Summary
Bu protokol belgesi, lens gelişimi sırasında in situ fonksiyon ve proteinlerin ekspresyonunu incelemek için bir araç olarak bir RCAS(A) retrovirüsünün embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun metodolojisini açıklamaktadır.
Abstract
Embriyonik tavuk (Gallus domesticus), insan merceği ile yüksek derecede benzerliği göz önüne alındığında, mercek gelişimi ve fizyolojisi çalışmaları için köklü bir hayvan modelidir. RCAS(A), erken gelişim aşamalarında lens vezikülünün boş lümenine mikroenjeksiyon yoluyla lens gelişimi sırasında vahşi tip ve mutant proteinlerin in situ ekspresyonunu ve işlevini incelemek için güçlü bir araç görevi gören, bölünen hücreleri enfekte eden, replikasyona yetkin bir tavuk retrovirüsüdür. Transgenik modeller ve ex vivo kültürler gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, RCAS(A) replikasyonuna yetkin bir kuş retrovirüsünün kullanılması, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem sağlar. Spesifik olarak, hedeflenen gen transferi, dokuya özgü promotörlere ihtiyaç duymadan proliferatif lens lifi hücreleriyle sınırlandırılabilir. Bu yazıda, rekombinant retrovirüs RCAS(A) hazırlığı için gereken adımları kısaca gözden geçireceğiz, mikroenjeksiyon prosedürüne ayrıntılı, kapsamlı bir genel bakış sunacağız ve tekniğin örnek sonuçlarını sunacağız.
Introduction
Bu protokolün amacı, bir RCAS(A)'nın (replikasyona yetkin kuş sarkomu/lökoz retrovirüsü A) embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun metodolojisini tanımlamaktır. Embriyonik bir tavuk merceğinde etkili retroviral uygulamanın, normal mercek fizyolojisi, patolojik koşullar ve gelişiminde mercek proteinlerinin moleküler mekanizması ve yapı-işlevinin in vivo çalışması için umut verici bir araç olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bu deneysel model, terapötik hedeflerin tanımlanması ve insan konjenital kataraktları gibi durumlar için ilaç taraması için kullanılabilir. Toplamda, bu protokol, lens proteinlerinin incelenmesi için özelleştirilebilir bir platformun geliştirilmesi için gerekli adımları ortaya koymayı amaçlamaktadır.
Embriyonik civcivler (Gallus domesticus), lens yapısı ve insan merceği ile işlev bakımından benzerlikleri nedeniyle, mercek gelişimi ve fizyolojisi çalışmaları için köklü bir hayvan modelidir 1,2,3,4. RCAS(A) replikasyonuna yetkin bir kuş retrovirüsünün kullanımı, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem olarak kabul edilmiştir. Özellikle, boş lens lümeninin varlığının proliferatif lens fiber hücreleri içinde eksojen proteinlerin ekspresyonu için kısıtlı bölgeye yerinde RCAS (A) mikroenjeksiyonuna izin verdiği benzersiz embriyonik gelişim zaman çerçevesini kullanarak, dokuya özgü proliferatif lens lifi hücrelerine ihtiyaç duymadan hedef gen transferini proliferatif lens lifi hücrelerine sınırlamak için benzersiz bir yeteneğesahiptir 5, 6,7,8.
