Summary
Este documento de protocolo describe la metodología de microinyección de un retrovirus RCAS(A) en el cristalino de pollo embrionario como herramienta para estudiar in situ la función y la expresión de proteínas durante el desarrollo del cristalino.
Abstract
El pollo embrionario (Gallus domesticus) es un modelo animal bien establecido para el estudio del desarrollo y la fisiología del cristalino, dado su alto grado de similitud con el cristalino humano. RCAS(A) es un retrovirus de pollo competente para la replicación que infecta las células en división, que sirve como una poderosa herramienta para estudiar la expresión y función in situ de proteínas mutantes y de tipo salvaje durante el desarrollo del cristalino mediante microinyección en la luz vacía de la vesícula del cristalino en las primeras etapas de desarrollo, restringiendo su acción a las células proliferativas del cristalino circundantes. En comparación con otros enfoques, como los modelos transgénicos y los cultivos ex vivo , el uso de un retrovirus aviar competente para la replicación de RCAS(A) proporciona un sistema altamente efectivo, rápido y personalizable para expresar proteínas exógenas en embriones de pollo. Específicamente, la transferencia génica dirigida puede limitarse a las células proliferativas de la fibra del cristalino sin necesidad de promotores específicos de tejido. En este artículo, haremos un breve resumen de los pasos necesarios para la preparación de RCAS(A) de retrovirus recombinantes, proporcionaremos una descripción detallada y completa del procedimiento de microinyección y proporcionaremos resultados de muestra de la técnica.
Introduction
El objetivo de este protocolo es describir la metodología de microinyección embrionaria de lente de pollo de un RCAS(A) (retrovirus A de sarcoma aviar / leucosis con replicación competente). Se ha demostrado que la administración retroviral efectiva en una lente de pollo embrionaria es una herramienta prometedora para el estudio in vivo del mecanismo molecular y la estructura-función de las proteínas del cristalino en la fisiología, las condiciones patológicas y el desarrollo normales del cristalino. Además, este modelo experimental podría utilizarse para la identificación de dianas terapéuticas y el cribado de fármacos para enfermedades como las cataratas congénitas humanas. En definitiva, este protocolo pretende establecer los pasos necesarios para el desarrollo de una plataforma personalizable para el estudio de las proteínas del cristalino.
Los polluelos embrionarios (Gallus domesticus), debido a su similitud en la estructura y función del cristalino con el cristalino humano, son un modelo animal bien establecido para el estudio del desarrollo y la fisiología del cristalino 1,2,3,4. El uso de un retrovirus aviar competente para la replicación de RCAS(A) se ha considerado un sistema altamente efectivo, rápido y personalizable para expresar proteínas exógenas en embriones de pollo. En particular, tiene una capacidad única para confinar la transferencia de genes diana a las células proliferativas de la fibra del cristalino sin necesidad de promotores específicos del tejido, utilizando el marco de tiempo de desarrollo embrionario único en el que la presencia de la luz vacía del cristalino permite la microinyección in situ de RCAS(A) en el sitio restringido para la expresión de proteínas exógenas dentro de las células proliferativas de la fibra del cristalino5, 6,7,8.
El procedimiento de microinyección de embriones de pollo, descrito en profundidad aquí, se basa originalmente parcialmente en el trabajo de Fekete et. al.6 y desarrollado por Jiang et. al.8 y se ha utilizado como medio para introducir plásmidos virales y no virales en el cristalino de pollitos embrionarios 1,9,10,11,12,13. En general, el trabajo anterior demuestra el potencial de utilizar esta metodología para estudiar el desarrollo, la diferenciación, la comunicación celular y la progresión de la enfermedad en el cristalino, y para el descubrimiento y prueba de dianas terapéuticas para afecciones patológicas del cristalino, como las cataratas.
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y el Reglamento de Implementación de Bienestar Animal de acuerdo con los principios de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio. Para obtener información general sobre el protocolo, consulte la Figura 1; consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.
