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Biology

भ्रूण चिकन लेंस में पुनः संयोजक आरसीएएस (ए) रेट्रोवायरस का माइक्रोइंजेक्शन

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65727
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

Summary

यह प्रोटोकॉल पेपर लेंस विकास के दौरान प्रोटीन के सीटू फ़ंक्शन और अभिव्यक्ति में अध्ययन के लिए एक उपकरण के रूप में आरसीएएस (ए) रेट्रोवायरस के भ्रूण चिकन लेंस माइक्रोइंजेक्शन की कार्यप्रणाली का वर्णन करता है।

Abstract

भ्रूण चिकन (गैलस डोमेस्टिकस) लेंस विकास और शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल है, जो मानव लेंस के साथ समानता की उच्च डिग्री को देखते हुए है। आरसीएएस (ए) एक प्रतिकृति-सक्षम चिकन रेट्रोवायरस है जो विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित करता है, जो प्रारंभिक विकास चरणों में लेंस पुटिका के खाली लुमेन में माइक्रोइंजेक्शन द्वारा लेंस विकास के दौरान जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती प्रोटीन की सीटू अभिव्यक्ति और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करता है, जो इसकी कार्रवाई को आसपास के प्रसार लेंस कोशिकाओं तक सीमित करता है। अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में, जैसे कि ट्रांसजेनिक मॉडल और एक्स विवो संस्कृतियां, आरसीएएस (ए) प्रतिकृति-सक्षम एवियन रेट्रोवायरस का उपयोग चिक भ्रूण में बहिर्जात प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी, तेज और अनुकूलन योग्य प्रणाली प्रदान करता है। विशेष रूप से, लक्षित जीन स्थानांतरण ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों की आवश्यकता के बिना प्रोलिफेरेटिव लेंस फाइबर कोशिकाओं तक सीमित हो सकता है। इस लेख में, हम पुनः संयोजक रेट्रोवायरस आरसीएएस (ए) तैयारी के लिए आवश्यक चरणों का संक्षेप में अवलोकन करेंगे, माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया का एक विस्तृत, व्यापक अवलोकन प्रदान करेंगे, और तकनीक के नमूना परिणाम प्रदान करेंगे।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य आरसीएएस (ए) (प्रतिकृति-सक्षम एवियन सारकोमा / ल्यूकोसिस रेट्रोवायरस ए) के भ्रूण चिकन लेंस माइक्रोइंजेक्शन की पद्धति का वर्णन करना है। एक भ्रूण चिकन लेंस में प्रभावी रेट्रोवायरल डिलीवरी को सामान्य लेंस फिजियोलॉजी, पैथोलॉजिकल स्थितियों और विकास में लेंस प्रोटीन के आणविक तंत्र और संरचना-कार्य के विवो अध्ययन के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में प्रदर्शित किया गया है। इसके अलावा, इस प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और मानव जन्मजात मोतियाबिंद जैसी स्थितियों के लिए दवा स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य लेंस प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक अनुकूलन योग्य मंच के विकास के लिए आवश्यक कदम उठाना है।

भ्रूण के चूजों (गैलस डोमेस्टिकस), लेंस संरचना और मानव लेंस के साथ कार्य में उनकी समानता के कारण, लेंस विकास और शरीर विज्ञान 1,2,3,4 के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल हैं। आरसीएएस (ए) प्रतिकृति-सक्षम एवियन रेट्रोवायरस का उपयोग चिक भ्रूण में बहिर्जात प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी, तेज और अनुकूलन योग्य प्रणाली के रूप में माना जाता है। विशेष रूप से, इसमें ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों की आवश्यकता के बिना लक्ष्य जीन हस्तांतरण को प्रोलिफेरेटिव लेंस फाइबर कोशिकाओं तक सीमित करने की एक अनूठी क्षमता है, अद्वितीय भ्रूण विकास समय सीमा का उपयोग करते हुए जिसमें खाली लेंस लुमेन की उपस्थिति सीटू आरसीएएस (ए) माइक्रोइंजेक्शन को प्रोलिफेरेटिव लेंसफाइबर कोशिकाओं के भीतर बहिर्जात प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रतिबंधित साइट में अनुमति देती है। 6,7,8.