Burada derinlemesine açıklanan civciv embriyo mikroenjeksiyon prosedürü, başlangıçta kısmen Fekete et. al.6 ve Jiang et. al.8 ve hem viral hem de viral olmayan plazmitleri embriyonik civcivlerinmerceğine sokmanın bir yolu olarak kullanılmıştır 1,9,10,11,12,13. Genel olarak, önceki çalışma, lens gelişimini, farklılaşmasını, hücresel iletişimi ve hastalığın ilerlemesini incelemek ve katarakt gibi lens patolojik durumları için terapötik hedeflerin keşfi ve test edilmesi için bu metodolojiyi kullanma potansiyelini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Hayvan Refahı Yasası ve Hayvan Refahı Yönetmeliği'nin Uygulama Yönetmeliği'ne uygun olarak, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. Tüm hayvan prosedürleri, San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Protokole genel bir bakış için bkz. Şekil 1; Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
Şekil 1: Deneysel taslak. 1 . Protokolün ilk adımı, spesifik bir hedef protein(ler)in belirlenmesi, ilişkili gen dizi(ler)inin tanımlanması ve DNA fragmanı üretimidir. 2 . Gen dizi(ler)inin bir adaptör vektöre ilk klonlama ile retroviral bir vektöre klonlanması, 3. ardından bir viral vektör . 4 . Hasat ve konsantre etmek için paketleme hücreleri kullanılarak yüksek titreli viral partiküllerin hazırlanması. 5 . Son adım ve bu protokolün odak noktası, RCAS (A) viral partiküllerinin lens lümenine tavuk lensi mikroenjeksiyonudur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. Yüksek titreli rekombinant retrovirüslerin hazırlanması
- Hedef protein DNA fragmanları yapmak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
NOT: Bu bölüm, hedef lens proteinine karşılık gelen DNA dizisini amplifiye etmeyi amaçlamaktadır. Daha fazla ayrıntı için 7,8'e bakın.- Bir FLAG epitop dizisi (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), bir durdurma kodonu ve bir kısıtlama enzim bölgesi (yani, Eco RI) CLa12NCO'nun polilinker bölgesinde bulunan veya bulunmayan) çerçeve içinde karboksil terminalleri ile çerçeve içinde DNA fragmanları yapmak için ilgilenilen proteine karşılık gelen PCR için primerler tasarlayın, yeterli kısıtlama enzimleri için dizilerle 1, 7,8,10,11.
- PCR reaksiyonunu gerçekleştirin10. Tasarlanan primerlerin 100 pmol duyu ve antianlamını 0.5 μg connexin cDNA (Cx50, Cx43 veya kimerik Cx50 * 43L kombinasyonları gibi) ile tercih edilen PCR reaksiyon tamponuna birleştirin. Her biri 1 dakika boyunca 94 °C, 1 dakika boyunca 58 °C ve 1 dakika boyunca 72 °C'den oluşan 30 döngü gerçekleştirin ve ardından 72 °C'de 10 dakika son bir uzatma yapın.
- PCR ürünlerini bir jel saflaştırma kiti ile izole edin ve saflaştırın.
- Saflaştırılmış PCR ürünlerini, üreticinin talimatlarına göre tercih edilen kısıtlama enzimlerini kullanarak sindirin.
- DNA eklerinin adaptör plazmidine klonlanması
NOT: DNA parçalarının bir adaptör vektörüne eklenmesi, RCAS(A) vektör stabilitesini artırmak için yardımcı hücrelere/virüslere olan ihtiyacı ortadan kaldırır14. Daha fazla ayrıntı için 7,8'e bakın.- Yapışkan uçlu bir ligasyon reaksiyonu kullanarak DNA parçalarını bir adaptör plazmidi olan Cla12NCO'ya alt klonlayın. PCR fragmanlarını restriksiyon enzimleri ve Cla12NCO ile 2-5:1 oranında karıştırın. Yetkili hücreleri kullanarak ligasyon ve DNA dönüşümü gerçekleştirin.
- Bir DNA izolasyon kiti kullanarak DNA'yı izole edin.
- Doğruluğu sağlamak için DNA'yı sıralayın.
- RCAS(A) viral vektörüne klonlama
NOT: DNA fragmanları, gelişmekte olan civciv embriyosundaki hücrelere bir genin stabil transdüksiyonu için bir araca (RCAS(A) retrovirüs) yerleştirilir14,15. Daha fazla ayrıntı için 7,8,15'e bakın.- İlgilenilen vektörün Cla12NCO-DNA fragmanını ClaI (1 μg DNA başına 1 birim) ile sindirin ve fragmanları jel ile izole edin.
- DNA parçalarını ClaI-doğrusallaştırılmış bir RCAS(A) plazmidine alt klonlayın. RCAS(A) plazmidindeki ClaI bölgesini ayırt etmek için kısıtlama enzimi SalI'yi kullanın.
- ClaI ve SalI kısıtlama enzimleri ile sindirim yoluyla yapılara eklenen parçaların doğru yönünü onaylayın.