Figura 1: Esquema experimental. 1 . El primer paso del protocolo es la determinación de una proteína diana específica, la identificación de la(s) secuencia(s) genética(s) asociada(s) y la generación de fragmentos de ADN. 2 . Clonación de la(s) secuencia(s) genética(s) en un vector retroviral mediante clonación inicial en un vector adaptador, 3. seguido de un vector viral . 4 . Preparación de partículas virales de alto título utilizando celdas de empaque para cosechar y concentrar. 5 . El paso final, y el enfoque de este protocolo, es la microinyección de las partículas virales RCAS(A) en el lumen del cristalino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Preparación de retrovirus recombinantes de alto título
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para producir fragmentos de ADN de proteínas diana
NOTA: Esta sección tiene como objetivo amplificar la secuencia de ADN correspondiente a la proteína del cristalino diana. Para más detalles, véase 7,8.- Diseñar cebadores para PCR, correspondientes a la proteína de interés, para hacer fragmentos de ADN con su extremo carboxilo en el marco con o sin una secuencia de epítopos FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), un codón de parada y un sitio de enzima de restricción (es decir, EcoRI) presente dentro de la región polienlazadora de CLa12NCO)) de acuerdo con las especificaciones señaladas en protocolos publicados anteriormente, con secuencias para enzimas de restricción adecuadas1, 7,8,10,11.
- Realizar la reacción de PCR10. Combine 100 pmol de sentido y antisentido de los cebadores diseñados con 0,5 μg de ADNc de conexina (como Cx50, Cx43 o combinaciones quiméricas de Cx50*43L), con el tampón de reacción de PCR de su elección. Realice 30 ciclos cada uno de 94 °C durante 1 min, 58 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min, seguidos de una extensión final durante 10 min a 72 °C.
- Aísle y purifique los productos de PCR con un kit de purificación en gel.
- Digiera los productos de PCR purificados utilizando las enzimas de restricción de su elección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Clonación de insertos de ADN en plásmido adaptador
NOTA: La inserción de fragmentos de ADN en un vector adaptador elimina la necesidad de células/virus auxiliares para aumentar la estabilidad del vector RCAS(A)14. Para más detalles, véase 7,8.- El ADN subclonado se fragmenta en un plásmido adaptador, Cla12NCO mediante una reacción de ligadura de extremo pegajoso. Mezclar los fragmentos de PCR con enzimas de restricción y Cla12NCO en una proporción de 2-5:1. Realizar la ligadura y la transformación del ADN utilizando células competentes.
- Aísle el ADN con un kit de aislamiento de ADN.
- Secuenciar el ADN para garantizar la precisión.
- Clonación en el vector viral RCAS(A)
NOTA: Los fragmentos de ADN se insertan en un vehículo (retrovirus RCAS(A)) para la transducción estable de un gen en las células del embrión de pollo en desarrollo14,15. Para obtener más detalles, consulte 7,8,15.- Digiera el fragmento de ADN Cla12NCO del vector que contiene interés con ClaI (1 unidad por 1 μg de ADN) y aísle los fragmentos.
- Subclonar los fragmentos de ADN en un plásmido RCAS(A) linealizado por ClaI. Utilice la enzima de restricción SalI para distinguir el sitio ClaI en el plásmido RCAS(A).
- Confirmar la correcta orientación de los fragmentos insertados en las construcciones mediante digestión con enzimas de restricción ClaI y SalI.
- Aísle el ADN con un kit de aislamiento de ADN.
- Determina la concentración de ADN.
- Transfección de células de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) y recolección de RCAS(A)
NOTA: Las células de empaquetamiento de virus, CEF, se utilizan para obtener/cosechar medios de cultivo celular que contienen partículas virales15,16. Para obtener más detalles, consulte 7,8,15.- Transfecte células CEF con construcciones de ADN retroviral recombinante utilizando el agente de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Realizar Western blot de las células transfectadas para examinar su expresión de la proteína de interés.
- Cuando las células transfectadas alcancen la confluencia, comience a recolectar el medio sobrenadante, procesándolo/filtrándolo adecuadamente (para eliminar cualquier residuo celular usando un filtro de 0,22 μm) y almacene a -80 °C hasta que esté listo para la concentración.