चूजा भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया, यहां गहराई से वर्णित है, मूल रूप से आंशिक रूप से फेकेट एट के काम पर आधारित है। अल.6 और जियांग एट द्वारा आगे विकसित किया गया। और भ्रूण के चूजों 1,9,10,11,12,13 के लेंस में वायरल और नॉनवायरल प्लास्मिड दोनों को पेश करने के साधन के रूप में उपयोग किया गया है। कुल मिलाकर, पिछला काम लेंस विकास, भेदभाव, सेलुलर संचार और रोग की प्रगति का अध्ययन करने और मोतियाबिंद जैसे लेंस रोग स्थितियों के लिए चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज और परीक्षण के लिए इस पद्धति का उपयोग करने की क्षमता को दर्शाता है।

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Protocol

यह अध्ययन प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के सिद्धांतों के अनुसार पशु कल्याण अधिनियम और कार्यान्वयन पशु कल्याण विनियमों के अनुपालन में आयोजित किया गया था। सैन एंटोनियो में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी। प्रोटोकॉल के अवलोकन के लिए, चित्रा 1 देखें; इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों के विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोगात्मक रूपरेखा। प्रोटोकॉल का पहला चरण एक विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन (ओं) का निर्धारण, संबंधित जीन अनुक्रम (ओं) की पहचान, और डीएनए टुकड़ा पीढ़ी है। 2 . एक एडाप्टर वेक्टर में प्रारंभिक क्लोनिंग द्वारा एक रेट्रोवायरल वेक्टर में जीन अनुक्रम (ओं) की क्लोनिंग, 3. इसके बाद एक वायरल वेक्टर। 4. फसल और ध्यान केंद्रित करने के लिए पैकेजिंग कोशिकाओं का उपयोग करके उच्च-टिटर वायरल कणों की तैयारी। 5. अंतिम चरण, और इस प्रोटोकॉल का फोकस, लेंस लुमेन में आरसीएएस (ए) वायरल कणों का चिकन लेंस माइक्रोइंजेक्शन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. उच्च-टिटर पुनः संयोजक रेट्रोवायरस की तैयारी

