Summary
Dette protokollpapiret beskriver metodikken for embryonal kyllinglinsemikroinjeksjon av et RCAS(A) retrovirus som et verktøy for å studere in situ-funksjon og ekspresjon av proteiner under linseutvikling.
Abstract
Embryonal kylling (Gallus domesticus) er en veletablert dyremodell for studier av linseutvikling og fysiologi, gitt sin høye grad av likhet med den menneskelige linsen. RCAS(A) er et replikasjonskompetent kyllingretrovirus som infiserer delende celler, som tjener som et kraftig verktøy for å studere in situ-ekspresjon og funksjon av villtype og mutante proteiner under linseutvikling ved mikroinjeksjon i det tomme lumen av linsevesikkel i tidlige utviklingsstadier, og begrenser virkningen til omkringliggende prolifererende linseceller. Sammenlignet med andre tilnærminger, som transgene modeller og ex vivo-kulturer , gir bruken av et RCAS(A)-replikasjonskompetent aviært retrovirus et svært effektivt, raskt og tilpassbart system for å uttrykke eksogene proteiner i kyllingembryoer. Spesielt kan målrettet genoverføring begrenses til proliferative linsefiberceller uten behov for vevsspesifikke promotorer. I denne artikkelen vil vi kort oversikt over trinnene som trengs for rekombinant retrovirus RCAS (A) forberedelse, gi en detaljert, omfattende oversikt over mikroinjeksjonsprosedyren og gi prøveresultater av teknikken.
Introduction
Målet med denne protokollen er å beskrive metodikken for mikroinjeksjon av embryonale kyllinglinser av et RCAS(A) (replikasjonskompetent aviær sarkom/leukose retrovirus A). Effektiv retroviral levering i en embryonal kyllinglinse har vist seg å være et lovende verktøy for in vivo-studien av den molekylære mekanismen og strukturfunksjonen til linseproteiner i normal linsefysiologi, patologiske forhold og utvikling. Videre kan denne eksperimentelle modellen brukes til identifisering av terapeutiske mål og medikamentscreening for tilstander som humane medfødte katarakt. Alt i alt har denne protokollen som mål å legge ut de nødvendige trinnene for utvikling av en tilpassbar plattform for studier av linseproteiner.
Embryonale kyllinger (Gallus domesticus), på grunn av deres likhet i linsestruktur og funksjon med den menneskelige linsen, er en veletablert dyremodell for studiet av linseutvikling og fysiologi 1,2,3,4. Bruken av et RCAS(A)-replikasjonskompetent aviært retrovirus har blitt ansett som et svært effektivt, raskt og tilpassbart system for å uttrykke eksogene proteiner i kyllingembryoer. Spesielt har den en unik evne til å begrense målgenoverføringen til proliferative linsefiberceller uten behov for vevsspesifikke promotorer, ved hjelp av den unike embryonale utviklingstidsrammen der tilstedeværelsen av tomt linselumen tillater in situ RCAS(A) mikroinjeksjon til det begrensede stedet for ekspresjon av eksogene proteiner i proliferative linsefiberceller5, 6,7,8.
Mikroinjeksjonsprosedyren for kyllingembryo, som er beskrevet grundig her, er opprinnelig delvis basert på Fekete et.s arbeid. al.6 og videreutviklet av Jiang et. al.8 og har blitt brukt som et middel til å introdusere både virale og ikke-virale plasmider i linsen til embryonale kyllinger 1,9,10,11,12,13. Samlet sett demonstrerer det tidligere arbeidet potensialet for å utnytte denne metoden for å studere linseutvikling, differensiering, cellulær kommunikasjon og sykdomsprogresjon, og for oppdagelse og testing av terapeutiske mål for linsepatologiske forhold som grå stær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble gjennomført i henhold til dyrevelferdsloven og gjennomføringsforskriften for dyrevelferd i henhold til prinsippene i veilederen for stell og bruk av forsøksdyr. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas Health Science Center i San Antonio. For en oversikt over protokollen, se figur 1; se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen.