- Bir DNA izolasyon kiti kullanarak DNA'yı izole edin.
- DNA konsantrasyonunu belirleyin.
- Civciv embriyonik fibroblast (CEF) hücrelerinin transfeksiyonu ve RCAS(A) hasadı
NOT: Virüs paketleme hücreleri, CEF'ler, viral partiküller içeren hücre kültürü ortamını elde etmek/hasat etmek için kullanılır15,16. Daha fazla ayrıntı için 7,8,15'e bakın.- Üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon ajanını kullanarak rekombinant retroviral DNA yapılarına sahip CEF hücrelerini transfekte edin.
- İlgilenilen proteinin ekspresyonunu incelemek için transfekte edilmiş hücrelerin batı blotlamasını gerçekleştirin.
- Transfekte edilen hücreler birleştiğinde, süpernatan ortamı toplamaya, uygun şekilde işlemeye / filtrelemeye (0.22μm filtre kullanarak herhangi bir hücresel kalıntıyı çıkarmak için) başlayın ve konsantrasyona hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.
- Viral stokların konsantrasyonu ve titresi
NOT: Viral partikülleri içeren hücrelerden elde edilen pelet ve büyük hacimli ortamlar filtrelenmelidir. Ek olarak, virüsün konakçı hücrelere karşı gücünü belirlemek için bir viral titre testi yapılmalıdır. Daha fazla ayrıntı için 6,7,8,15'e bakın.- Virionları içeren kültür ortamını çözün.
- Kültür ortamını 4 °C'de 2 saat boyunca 72.000 × g'da döndürün.
- Süpernatanı boşaltın ve viral peleti artık (~50 μL) ortam ile yeniden süspanse edin ve kullanıma kadar -80 °C'de ~10 μL viral stoklarda saklayın.
- Titre için, QT-6 veya CEF hücrelerini kullanarak, hücreleri viral stokların seri seyreltilmesiyle transfekte edin.
- Birleşme sonrası,% 4 formaldehit kullanarak hücreleri sabitleyin.
- Mililitre başına (koloni oluşturan birimler) CFU (CFU/mL) olarak tanımlanan titreyi elde etmek için viral gag proteinleri için immün boyama veya histokimyasal olarak alkalin fosfataz için işlem.
Şekil 2: Civciv lens mikroenjeksiyonu için aletler ve kurulum . (A) P-30 manuel dikey mikroelektrot mikropipet çektirmesi. (1) bir cam mikropipetin çekildiğini gösteren iç kısım. (b) (2) yumurta kuluçka makinesi. Retrovirüs enjeksiyonu için 18. aşamaya (kapalı, boş bir merkezi lümen ile) ulaşmak için tavuk yumurtasını 37 ° C'lik bir inkübatörde ~ 65-68 saat kuluçkaya yatırın. (C) Mikroenjeksiyon kurulumu. (3) aydınlatma ekipmanı, (4) Pico-Enjektör, (5) diseksiyon mikroskobu, (6) Drummond mikromanipülatörü, (7) görselleştirme için bilgisayar/kamera. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Civciv lens mikroenjeksiyonu
- Malzemelerin hazırlanması
- Mikroenjeksiyon için cam mikropipetlerin hazırlanması17
NOT: Cam kılcal damarlar, mikroenjeksiyon için uç noktası ve ~11 μm dış çapa (OD) sahip cam mikropipetler yapmak için kullanılır. Kurulum Şekil 2A'da gösterilmiştir.- Borosilikat cam kılcalını, manuel dikey mikropipet çekicisindeki kauçuk yastıklı klipslere takın.
- Isı sıcaklığını (HEAT 1) 950 °C'ye ayarlayın ve daha ince ve yumuşak bir cam kılcal damar elde etmek için ön çekme işlemi gerçekleştirin.
- Isı sıcaklığını (HEAT 2) 790 °C'ye ayarlayın ve son mikropipetleri üretmek için ikincil bir çekme işlemi gerçekleştirin.
- Bir mikropipet öğütücü ile uç açıklığını ~11 μm'lik bir dış çapa kadar keskinleştirin.
- Gelecekteki deneyler için, cam mikropipetleri bir cam kavanozun içindeki sünger sıkıştırma pedinde saklayın.