  1. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) लक्षित प्रोटीन डीएनए टुकड़े बनाने के लिए
    नोट: इस खंड का उद्देश्य लक्ष्य लेंस प्रोटीन के अनुरूप डीएनए अनुक्रम को बढ़ाना है। अधिक जानकारी के लिए, 7,8 देखें।
    1. पीसीआर के लिए प्राइमरों को डिजाइन करना, जो रुचि के प्रोटीन के अनुरूप है, जो फ्लैग एपिटोप अनुक्रम (5'-GACTACAAGGACGATGACAAG-3'), एक स्टॉप कोडन, और एक प्रतिबंध एंजाइम साइट (यानी, ईकोआरआई) के साथ या उसके बिना अपने कार्बोक्सिल टर्मिनी इन-फ्रेम के साथ डीएनए टुकड़े बनाने के लिए डिज़ाइन करता है, जो पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल में उल्लिखित विनिर्देशों के अनुसार पर्याप्त प्रतिबंध एंजाइमों के लिए अनुक्रमों के साथ है। 7,8,10,11.
    2. पीसीआर प्रतिक्रिया10 निष्पादित करें। डिजाइन किए गए प्राइमरों के 100 pmol सेंस और एंटीसेंस को 0.5 μg connexin cDNA (जैसे Cx50, Cx43, या chimeric Cx50 * 43L संयोजन) के साथ पसंद के पीसीआर प्रतिक्रिया बफर में मिलाएं। 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 58 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस से युक्त 30 चक्र ों का प्रदर्शन करें, इसके बाद 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अंतिम विस्तार करें।
    3. जेल शोधन किट के साथ पीसीआर उत्पादों को अलग और शुद्ध करें।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पसंद के प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके शुद्ध पीसीआर उत्पादों को पचाएं।
  2. एडाप्टर प्लास्मिड में डीएनए सम्मिलित की क्लोनिंग
    नोट: एक एडाप्टर वेक्टर में डीएनए टुकड़ों को सम्मिलन आरसीएएस (ए)वेक्टर स्थिरता बढ़ाने के लिए सहायक कोशिकाओं / वायरस की आवश्यकता को समाप्त करता है। अधिक जानकारी के लिए, 7,8 देखें।
    1. चिपचिपा-एंड लिगेशन प्रतिक्रिया का उपयोग करके एक एडेप्टर प्लास्मिड, सीएलए 12एनसीओ में सबक्लोन डीएनए टुकड़े। पीसीआर टुकड़ों को प्रतिबंध एंजाइमों और सीएलए 12एनसीओ के साथ 2-5: 1 अनुपात में मिलाएं। सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करके बंधाव और डीएनए परिवर्तन करें।
    2. डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके डीएनए को अलग करें।
    3. सटीकता सुनिश्चित करने के लिए डीएनए को अनुक्रमित करें।
  3. आरसीएएस (ए) वायरल वेक्टर में क्लोनिंग
    नोट: विकासशील चूजा भ्रूण14,15 में कोशिकाओं में जीन के स्थिर पारगमन के लिए डीएनए टुकड़े एक वाहन (आरसीएएस (ए) रेट्रोवायरस) में डाले जाते हैं। अधिक जानकारी के लिए, 7,8,15 देखें।
    1. सीएलएआई (डीएनए के प्रति 1 μg पर 1 इकाई) के साथ ब्याज युक्त वेक्टर के सीएलए 12एनसीओ-डीएनए टुकड़े को पचाएं और टुकड़ों को जेल-अलग करें।
    2. डीएनए टुकड़ों को सीएलएआई-रैखिक आरसीएएस (ए) प्लास्मिड में सबक्लोन करें। आरसीएएस (ए) प्लास्मिड पर सीएलएआई साइट को अलग करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम एसएएलआई का उपयोग करें।
    3. सीएलएआई और एसएएलआई प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पाचन द्वारा संरचनाओं पर डाले गए टुकड़ों के सही अभिविन्यास की पुष्टि करें।
    4. डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके डीएनए को अलग करें।
    5. डीएनए एकाग्रता निर्धारित करें।
  4. चूजा भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (सीईएफ) कोशिकाओं और आरसीएएस (ए) फसल का अभिकर्मक
    नोट: वायरस पैकेजिंग कोशिकाओं, सीईएफ का उपयोग वायरल कणों15,16 वाले सेल कल्चर मीडिया को प्राप्त करने / कटाई करने के लिए किया जाता है। अधिक जानकारी के लिए, 7,8,15 देखें।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मक एजेंट का उपयोग करके पुनः संयोजक रेट्रोवायरल डीएनए के साथ ट्रांसफॉर्म सीईएफ कोशिकाओं का निर्माण करता है।
    2. रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए संक्रमित कोशिकाओं का पश्चिमी सोख्ता करें।
    3. जब संक्रमित कोशिकाएं कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो सुपरनैटेंट माध्यम को इकट्ठा करना शुरू करें, इसे उचित रूप से संसाधित / फ़िल्टर करें (0.22μm फ़िल्टर का उपयोग करके किसी भी सेलुलर मलबे को हटाने के लिए), और एकाग्रता के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. वायरल स्टॉक की एकाग्रता और टिटरिंग
    नोट: वायरल कणों वाले कोशिकाओं से प्राप्त गोली और मीडिया की बड़ी मात्रा को फ़िल्टर किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, मेजबान कोशिकाओं के खिलाफ वायरस की ताकत स्थापित करने के लिए एक वायरल टिटर परख किया जाना चाहिए। अधिक जानकारी के लिए, 6,7,8,15 देखें।
    1. विषाणुओं से युक्त संस्कृति मीडिया को पिघलाएं।
    2. संस्कृति मीडिया को 72,000 × ग्राम पर 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें।
    3. सतह पर तैरने वाला पदार्थ निकलजाए और अवशिष्ट (~ 50 μL) माध्यम के साथ वायरल गोली को पुन: निलंबित करें और ~ 10 μL वायरल स्टॉक में उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. टिटरिंग के लिए, क्यूटी -6 या सीईएफ कोशिकाओं का उपयोग करके, वायरल स्टॉक के क्रमिक कमजोर पड़ने के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    5. कंफ्लुएंसी के बाद, 4% फॉर्मलाडेहाइड का उपयोग करके कोशिकाओं को ठीक करें।
    6. वायरल गैग प्रोटीन के लिए इम्यूनोस्टेन या टिटर प्राप्त करने के लिए हिस्टोकेमिकल रूप से क्षारीय फॉस्फेट के लिए प्रक्रिया, जिसे (कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों) सीएफयू प्रति मिलीलीटर (सीएफयू / एमएल) के रूप में परिभाषित किया गया है।

Figure 2
चित्रा 2: चिक लेंस माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपकरण और सेटअप । (ए) पी -30 मैनुअल ऊर्ध्वाधर माइक्रोइलेक्ट्रोड माइक्रोपिपेट पुलर। (1) इनसेट एक ग्लास माइक्रोपिपेट को खींचा जा रहा है। (बी) (2) अंडा इनक्यूबेटर। रेट्रोवायरस के इंजेक्शन के लिए चरण 18 (सीलबंद, खाली केंद्रीय लुमेन के साथ) तक पहुंचने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ~ 65-68 घंटे के लिए चिकन अंडे को इनक्यूबेट करें। (सी) माइक्रोइंजेक्शन सेटअप। (3) प्रकाश उपकरण, (4) पिको-इंजेक्टर, (5) विच्छेदन माइक्रोस्कोप, (6) ड्रमंड माइक्रोमैनिपुलेटर, (7) विज़ुअलाइज़ेशन के लिए कंप्यूटर / कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. चिक लेंस माइक्रोइंजेक्शन