- Concentración y titulación de las cepas virales
NOTA: Los gránulos y los grandes volúmenes de medios derivados de las células que contienen las partículas virales deben filtrarse. Además, se debe realizar un ensayo de título viral para establecer la fuerza del virus contra las células huésped. Para obtener más detalles, consulte 6,7,8,15.- Descongelar los medios de cultivo que contienen los viriones.
- Centrifugar el medio de cultivo a 72.000 × g durante 2 h a 4 °C.
- Decantar el sobrenadante y resuspender el gránulo viral con el medio residual (~50 μL) y almacenar a -80 °C hasta su uso, en cepas virales de ~10 μL.
- Para la titulación, utilizando células QT-6 o CEF, transfecte las células con una dilución en serie de las existencias virales.
- Después de la confluencia, fije las celdas con formaldehído al 4%.
- Inmunotinción para proteínas gag virales o proceso histoquímico para fosfatasa alcalina para obtener el título, definido como UFC (unidades formadoras de colonias) por mililitro (UFC/mL).
Figura 2: Instrumentos y configuración para la microinyección de lentes de pollito . (A) Extractor manual de micropipetas de microelectrodos verticales P-30. (1) recuadro que muestra una micropipeta de vidrio que se está tirando. (B) (2) Incubadora de huevos. Incubar el huevo de gallina durante ~65-68 h en una incubadora a 37 °C hasta alcanzar el estadio 18 (con un lumen central sellado y vacío) para la inyección de retrovirus. (C) Configuración de microinyección. (3) equipo de iluminación, (4) pico-inyector, (5) microscopio de disección, (6) micromanipulador Drummond, (7) computadora/cámara para visualización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Microinyección de lente de pollito
- Preparación de insumos
- Preparación de micropipetas de vidrio para microinyección17
NOTA: Los capilares de vidrio se utilizan para fabricar micropipetas de vidrio con una punta y un diámetro exterior (OD) de ~11 μm para microinyección. La configuración se muestra en la Figura 2A.- Fije el capilar de vidrio de borosilicato a los clips acolchados de goma en el extractor de micropipetas vertical manual.
- Ajuste la temperatura de calor (HEAT 1) a 950 °C y realice la extracción previa para obtener un capilar de vidrio más delgado y blando.
- Ajuste la temperatura de calor (HEAT 2) a 790 °C y realice un tirón secundario para producir las micropipetas finales.
- Con una amoladora de micropipetas, afile la abertura de la punta a un diámetro exterior de ~11 μm.
- Para futuros experimentos, mantenga las micropipetas de vidrio en una almohadilla de sujeción de esponja dentro de un frasco de vidrio.
- Incubación de óvulos fecundados hasta la etapa de desarrollo 18
NOTA: Durante el desarrollo del cristalino, a ~65-68 h de desarrollo embrionario, el cristalino se separa del ectodermo y forma una vesícula sellada con una luz central; La inyección en el lumen vacío del cristalino prepara la expresión restringida a las células proliferativasdel cristalino 7,8,18.- Incubar los huevos de gallina fertilizados durante ~65-68 h en una incubadora mecedora humidificada a 37 °C (Figura 2B).
- Preparación de micropipetas de vidrio para microinyección17
- Apertura del huevo de gallina
NOTA: Este paso describe la identificación y exposición del embrión para la microinyección. Para más detalles, véase 7,8.- Limpie bien el área de trabajo con etanol al 70%.
- Retire los huevos de la incubadora, rocíelos abundantemente con etanol al 70% y déjelos secar al aire.
- Coloque el huevo, con el extremo más grande del huevo hacia arriba, en un soporte para huevos.
- Con un par de pinzas de dientes afilados, haga un agujero de ~ 2 cm de diámetro en el extremo más grande del huevo golpeando con cuidado la cáscara del huevo y quitando fragmentos de la cáscara del huevo (Figura 3A).
- Con un microscopio de disección, localice el embrión.
- Una vez localizados el embrión y el cristalino del pollito, utilice el microscopio de disección y unas pinzas y tijeras de disección finas para cortar la membrana amniónica que cubre inmediatamente la parte superior del embrión (Figura 3B).