- Döllenmiş yumurtaların gelişme aşamasına kadar kuluçka 18
NOT: Lens gelişimi sırasında, embriyonik gelişimin ~ 65-68 saatinde, lens ektodermden ayrılır ve merkezi lümenli kapalı bir vezikül oluşturur; Proliferatif lens hücrelerinesınırlı ekspresyon için bu boş lens lümen asallarına enjeksiyon 7,8,18.- Döllenmiş tavuk yumurtalarını 37 °C nemlendirilmiş sallanan inkübatörde ~65-68 saat kuluçkaya yatırın (Şekil 2B).
- Mikroenjeksiyon için cam mikropipetlerin hazırlanması17
- Tavuk yumurtasının açılması
NOT: Bu adım, embriyonun mikroenjeksiyon için tanımlanmasını ve maruz kalmasını açıklar. Daha fazla ayrıntı için 7,8'e bakın.- Çalışma alanını %70 etanol ile iyice silin.
- Yumurtaları kuluçka makinesinden çıkarın, üzerlerine %70 etanol püskürtün ve kurumaya bırakın.
- Yumurtayı, yumurtanın büyük ucu yukarı bakacak şekilde bir yumurta tutucusuna yerleştirin.
- Bir çift keskin dişli forseps kullanarak, yumurta kabuğuna dikkatlice vurarak ve yumurta kabuğunun parçalarını çıkararak yumurtanın büyük ucunda ~2 cm çapında bir delik açın (Şekil 3A).
- Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak embriyoyu bulun.
- Embriyo ve civciv merceği yerleştirildikten sonra, embriyonun üstünü hemen kaplayan amniyonik zarı kesmek için diseksiyon mikroskobu ve ince diseksiyon forseps ve makas kullanın (Şekil 3B).
NOT: Çok geniş kesmeyin (sadece embriyoyu ~ 0,5 cm x 0,5 cm açığa çıkaracak kadar), aksi takdirde embriyolar yumurta sarısı kütlesine batabilir; Ayrıca mümkünse kan damarlarına dokunmaktan kaçının. - Sonraki adımlara hazırlanmak için yumurtanın ağzını 60 mm'lik bir Petri kabı ile örtün.
- Konsantre viral stoğun mikroenjeksiyonu
NOT: Transdüksiyon için hedef protein DNA fragmanları içeren viral partiküller, lens lümeninin içindeki hücrelere yerleştirilir. Kurulum Şekil 2C'de gösterilmiştir. Daha fazla ayrıntı için 6,7,8'e bakın.- Viral stok stoklarını buz üzerinde çözün.
- Enjeksiyon sırasında viral stoğun görselleştirilmesi için, 1 μL 10x Fast green'i 10 μL içeren bir viral stok şişesine seyreltin.
- Cam mikropipeti tıkayabilecek büyük çözünmemiş malzeme parçaları olmadığından emin olmak için, çözeltileri buz üzerinde tutarken "büyük parçaları" peletlemek ve süpernatanları yeni tüplere aktarmak için çözeltileri 4 °C'de 10.000 × g'da 10 saniye santrifüjleyin.
- 35 mm x 10 mm'lik bir kültür kabına, gerilmiş bir laboratuvar parafilmi yerleştirin ve filmin üzerine 1 μL steril salin (PBS) ekleyin (sterilize edilmemiş, kapalı tarafı "temiz" olarak kabul edilir).
- Hazırlanmış bir cam mikropipeti otomatik bir piko-enjektöre bağlayın.
- Steril salini (PBS) bir cam mikropipete doldurmak için doldurma moduna basın ve ardından tahsis edilen 1 μL sıvıyı test etmek için enjeksiyon modunu kullanın.
- Yeni bir 35 mm x 10 mm hücre kültürü kabının yüzeyine ikinci bir gerilmiş laboratuvar parafilmi yerleştirin ve filmin üzerine 1 μL Hızlı yeşil lekeli viral stok ekleyin.
- Mikropipetin ucunu viral kuyruğa indirin ve cam mikropipeti ~1 μL viral stokla doldurmak için doldurma modeline basın.