  1. आपूर्ति की तैयारी
    1. माइक्रोइंजेक्शन17 के लिए ग्लास माइक्रोपिपेट की तैयारी
      नोट: ग्लास केशिकाओं का उपयोग माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक टिप बिंदु और ~ 11 μm के बाहरी व्यास (OD) के साथ ग्लास माइक्रोपिपेट बनाने के लिए किया जाता है। सेटअप चित्र 2A में दिखाया गया है।
      1. मैनुअल ऊर्ध्वाधर माइक्रोपिपेट पुलर में रबर कुशन क्लिप में बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका संलग्न करें।
      2. गर्मी तापमान (हीट 1) को 950 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और एक पतली और नरम ग्लास केशिका प्राप्त करने के लिए प्रीपुलिंग करें।
      3. गर्मी तापमान (हीट 2) को 790 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और अंतिम माइक्रोपिपेट का उत्पादन करने के लिए एक द्वितीयक पुलिंग करें।
      4. एक माइक्रोपिपेट ग्राइंडर के साथ, टिप खोलने को ~ 11 μm के OD तक तेज करें।
      5. भविष्य के प्रयोगों के लिए, ग्लास माइक्रोपिपेट ्स को ग्लास जार के अंदर स्पंज क्लैंपिंग पैड में रखें।
    2. विकास चरण 18 तक निषेचित अंडे की इनक्यूबेशन
      नोट: लेंस विकास के दौरान, भ्रूण के विकास के ~ 65-68 घंटे पर, लेंस एक्टोडर्म से अलग हो जाता है और एक केंद्रीय लुमेन के साथ एक सील पुटिका बनाता है; प्रोलिफेरेटिव लेंस कोशिकाओं 7,8,18 के लिए प्रतिबंधित अभिव्यक्ति के लिए इस खाली लेंस लुमेन प्राइम में इंजेक्शन।
      1. 37 डिग्री सेल्सियस ह्यूमिडिफाइड रॉकिंग इनक्यूबेटर में ~ 65-68 घंटे के लिए निषेचित चिकन अंडे को इनक्यूबेट करें (चित्रा 2 बी)।
  2. चिकन अंडे का उद्घाटन
    नोट: यह चरण माइक्रोइंजेक्शन के लिए भ्रूण की पहचान और जोखिम का वर्णन करता है। अधिक जानकारी के लिए, 7,8 देखें।
    1. 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र को अच्छी तरह से मिटा दें।
    2. इनक्यूबेटर से अंडे निकालें, उन्हें 70% इथेनॉल के साथ भारी स्प्रे करें, और उन्हें हवा में सूखने दें।
    3. अंडे के बड़े सिरे को ऊपर की ओर रखते हुए, अंडे को एक अंडे धारक पर रखें।
    4. तेज-टूथेड बल की एक जोड़ी का उपयोग करके, अंडे के छिलके पर सावधानीपूर्वक टैप करके और अंडे के खोल के टुकड़ों को हटाकर अंडे के बड़े छोर पर ~ 2 सेमी व्यास का एक छेद उत्पन्न करें (चित्रा 3 ए)।
    5. विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, भ्रूण का पता लगाएं।
    6. एक बार भ्रूण और चूजा लेंस स्थित हो जाने के बाद, भ्रूण के शीर्ष को कवर करने वाले एमनियोनिक झिल्ली को काटने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप और ठीक विच्छेदन बल और कैंची का उपयोग करें (चित्रा 3 बी)।
      नोट: बहुत व्यापक रूप से न काटें (केवल भ्रूण ~ 0.5 सेमी x 0.5 सेमी को उजागर करने के लिए पर्याप्त), अन्यथा भ्रूण जर्दी द्रव्यमान में डूब सकता है; यदि संभव हो तो रक्त वाहिकाओं को छूने से भी बचें।
    7. अगले चरणों की तैयारी में 60 मिमी पेट्री डिश के साथ अंडे के उद्घाटन को कवर करें।
  3. केंद्रित वायरल स्टॉक का माइक्रोइंजेक्शन।
    नोट: पारगमन के लिए लक्ष्य प्रोटीन डीएनए टुकड़े वाले वायरल कणों को लेंस लुमेन के अंदर कोशिकाओं में डाला जाता है। सेटअप चित्रा 2 सी में दिखाया गया है। अधिक जानकारी के लिए, 6,7,8 देखें।
    1. बर्फ पर वायरल स्टॉक स्टॉक को पिघलाएं।