NOTA: No corte demasiado (solo lo suficiente para exponer el embrión ~ 0,5 cm x 0,5 cm), o de lo contrario los embriones podrían hundirse en la masa vitelita; También evite tocar los vasos sanguíneos, si es posible. - Cubra la abertura del huevo con una placa de Petri de 60 mm en preparación para los siguientes pasos.
- Microinyección de material viral concentrado
NOTA: Las partículas virales que contienen fragmentos de ADN de proteínas diana para su transducción se insertan en las células dentro de la luz del cristalino. La configuración se muestra en la Figura 2C. Para más detalles, ver 6,7,8.- Descongele las existencias de acciones virales en hielo.
- Para visualizar el stock viral durante la inyección, diluya 1 μL de 10x Fast green en un vial de stock viral que contenga 10 μL.
- Para asegurarse de que no haya grandes trozos de material no disuelto que puedan obstruir la micropipeta de vidrio, centrifugue las soluciones durante 10 s a 10.000 × g a 4 °C para granular "trozos grandes" y transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos, todo ello manteniendo las soluciones en hielo.
- En una placa de cultivo de 35 mm x 10 mm, coloque un parafilm de laboratorio estirado y agregue 1 μL de solución salina estéril (PBS) sobre la película (no esterilizada, con el lado cubierto considerado "limpio").
- Conecte una micropipeta de vidrio preparada a un picoinyector automático.
- Presione el modo de llenado para llenar la solución salina estéril (PBS) en una micropipeta de vidrio y, a continuación, use el modo de inyección para probar el 1 μL de líquido asignado.
- Coloque un segundo parafilm de laboratorio estirado en la superficie de una nueva placa de cultivo celular de 35 mm x 10 mm y agregue 1 μL de material viral teñido de verde rápido sobre la película.
- Baje la punta de la micropipeta en el material viral y presione el modelo de llenado para llenar la micropipeta de vidrio con ~1 μL de material viral.
NOTA: Para evitar que se seque, coloque la punta de la micropipeta llena en solución salina estéril (PBS) cada vez que haya una pausa en el procedimiento. - Baje la micropipeta de vidrio llena, conectada a un inyector automático, en la región objetivo de la luz de la lente del embrión con la ayuda de un microscopio de disección.
- Ajuste la fuente de luz para garantizar una visualización clara del contorno de la vesícula del cristalino.
NOTA: El lumen del cristalino derecho (hacia arriba) se utiliza normalmente para la inyección y el izquierdo (hacia abajo) se mantiene intacto como control contralateral. - Una vez que esté seguro de que la colocación de la micropipeta está dentro de la ubicación correcta dentro de la luz de la lente, inyecte 5-40 nL del material viral (Figura 3C).
NOTA: La práctica es muy necesaria para una colocación óptima de la inyección. - Espere ~45 s y luego retire suavemente la micropipeta de vidrio.
- Compruebe si la microinyección se ha realizado correctamente en el lumen de la lente utilizando el microscopio de disección examinando el tinte verde rápido que debe permanecer en el lumen vacío de la lente sin fugas.
- Después del procedimiento de inyección, selle la abertura de la cáscara de huevo con cinta adhesiva.
- Devolver el embrión a la incubadora humidificada a 37 °C, sin ningún movimiento de rotación, hasta que se haya alcanzado la edad embrionaria deseada para la disección del cristalino.
Figura 3: Preparación y esquema de la microinyección de pollitos . (A) Apertura de un huevo de gallina. (B) Corte de la membrana amniótica. (C) Esquema de microinyección de lúmenes de lentes de pollo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Tras la determinación de una o varias proteínas diana específicas y la identificación de las secuencias genéticas asociadas, el enfoque experimental general consiste en la clonación de las secuencias génicas en un vector RCAS(A) retroviral mediante la clonación inicial en un vector adaptador, seguido de un vector viral. En segundo lugar, las partículas virales de alto título se preparan utilizando células de envasado para cosechar y concentrar los viriones. Estos dos primeros pasos principales han sido ampliamente descritos y los resultados representativos presentados en otros lugares 6,7,8,14,16.