NOT: Kurumasını önlemek için, prosedürde bir duraklama olduğunda doldurulmuş mikropipetin ucunu steril salin (PBS) içine koyun. - Otomatik enjektöre bağlı dolu cam mikropipeti, diseksiyon mikroskobu yardımıyla embriyo lens lümeninin hedef bölgesine indirin.
- Lens vezikülünün ana hatlarının net bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için ışık kaynağını ayarlayın.
NOT: Sağ merceğin lümeni (yukarı bakacak şekilde) tipik olarak enjeksiyon için kullanılır ve sol (aşağı bakacak şekilde) kontralateral kontrol olarak bozulmadan tutulur. - Mikropipetin yerleştirilmesinin lens lümeni içinde doğru yerde olduğundan emin olduktan sonra, viral stoğun 5-40 nL'sini enjekte edin (Şekil 3C).
NOT: Optimal enjeksiyon yerleşimi için pratik yapmak çok gereklidir. - ~45 saniye bekleyin ve ardından cam mikropipeti yavaşça çıkarın.
- Lensin boş lümeninde herhangi bir sızıntı olmadan kalması gereken Fast Green boyayı inceleyerek diseksiyon mikroskobu kullanarak lens lümenine başarılı mikroenjeksiyon olup olmadığını kontrol edin.
- Enjeksiyon işleminden sonra yumurta kabuğu açıklığını bantla kapatın.
- Lens diseksiyonu için istenen embriyonik yaşa ulaşılana kadar embriyoyu herhangi bir dönme hareketi olmadan 37 °C nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun.
Şekil 3: Mikroenjeksiyon civciv hazırlığı ve şeması . (A) Tavuk yumurtasının açılması. (B) Amniyotik membranın kesilmesi. (C) Tavuk lens lümen mikroenjeksiyon şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spesifik bir hedef protein(ler)in belirlenmesinden ve ilişkili gen dizi(ler)inin tanımlanmasından sonra, genel deneysel yaklaşım, gen dizi(ler)inin bir adaptör vektöre ilk klonlama ile bir retroviral RCAS(A) vektörüne klonlanmasını ve ardından bir viral vektörü içerir. İkincisi, yüksek titreli viral partiküller, viryonları hasat etmek ve konsantre etmek için paketleme hücreleri kullanılarak hazırlanır. Bu ilk iki ana adım büyük ölçüde tanımlanmış ve temsili sonuçlar başka yerlerdesunulmuştur 6,7,8,14,16.
Bu protokol için ana odak alanı mikroenjeksiyon adımıdır. Hem enjeksiyon sırasında hem de lens izolasyonundan sonra, ilgilenilen protein hedefinin DNA fragmanlarını içeren RCAS(A) viral partiküllerinin in situ mikroenjeksiyonunun başarısını belirlemek zorunludur. Şekil 4 , görselleştirme ve lens lümenine uygun lokalizasyonun doğrulanması için Hızlı Yeşil ile boyanmış viral vektörlerin enjeksiyon öncesi ve sonrası lens lümeninin bir görüntüsünü göstermektedir. Fast Green, yüksek derecede güvenliğe sahip bir boyadır ve ABD Gıda ve İlaç Dairesi tarafından gıda, ilaç ve kozmetikleri renklendirmek için kullanılan bir renk katkı maddesi olarak onaylanmıştır19.
Şekil 5, yüksek titreli rekombinant retrovirüslere sokulan, lens lümenine mikroenjekte edilen ve değerlendirilen hedef proteinin, kimerik konneksin Cx50 * 43L'nin immünofloresan yoluyla histolojik değerlendirmesini göstermektedir. Kimerik konneksinlerin C-terminalleri FLAG dizileri ile epitop olarak etiketlendiğinden, Liu ve ark.'da tarif edildiği gibi, standart boyama metodolojisi kullanılarak sagital ve koronal kesitlerle (burada gösterilen sagital) endojen olanlardan eksojen konneksinleri tanımlamak için anti-flag etiketleme kullanıldı.10 Cx50 *43L, hazırlanan doku kesitlerinin oryantasyonu nedeniyle plazma membranı üzerinde lokalize olmasına rağmen, Bazı bölgelerde lensin içinde lokalize olmuş gibi görünüyor. Bu çalışmada, Cx50 ve AQP0'ın hücreler arası döngü alanı arasındaki etkileşim değerlendirilmiş ve buna göre boyanmıştır10.