    2. इंजेक्शन के दौरान वायरल स्टॉक के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, 10 μL 10x फास्ट ग्रीन को 10 μL वाले वायरल स्टॉक की एक शीशी में पतला करें।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि बिना घुलित सामग्री का कोई बड़ा हिस्सा नहीं है जो ग्लास माइक्रोपिपेट को रोक सकता है, 10,000 × ग्राम 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड के लिए समाधान को "बड़े हिस्सों" को पेलेट करने के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वालों को नए ट्यूबों में स्थानांतरित करें, जबकि सभी समाधान बर्फ पर रखें।
    4. 35 मिमी x 10 मिमी कल्चर डिश पर, एक फैला हुआ प्रयोगशाला पैराफिल्म रखें और फिल्म के शीर्ष पर 1 μL बाँझ खारा (पीबीएस) जोड़ें (गैर-निष्फल, कवर पक्ष के साथ "साफ" माना जाता है)।
    5. एक तैयार ग्लास माइक्रोपिपेट को स्वचालित पिको-इंजेक्टर से कनेक्ट करें।
    6. एक ग्लास माइक्रोपिपेट में बाँझ खारा (पीबीएस) भरने के लिए फिल मोड दबाएं, और फिर आवंटित 1 μL तरल का परीक्षण करने के लिए इंजेक्शन मोड का उपयोग करें।
    7. एक नए 35 मिमी x 10 मिमी सेल कल्चर डिश की सतह पर एक दूसरा फैला हुआ प्रयोगशाला पैराफिल्म रखें और फिल्म के शीर्ष पर तेजी से हरे रंग के दाग वाले वायरल स्टॉक के 1 μL जोड़ें।
    8. वायरल स्टॉक में माइक्रोपिपेट की नोक को कम करें और ग्लास माइक्रोपिपेट को ~ 1 μL वायरल स्टॉक से भरने के लिए फिल-मॉडल दबाएं।
      नोट: सूखने से बचने के लिए, प्रक्रिया में विराम होने पर भरे हुए माइक्रोपिपेट की नोक को बाँझ खारा (पीबीएस) में डालें।
    9. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की सहायता से भ्रूण लेंस लुमेन के लक्ष्य क्षेत्र में एक स्वचालित इंजेक्टर से जुड़े भरे हुए ग्लास माइक्रोपिपेट को कम करें।
    10. लेंस पुटिका की रूपरेखा के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन को सुनिश्चित करने के लिए प्रकाश स्रोत को समायोजित करें।
      नोट: दाएं लेंस (ऊपर की ओर) के लुमेन का उपयोग आमतौर पर इंजेक्शन के लिए किया जाता है और बाएं (नीचे की ओर) को विपरीत नियंत्रण के रूप में बरकरार रखा जाता है।
    11. एक बार सुनिश्चित होने के बाद कि माइक्रोपिपेट का प्लेसमेंट लेंस लुमेन के अंदर सही स्थान के भीतर है, वायरल स्टॉक के 5-40 एनएल इंजेक्ट करें (चित्रा 3 सी)।
      नोट: इष्टतम इंजेक्शन प्लेसमेंट के लिए अभ्यास बहुत आवश्यक है।
    12. ~ 45 सेकंड तक प्रतीक्षा करें और फिर धीरे से ग्लास माइक्रोपिपेट को हटा दें।
    13. फास्ट ग्रीन डाई की जांच करके विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लेंस लुमेन में सफल माइक्रोइंजेक्शन की जांच करें जो बिना किसी रिसाव के लेंस के खाली लुमेन में रहना चाहिए।
    14. इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद, स्कॉच टेप के साथ अंडे के खोल को सील करें।
    15. भ्रूण को 37 डिग्री सेल्सियस ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में वापस करें, बिना किसी घूर्णन गति के, जब तक कि लेंस विच्छेदन के लिए वांछित भ्रूण की आयु तक नहीं पहुंच जाती।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोइंजेक्शन चूजा तैयारी और योजनाबद्ध । (ए) चिकन अंडे का खुलना। (बी) एमनियोटिक झिल्ली का काटना। (सी) चिकन लेंस लुमेन माइक्रोइंजेक्शन योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