Para este protocolo, la principal área de enfoque es el paso de la microinyección. Es imperativo determinar el éxito de la microinyección in situ de partículas virales RCAS(A) que contienen fragmentos de ADN de la proteína diana de interés, tanto en el momento de la inyección como después del aislamiento del cristalino. La Figura 4 muestra una imagen del lumen del cristalino antes y después de la inyección de los vectores virales teñidos con Fast Green para su visualización y confirmación de la localización adecuada en el lumen del cristalino. Fast Green es un colorante con un alto grado de seguridad y está aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE. UU. como un aditivo de color utilizado para colorear alimentos, medicamentos y cosméticos19.
En la Figura 5 se muestra la evaluación histológica mediante inmunofluorescencia de la proteína diana, la conexina quimérica Cx50*43L, que se introdujo en retrovirus recombinantes de alto título, se microinyectó en la luz del cristalino y se evaluó. Dado que los extremos C de las conexinas quiméricas se marcaron con epítopos con secuencias FLAG, se utilizó el marcaje anti-bandera para identificar las conexinas exógenas de las endógenas, utilizando la metodología de tinción estándar, con secciones sagitales y coronales (sagital mostrada aquí), como se describe en Liu et al.10 Aunque Cx50*43L se localiza en la membrana plasmática, debido a la orientación de las secciones de tejido preparadas, Parece localizarse dentro del cristalino en ciertas regiones. En este estudio, se evaluó la interacción entre el dominio del bucle intercelular de Cx50 y AQP0 y se tiñó en consecuencia10.
Figura 4: Ejemplo de microinyección en el lumen del cristalino de pollo. (A) Preinyección en el lumen del cristalino. (B) Después de la inyección en el lumen de la lente. Flecha = lugar de inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Microinyección y evaluación histológica. En la etapa 18 del desarrollo embrionario, que es ~ 65-68 h de desarrollo embrionario, se realizó una microinyección de retrovirus recombinantes que contenían el mutante quimérico Cx50 * 43L en el lumen vacío de una lente de pollo. Examinamos las criosecciones de lentes de pollo diseccionadas en el día embrionario 18, que fueron inmunomarcadas con anticuerpos FLAG (verde) y AQP0 (rojo). La IgG anti-ratón conjugada con fluoresceína se utilizó para detectar anticuerpos primarios contra anti-FLAG, mientras que la IgG anti-conejo conjugada con rodamina se utilizó para detectar anticuerpos primarios contra anti-AQP0. La visualización de la inmunotinción se realizó mediante microscopía de fluorescencia confocal. Las imágenes combinadas correspondientes, etiquetadas como "Combinadas", se pueden ver a la derecha. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este modelo experimental ofrece la oportunidad de expresar la(s) proteína(s) de interés en el cristalino intacto, lo que lleva al estudio de la relevancia funcional de estas proteínas en la estructura y función del cristalino. El modelo de microinyección de pollitos embrionarios se basa parcialmente en el trabajo de Fekete et. al.6 y fue desarrollado por Jiang et. al.8 y se ha utilizado como medio para insertar plásmidos virales y agentes como agonistas, ARN interferente pequeño (ARNsi) y péptidos en el cristalino de los pollitos 1,9,10,11,12,13. Esta plataforma es ideal para investigar los mecanismos que desencadenan el desarrollo de la enfermedad, además de probar posibles dianas farmacológicas para afecciones patológicas del cristalino, como las cataratas congénitas. A medida que mejora nuestra comprensión de las condiciones patológicas del cristalino y se identifican mutaciones genéticas o adquiridas, este modelo animal rentable permite el estudio de los mecanismos subyacentes que rodean el desarrollo de estas afecciones o los resultados de las mutaciones, lo que puede ayudar a abordar la gran necesidad médica de regímenes de tratamiento no quirúrgicos y confiablespara las afecciones del cristalino. Además, este sistema ofrece un sistema in vivo para caracterizar proteínas de tipo salvaje y mutadas con respecto al ensamblaje y agregación de proteínas, como se describió recientemente 1,11. Este modelo podría aplicarse para un uso amplio más allá de la lente.