Şekil 4: Tavuk lens lümenine mikroenjeksiyon örneği . (A) Lens lümenine ön enjeksiyon. (B) Lens lümenine enjeksiyon sonrası. Ok = enjeksiyon bölgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Mikroenjeksiyon ve histolojik değerlendirme. Embriyonik gelişimin ~ 65-68 saat olan embriyonik gelişimin 18. aşamasında, bir civciv merceğinin boş lümenine kimerik Cx50 * 43L mutant içeren rekombinant retrovirüslerin bir mikroenjeksiyonu yapıldı. Embriyonik 18. günde diseke edilen ve FLAG (yeşil) ve AQP0 (kırmızı) antikorları ile immün etiketli civciv lenslerinin kriyokesitlerini inceledik. Anti-FLAG'e karşı primer antikorları saptamak için floresein konjuge anti-fare IgG kullanılırken, anti-AQP0'a karşı primer antikorları saptamak için rodamin konjuge anti-tavşan IgG kullanıldı. İmmün boyamanın görselleştirilmesi konfokal floresan mikroskobu kullanılarak yapıldı. "Birleştirilmiş" olarak etiketlenmiş ilgili birleştirilmiş görüntüler sağda görülebilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu deneysel model, bozulmamış mercekte ilgilenilen protein(ler)i ifade etme fırsatı sunar ve bu proteinlerin mercek yapısı ve işlevindeki işlevsel öneminin incelenmesine yol açar. Embriyonik civciv mikroenjeksiyon modeli kısmen Fekete et. al.6 ve Jiang et tarafından daha da geliştirildi. al.8 ve hem viral plazmitleri hem de agonistler, küçük enterferans yapan RNA (siRNA) ve peptitler gibi ajanlarıcivcivlerin merceğine 1,9,10,11,12,13 yerleştirmenin bir yolu olarak kullanılmıştır. Bu platform, konjenital katarakt gibi lens patolojik durumları için olası ilaç hedeflerini test etmenin yanı sıra hastalık gelişimini tetikleyen mekanizmaları araştırmak için idealdir. Lens patolojik durumlarına ilişkin anlayışımız geliştikçe ve genetik veya edinilmiş mutasyonlar tanımlandıkça, bu uygun maliyetli hayvan modeli, bu koşulların gelişimini veya mutasyonların sonuçlarını çevreleyen altta yatan mekanizmaların incelenmesine olanak tanır ve bu da lens koşulları için cerrahi olmayan ve güvenilir tedavi rejimlerinin büyük tıbbi ihtiyacının karşılanmasına yardımcı olabilir1. Ek olarak, bu sistem, yakın zamanda tanımlandığı gibi, protein montajı ve agregasyonu açısından vahşi tip ve mutasyona uğramış proteinleri karakterize etmek için bir in vivo sistem sunar 1,11. Bu model, lensin ötesinde geniş kullanım için uygulanabilir.
RCAS(A), replikasyon konusunda yetkin bir kuş retrovirüsüdür8. Embriyonik bir tavuk lensi (lens gelişimi ve fizyolojisi 1,2,3,4 çalışması için köklü bir hayvan modeli) ile kombinasyon halinde kullanımı, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmenin benzersiz ve etkili bir yolu olarak kabul edilir. Benzersiz civciv embriyonik gelişim zaman çizelgesi ve yapısı göz önüne alındığında, lensle, gelişim aşamasında 18 (~ 65-68 saat embriyonik gelişim), ektodermden ayrılır ve merkezi bir lümenle kapalı bir vezikül oluşturur, bu, proliferatif lens hücrelerine ekspresyonunu sınırlamak için bu boş lens lümenine mikroenjeksiyon için hazırlanır 7,8,18. Çoğunlukla amacımız için bir güç olsa da, retroviral enjeksiyonun doğası gereği, bu metodoloji ile sadece proliferatif hücreler değiştirildiği için özellikle bir sınırlamadır. Retrovirüsler tarafından transfeksiyon (enjeksiyon) geçici bir ifade değildir ve eksojen genler genoma dahil edilir. Bu gen iletim yaklaşımı çok etkilidir ve önceki veriler neredeyse tüm proliferatif hücrelerin enfekte olabileceğini göstermektedir 8,10. Özellikle, önceki çalışmalarımız, mikroenjeksiyonun tek başına lens morfolojisi ve enjeksiyon noktasında katarakt oluşumunun olmaması ile belirlenen lenste belirgin bir hasara neden olmadığını göstermiştir1.