एक विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन (ओं) के निर्धारण और संबंधित जीन अनुक्रम (ओं) की पहचान के बाद, समग्र प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में एक एडाप्टर वेक्टर में प्रारंभिक क्लोनिंग द्वारा रेट्रोवायरल आरसीएएस (ए) वेक्टर में जीन अनुक्रम (ओं) की क्लोनिंग शामिल है, इसके बाद एक वायरल वेक्टर। दूसरा, उच्च-टिटर वायरल कणों को वायरियन की कटाई और ध्यान केंद्रित करने के लिए पैकेजिंग कोशिकाओं का उपयोग करके तैयार किया जाता है। इन पहले दो प्रमुख चरणों को बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है और प्रतिनिधि परिणाम कहीं और प्रस्तुत किए गएहैं 6,7,8,14,16।

इस प्रोटोकॉल के लिए, फोकस का मुख्य क्षेत्र माइक्रोइंजेक्शन का चरण है। इंजेक्शन के समय और लेंस अलगाव के बाद दोनों में प्रोटीन लक्ष्य के डीएनए टुकड़े वाले आरसीएएस (ए) वायरल कणों के सीटू माइक्रोइंजेक्शन की सफलता को निर्धारित करना अनिवार्य है। चित्रा 4 विज़ुअलाइज़ेशन के लिए फास्ट ग्रीन के साथ रंगे वायरल वैक्टर के लेंस लुमेन प्री-और पोस्ट-इंजेक्शन की एक छवि दिखाता है और लेंस लुमेन में उचित स्थानीयकरण की पुष्टि करता है। फास्ट ग्रीन एक उच्च स्तर की सुरक्षा के साथ एक डाई है और अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन द्वारा भोजन, दवाओं और सौंदर्य प्रसाधनों को रंगने के लिए उपयोग किए जाने वाले रंग योजक के रूप में अनुमोदितहै।

चित्रा 5 लक्ष्य प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन दिखाता है, चिमेरिक कॉनेक्सिन सीएक्स 50 * 43 एल, जिसे उच्च-टिटर पुनः संयोजक रेट्रोवायरस में पेश किया गया था, लेंस लुमेन में माइक्रोइंजेक्ट किया गया और मूल्यांकन किया गया। चूंकि चिमेरिक कॉनेक्सिन के सी-टर्मिनी को फ्लैग अनुक्रमों के साथ एपिटोप-टैग किया गया था, इसलिए एंटी-फ्लैग लेबलिंग का उपयोग अंतर्जात लोगों से बहिर्जात कॉनेक्सिन की पहचान करने के लिए किया गया था, मानक धुंधला पद्धति का उपयोग करके, कोरोनल सेक्शन (यहां दिखाया गया है), जैसा कि लियू एट अल 10 में वर्णित है, हालांकि सीएक्स 50 * 43 एल प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीयकृत है, क्योंकि तैयार ऊतक वर्गों के अभिविन्यास के कारण, यह कुछ क्षेत्रों में लेंस के अंदर स्थानीयकृत प्रतीत होता है। इस अध्ययन में, सीएक्स 50 और एक्यूपी0 के इंटरसेलुलर लूप डोमेन के बीच बातचीत का मूल्यांकन किया गया और तदनुसारदाग दिया गया।

Figure 4
चित्रा 4: चिकन लेंस लुमेन में माइक्रोइंजेक्शन का उदाहरण। (ए) लेंस लुमेन में प्रीइंजेक्शन। (बी) लेंस लुमेन में इंजेक्शन के बाद। तीर = इंजेक्शन साइट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोइंजेक्शन और हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन। भ्रूण के विकास के चरण 18 में, जो भ्रूण के विकास के ~ 65-68 घंटे है, एक चिक लेंस के खाली लुमेन में चिमेरिक सीएक्स 50 * 43 एल उत्परिवर्ती युक्त पुनः संयोजक रेट्रोवायरस का एक माइक्रोइंजेक्शन किया गया था। हमने भ्रूण के दिन 18 पर विच्छेदित चिक लेंस के क्रायोसेक्शन की जांच की, जिन्हें फ्लैग (हरा) और एक्यूपी0 (लाल) एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलेबल किया गया था। फ्लोरेसिन-संयुग्मित एंटी-माउस आईजीजी का उपयोग एंटी-फ्लैग के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया गया था, जबकि रोडामाइन-संयुग्मित एंटी-खरगोश आईजीजी का उपयोग एंटी-एक्यूपी0 के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया गया था। इम्यूनोस्टेनिंग का विज़ुअलाइज़ेशन कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया गया था। संबंधित विलय की गई छवियां, जिन्हें "मर्ज" के रूप में लेबल किया गया है, दाईं ओर देखी जा सकती हैं। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रयोगात्मक मॉडल बरकरार लेंस में रुचि के प्रोटीन (ओं) को व्यक्त करने का अवसर प्रदान करता है जिससे लेंस संरचना और कार्य में इन प्रोटीनों की कार्यात्मक प्रासंगिकता का अध्ययन होता है। भ्रूण चिक माइक्रोइंजेक्शन मॉडल आंशिक रूप से फेकेट एट के काम पर आधारित है। अल.6 और जियांग एट द्वारा आगे विकसित किया गया था। और इसका उपयोग वायरल प्लास्मिड और एजेंटों जैसे एगोनिस्ट, छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (सीआरएनए), और पेप्टाइड्स दोनों को चूजों के लेंस में 1,9,10,11,12,13 डालने के साधन के रूप में किया गया है। यह मंच जन्मजात मोतियाबिंद जैसे लेंस रोग स्थितियों के लिए संभावित दवा लक्ष्यों के परीक्षण के साथ-साथ रोग के विकास को ट्रिगर करने वाले तंत्र की जांच के लिए आदर्श है। जैसा कि लेंस पैथोलॉजिकल स्थितियों की हमारी समझ में सुधार होता है और आनुवंशिक या अधिग्रहित उत्परिवर्तन की पहचान की जाती है, यह लागत प्रभावी पशु मॉडल इन स्थितियों के विकास या उत्परिवर्तन के परिणामों के आसपास के अंतर्निहित तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है, जोलेंस स्थितियों के लिए गैर-शल्य चिकित्सा और विश्वसनीय उपचार आहार की बड़ी चिकित्सा आवश्यकता को संबोधित करने में मदद कर सकता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रणाली प्रोटीन असेंबली और एकत्रीकरण के संबंध में जंगली-प्रकार और उत्परिवर्तित प्रोटीन को चिह्नित करने के लिए एक इनविवो सिस्टम प्रदान करती है, जैसा कि हाल ही में वर्णित 1,11 है। इस मॉडल को लेंस से परे व्यापक उपयोग के लिए लागू किया जा सकता है।

