в качестве средства для изучения дифференцировки хрусталика и катарактогенеза25,26. Эта модель и связанные с ней культуры капсулыхрусталика 27, хотя и являются мощными, являются упрощенными моделями культивирования, которые имеют ограничения и сложности в зависимости от их предполагаемого применения24,26. Использование трансгенных подходов в хрусталике мыши или курицы имело различные ограничения, при этом хрусталик мыши не имел существенного сходства с человеческим хрусталиком 1,2,3,4, а линзы курицы имели ограничения по эффективности и стабильности28.
При выполнении протокола необходимо уделять большое внимание обеспечению адекватной амплификации фрагментов ДНК, титрования ретровирусов, трансфекции и стерильной подготовки вирусных запасов, поскольку бактериальное и дрожжевое загрязнение при микроинъекциях может привести к летальности эмбрионов цыплят7. Для самой микроинъекции критически важными этапами являются правильная локализация эмбриона цыпленка и хрусталика, а также позиционирование микропипетки в просвет хрусталика, и необходимо уделять особое внимание, чтобы не переполнить капсулу хрусталика во время инъекции. В целом, практика должна проводиться с тщательной записью анатомических участков, и дополнительные яйцеклетки должны быть подготовлены для эксперимента, чтобы учесть ошибку. Следует отметить аномалии в процессе микроинъекции, такие как случайный разрыв кровеносных сосудов, и следует избегать использования этих эмбрионов. Кроме того, следует помнить об ограничениях ретровирусной системы RCAS, таких как ее способность создавать эктопическую экспрессию гена за пределами заданного окна или местоположения, недостаточная простота регулирования уровня экспрессии и, наконец, существуют ограничения на размер вставки, особенно >2 kb15,29. Наконец, следует внимательно отнестись к выбору времени оценки. В этом эксперименте мы выбирали до 18-го дня эмбриона, который близок к вылуплению яйца, чтобы определить общее влияние экспрессии экзогенных генов на интактный хрусталик. После инъекции процент вылупления очень низкий, и большинство эмбрионов не могут выжить из-за разрушения вителлиновой мембраны.
В заключение, использование этой модели микроинъекций с помощью RCAS(A) представляет собой высокоэффективную, быструю и настраиваемую систему для экспрессии экзогенных белков, позволяющую проектировать и экспрессировать белки для решения их функции в физиологии и развитии хрусталика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH): RO1 EY012085 (J.X.J) и F32DK134051 (F.M.A.), а также грантом Фонда Уэлча: AQ-1507 (J.X.J.). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Фигуры были частично созданы с Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | - | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | - | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | - | - | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | - | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
References
- Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
- Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
- Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
- McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
- Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
- Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
- Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
- Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
- Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
- Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Yan, R. T., Wang, S. Z.
- Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
- Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
- Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
- Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
- West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
- Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
- Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
- Hughes, S. H.