Bu yaklaşımın aksine, kültürlenmiş lens hücrelerini kullanan in vitro yaklaşımlar kullanılabilir, ancak lens lifi gelişiminin erken aşamalarının özetlenmesi ile sınırlıdır 20,21,22,23,24. Ek olarak, ex vivo lens eksplant sistemleri de lens farklılaşması ve kataraktogenezi incelemek için bir araç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır25,26. Bu model ve ilgili lens kapsülü kültürleri27, güçlü olmalarına rağmen, amaçlanan uygulamalarına bağlı olarak sınırlamaları ve karmaşıklıkları olan basit kültür modelleridir24,26. Fare veya tavuk merceğinde transgenik yaklaşımların kullanımı, fare merceğinin insan merceği 1,2,3,4 ile önemli benzerlikler paylaşmaması ve tavuk merceklerinin verimlilik ve stabilite açısından sınırlamaları olması nedeniyle çeşitli sınırlamalara sahip olmuştur28.
Protokolü uygularken, DNA fragmanlarının yeterli amplifikasyonunu, retrovirüs başlıklarını, transfeksiyonu ve viral stokların steril olarak hazırlanmasını sağlamak için büyük özen gösterilmelidir, çünkü mikroenjeksiyondaki bakteri ve maya kontaminasyonu civciv embriyolarında ölümcüllüğe neden olabilir7. Mikroenjeksiyonun kendisi için kritik adımlar, mikropipetin lens lümenine yerleştirilmesinin yanı sıra civciv embriyosu ve lensin doğru lokalizasyonudur ve enjeksiyon sırasında lens kapsülünün aşırı doldurulmamasına dikkat edilmelidir. Genel olarak, anatomik bölgelerin dikkatli bir şekilde gösterilmesiyle uygulama yapılmalı ve hatayı hesaba katmak için deney için fazladan yumurta hazırlanmalıdır. Mikroenjeksiyon işlemi sırasında kan damarlarının kazara yırtılması gibi anormallikler not edilmeli ve bu embriyoların kullanımından kaçınılmalıdır. Ek olarak, RCAS retroviral sisteminin, belirli bir pencere veya konumun dışında bir genin ektopik ekspresyonunu yaratma yeteneği, ekspresyon seviyesinin düzenlenmesinin kolay olmaması ve son olarak, insertin boyutlandırılmasında sınırlamalar olduğu gibi akılda tutulmalıdır, özellikle >2 kb15,29. Son olarak, değerlendirme zaman noktasını seçerken dikkatli olunmalıdır. Bu deneyde, ekzojen gen ekspresyonunun sağlam lens üzerindeki genel etkisini belirlemek için yumurta kuluçkasına yakın olan embriyonik 18. güne kadar seçtik. Enjeksiyondan sonra kuluçka oranı çok düşüktür ve embriyoların çoğu vitellin zarının bozulması nedeniyle yaşayamaz.
Sonuç olarak, bu RCAS(A) tavuk lensi mikroenjeksiyon modelinin kullanımı, proteinlerin lens fizyolojisi ve gelişimindeki işlevlerini ele almak için tasarım ve ekspresyonuna izin vermek için eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibeleri tarafından desteklenmiştir: RO1 EY012085 (JXJ'ye) ve F32DK134051 (FMA'ya) ve Welch Vakfı hibesi: AQ-1507 (JXJ'ye). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir. Figürler kısmen Biorender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | - | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | - | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | - | - | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | - | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
References
- Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
- Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
- Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
- McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
- Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
- Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
- Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
- Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
- Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
- Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Yan, R. T., Wang, S. Z.
- Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
- Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
- Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
- Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
- West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
- Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
- Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
- Hughes, S. H.