आरसीएएस (ए) एक प्रतिकृति-सक्षम एवियन रेट्रोवायरस8 है। भ्रूण चिकन लेंस (लेंस विकास और शरीर विज्ञान 1,2,3,4 के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल) के साथ संयोजन में इसका उपयोग, चूजे के भ्रूण में बहिर्जात प्रोटीन को व्यक्त करने का एक अनूठा और प्रभावी साधन माना जाता है। विकास चरण 18 (~ 65-68 एच भ्रूण विकास) में, लेंस के साथ अद्वितीय चूजा भ्रूण विकास समयरेखा और संरचना को देखते हुए, एक्टोडर्म से अलग होना और केंद्रीय लुमेन के साथ एक सील पुटिका बनाना, यह इस खाली लेंस लुमेन में माइक्रोइंजेक्शन के लिए प्राइम करता है ताकि प्रोलिफेरेटिवलेंस कोशिकाओं 7,8,18 तक अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित किया जा सके।. हालांकि ज्यादातर हमारे उद्देश्य के लिए एक ताकत है, यह विशेष रूप से एक सीमा भी है क्योंकि रेट्रोवायरल इंजेक्शन की प्रकृति के कारण, इस पद्धति के माध्यम से केवल प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को बदल दिया जाता है। रेट्रोवायरस द्वारा अभिकर्मक (इंजेक्शन) एक क्षणिक अभिव्यक्ति नहीं है और बहिर्जात जीन जीनोम में शामिल होते हैं। यह जीन वितरण दृष्टिकोण बहुत प्रभावी है और पिछले डेटा से पता चलता है कि लगभग सभी प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओंको 8,10 संक्रमित किया जा सकता है। विशेष रूप से, हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि अकेले माइक्रोइंजेक्शन लेंस आकृति विज्ञान द्वारा निर्धारित लेंस को स्पष्ट नुकसान नहीं पहुंचाता है और इंजेक्शन1 के बिंदु पर मोतियाबिंद गठन की कमी है।

इस दृष्टिकोण के विपरीत, सुसंस्कृत लेंस कोशिकाओं का उपयोग करके इन विट्रो दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन लेंस फाइबर विकास20,21,22,23,24 के शुरुआती चरणों के पुनर्मूल्यांकन तक सीमित हैं। इसके अतिरिक्त, एक्स विवो लेंस खोज प्रणालियों को व्यापक रूप से लेंस भेदभाव और मोतियाबिंदोजेनेसिस25,26 का अध्ययन करने के साधन के रूप में भी उपयोग किया गया है। यह मॉडल और संबंधित लेंस कैप्सूल कल्चर27, हालांकि शक्तिशाली हैं, सरल ीकृत संस्कृति मॉडल हैं, जिनकी सीमाएं और जटिलताएं उनके इच्छित अनुप्रयोग24,26 के आधार पर हैं। माउस या चिकन लेंस में ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के उपयोग की विभिन्न सीमाएं हैं, जिसमें मुराइन लेंस मानव लेंस 1,2,3,4 के साथ पर्याप्त समानताएं साझा नहीं करता है, और चिकन लेंस की दक्षता और स्थिरता में सीमाएं हैं।