El RCAS(A) es un retrovirus aviar capaz de replicarse8. Su uso, en combinación con una lente de pollo embrionaria (un modelo animal bien establecido para el estudio del desarrollo y la fisiología del cristalino 1,2,3,4), se considera un medio único y eficaz para expresar proteínas exógenas en embriones de pollo. Dada la línea de tiempo y la estructura únicas del desarrollo embrionario del pollo, con el cristalino, en la etapa de desarrollo 18 (~65-68 h de desarrollo embrionario), separándose del ectodermo y formando una vesícula sellada con un lumen central, esto prepara para la microinyección en este lúmene vacío del cristalino para restringir la expresión a las células proliferativas del cristalino 7,8,18. Aunque en su mayoría es una fortaleza para nuestro propósito, también es notablemente una limitación, ya que debido a la naturaleza de la inyección retroviral, solo las células proliferativas se alteran a través de esta metodología. La transfección (inyección) por retrovirus no es una expresión transitoria y los genes exógenos se incorporan al genoma. Este enfoque de administración de genes es muy efectivo y los datos previos muestran que casi todas las células proliferativas pueden infectarse 8,10. En particular, nuestros estudios anteriores demostraron que la microinyección por sí sola no causa daño aparente al cristalino, determinado por la morfología del cristalino y la falta de formación de cataratas en el punto de inyección.
A diferencia de este enfoque, se pueden utilizar enfoques in vitro que utilizan células del cristalino cultivadas, pero se limitan a la recapitulación de las primeras etapas del desarrollo de las fibras del cristalino 20,21,22,23,24. Además, los sistemas de explante de lentes ex vivo también han sido ampliamente utilizados como medio para estudiar la diferenciación y la cataratogénesis del cristalino25,26. Este modelo y los cultivos de cápsulas de lentesrelacionados 27, aunque potentes, son modelos de cultivo simplistas, que tienen limitaciones y complejidades dependiendo de su aplicación prevista24,26. El uso de abordajes transgénicos en el cristalino de ratón o de pollo ha tenido varias limitaciones, ya que el cristalino murino no comparte similitudes sustanciales con el cristalino humano 1,2,3,4, y los cristalinos de pollo han tenido limitaciones en cuanto a eficiencia y estabilidad28.
Al realizar el protocolo, se debe tener mucho cuidado para garantizar la amplificación adecuada de los fragmentos de ADN, la eliminación de los retrovirus, la transfección y la preparación estéril de las cepas virales, ya que la contaminación bacteriana y por levaduras en la microinyección puede causar letalidad a los embriones de pollo7. Para la microinyección en sí, los pasos críticos son la localización correcta del embrión de pollo y la lente junto con el posicionamiento de la micropipeta en la luz de la lente y se debe prestar especial atención para no llenar demasiado la cápsula de la lente durante la inyección. En general, la práctica debe realizarse con una anotación cuidadosa de los sitios anatómicos y se deben preparar huevos adicionales para que el experimento tenga en cuenta el error. Se deben tener en cuenta las anomalías durante el proceso de microinyección, como la ruptura accidental de los vasos sanguíneos, y evitar el uso de esos embriones. Además, se deben tener en cuenta las limitaciones del sistema retroviral RCAS, como su capacidad para crear la expresión ectópica de un gen fuera de una ventana o ubicación establecida, la falta de facilidad para regular el nivel de expresión y, por último, existen limitaciones en el tamaño del inserto, particularmente >2 kb 15,29. Por último, se debe tener cuidado al elegir el momento de la evaluación. En este experimento, seleccionamos hasta el día embrionario 18, que está cerca de la eclosión del huevo, para determinar el impacto general de la expresión génica exógena en el cristalino intacto. Después de la inyección, la tasa de eclosión es muy baja y la mayoría de los embriones no pueden sobrevivir debido a la ruptura de la membrana vitelina.
En conclusión, el uso de este modelo de microinyección de lente de pollo RCAS(A) presenta un sistema altamente efectivo, rápido y personalizable para expresar proteínas exógenas para permitir el diseño y la expresión de proteínas para abordar su función en la fisiología y el desarrollo del cristalino.
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Disclosures
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH): RO1 EY012085 (a J.X.J) y F32DK134051 (a F.M.A.), y la subvención de la Fundación Welch: AQ-1507 (a J.X.J.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Las figuras fueron creadas parcialmente con Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | - | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | - | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | - | - | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | - | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
References
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