प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय, डीएनए टुकड़ों के पर्याप्त प्रवर्धन, रेट्रोवायरस टाइटरिंग, अभिकर्मक, और वायरल स्टॉक की बाँझ तैयारी सुनिश्चित करने के लिए बहुत सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि माइक्रोइंजेक्शन में बैक्टीरिया और खमीर संदूषण चूजे के भ्रूण के लिए घातकता पैदा करसकता है। माइक्रोइंजेक्शन के लिए, महत्वपूर्ण कदम चूजे के भ्रूण और लेंस का सही स्थानीयकरण है, साथ ही लेंस लुमेन में माइक्रोपिपेट की स्थिति है और इंजेक्शन के दौरान लेंस कैप्सूल को ओवरफिल न करने के लिए सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, अभ्यास शारीरिक साइटों के सावधानीपूर्वक संकेतन के साथ किया जाना चाहिए और त्रुटि के लिए प्रयोग के लिए अतिरिक्त अंडे तैयार किए जाने चाहिए। माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान विसंगतियां, जैसे कि रक्त वाहिकाओं के आकस्मिक टूटने पर ध्यान दिया जाना चाहिए, और उन भ्रूणों के उपयोग से बचा जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, आरसीएएस रेट्रोवायरल सिस्टम की सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जैसे कि एक सेट विंडो या स्थान के बाहर जीन की अस्थानिक अभिव्यक्ति बनाने की क्षमता, अभिव्यक्ति स्तर के विनियमन में आसानी की कमी, और अंत में, डालने के आकार की सीमाएं हैं, विशेष रूप से >2 केबी15,29। अंत में, मूल्यांकन के समय बिंदु को चुनने में सावधानी बरतनी चाहिए। इस प्रयोग में, हमने बरकरार लेंस पर बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति के समग्र प्रभाव को निर्धारित करने के लिए भ्रूण के दिन 18 तक का चयन किया जो अंडे सेने के करीब है। इंजेक्शन के बाद, हैचिंग दर बहुत कम होती है और विटेलिन झिल्ली के विघटन के कारण अधिकांश भ्रूण जीवित नहीं रह सकते हैं।

निष्कर्ष में, इस आरसीएएस (ए) चिकन लेंस माइक्रोइंजेक्शन मॉडल का उपयोग बहिर्जात प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी, तेज और अनुकूलन योग्य प्रणाली प्रस्तुत करता है ताकि लेंस फिजियोलॉजी और विकास में उनके कार्य को संबोधित करने के लिए प्रोटीन के डिजाइन और अभिव्यक्ति की अनुमति मिल सके।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: आरओ 1 EY012085 (जेएक्सजे को) और F32DK134051 (एफएमए को), और वेल्च फाउंडेशन अनुदान: एक्यू -1507 (जेएक्सजे को)। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती हो। आंकड़े आंशिक रूप से Biorender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Filter Corning 431118 For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish FisherScientific 50-202-030 For using during microinjection
Centrifuge Fisherbrand 13-100-676 Spinning down solution
Constructs GENEWIZ - For generation of constructs
Dissecting microscope AmScope SM-4TZ-144A Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers Integrated DNA Technologies - Generation of primers:

Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-50WY Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen For cell culture
Egg Holder - - Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator GQF Manufacturing Company Inc. 1502 For incubation of fertilized eggs
Fast Green Fisher scientific F99-10 For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs Texas A&M University N/A Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone Laboratories For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-095-003 For anti-FLAG  1:500
Forceps FisherScientific 22-327379 For moving things around and isolation
Glass capillaries Sutter Instruments B100-75-10 Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine Invitrogen L3000001 For transfection
Manual vertical micropipette puller Sutter Instruments P-30 To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes FisherScientific 02-682-004 Dissolving solution
Microscope Keyence BZ-X710 For imaging staining
Parafilm FisherScientific 03-448-254 Placing solution
Penicillin/Streptomycin Invitrogen For cell culture
Pico-Injector Harvard Apparatus PLI-100 For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0 Self generated - Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody Rockland Immunichemicals 600-401-383 For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch 111-295-003 For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad Sutter Instruments BX10 For storage of glass micropipette

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References

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माइक्रोइंजेक्शन रिकॉम्बिनेंट आरसीएएस (ए) रेट्रोवायरस भ्रूण चिकन लेंस विकास फिजियोलॉजी पशु मॉडल सीटू अभिव्यक्ति उत्परिवर्ती प्रोटीन प्रारंभिक विकास चरण लेंस पुटिका प्रसार लेंस कोशिकाएं ट्रांसजेनिक मॉडल एक्स विवो कल्चर एवियन रेट्रोवायरस लक्षित जीन ट्रांसफर प्रोलिफेरेटिव लेंस फाइबर कोशिकाएं
भ्रूण चिकन लेंस में पुनः संयोजक आरसीएएस (ए) रेट्रोवायरस का माइक्रोइंजेक्शन
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