Figur 1: Eksperimentell disposisjon. 1 . Det første trinnet i protokollen er bestemmelsen av et spesifikt målprotein (er), identifisering av tilhørende gensekvens (er) og DNA-fragmentgenerering. 2 . Kloning av gensekvensen(e) til en retroviral vektor ved første kloning til en adaptervektor, 3. etterfulgt av en viral vektor . 4 . Fremstilling av viruspartikler med høy titer ved bruk av pakkeceller for å høste og konsentrere seg. 5 . Det siste trinnet, og fokus for denne protokollen, er kyllinglinsens mikroinjeksjon av RCAS(A) virale partikler i linsens lumen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Fremstilling av rekombinante retrovirus med høy titer
- Polymerasekjedereaksjon (PCR) for å lage målprotein DNA-fragmenter
MERK: Denne delen tar sikte på å amplifisere DNA-sekvensen som tilsvarer mållinseproteinet. For ytterligere detaljer, se 7,8.- Konstruere primere for PCR, tilsvarende proteinet av interesse, for å lage DNA-fragmenter med deres karboksyltermini i rammen med eller uten en FLAG-epitopsekvens (5'-GACTACAAGGACGACGACGATGACAAG-3'), et stoppkodon og et restriksjonsenzymsted (dvs. EcoRI) tilstede i polylinkerregionen til CLa12NCO)) i henhold til spesifikasjonene nevnt i tidligere publiserte protokoller, med sekvenser for tilstrekkelige restriksjonsenzymer1, 7,8,10,11.
- Utfør PCR-reaksjonen10. Kombiner 100 pmol fornuft og antisense av de designede primerne med 0,5 μg connexin cDNA (som Cx50, Cx43 eller kimære Cx50 * 43L-kombinasjoner), til PCR-reaksjonsbufferen du velger. Utfør 30 sykluser, hver bestående av 94 °C i 1 min, 58 °C i 1 minutt og 72 °C i 1 min, etterfulgt av en siste forlengelse i 10 minutter ved 72 °C.
- Isoler og rens PCR-produkter med et gelrensingssett.
- Fordøy de rensede PCR-produktene ved hjelp av restriksjonsenzymer etter eget valg i henhold til produsentens instruksjoner.
- Kloning av DNA-innlegg i adapterplasmid
MERK: Innsetting av DNA-fragmenter i en adaptervektor eliminerer behovet for hjelperceller/virus for å øke RCAS(A)-vektorstabiliteten14. For ytterligere detaljer, se 7,8.- Subklon DNA-fragmenter til et adapterplasmid, Cla12NCO ved hjelp av en klebrig endeligeringsreaksjon. Bland PCR-fragmentene med restriksjonsenzymer og Cla12NCO i forholdet 2-5: 1. Utfør ligering og DNA-transformasjon ved hjelp av kompetente celler.
- Isoler DNA ved hjelp av et DNA-isolasjonssett.
- Sekvenser DNA for å sikre nøyaktighet.
- Kloning i RCAS(A) viral vektor
MERK: DNA-fragmenter settes inn i et kjøretøy (RCAS(A) retrovirus) for stabil transduksjon av et gen til celler i det utviklende kyllingembryoet14,15. For flere detaljer, se 7,8,15.- Fordøy Cla12NCO-DNA-fragmentet av interesseholdig vektor med ClaI (1 enhet per 1 μg DNA) og gelisoler fragmentene.
- Subklon DNA-fragmentene til et ClaI-linearisert RCAS(A)-plasmid. Bruk restriksjonsenzymet SalI for å skille ClaI-stedet på RCAS(A)-plasmidet.
- Bekreft riktig orientering av de innsatte fragmentene på konstruksjonene ved fordøyelse med ClaI- og SalI-restriksjonsenzymer.
- Isoler DNA ved hjelp av et DNA-isolasjonssett.
- Bestem DNA-konsentrasjonen.
- Transfeksjon av kyllingembryonale fibroblastceller (CEF) og RCAS(A) høsting
MERK: Viruspakkeceller, CEF, brukes til å oppnå/høste cellekulturmedier som inneholder viruspartikler15,16. For flere detaljer, se 7,8,15.- Transfekt CEF-celler med rekombinante retrovirale DNA-konstruksjoner ved bruk av transfeksjonsmidlet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Utfør vestlig blotting av de transfekterte cellene for å undersøke deres uttrykk for proteinet av interesse.
- Når de transfekterte cellene når konfluens, begynner du å samle supernatantmediet, behandler/filtrerer det på riktig måte (for å fjerne cellulært rusk ved hjelp av et 0,22 μm filter), og oppbevares ved -80 °C til det er klart for konsentrasjon.
- Konsentrasjon og titering av virale aksjer
MERK: Pelleten og store mengder medier avledet fra cellene som inneholder viruspartiklene må filtreres. I tillegg må en viral titeranalyse utføres for å fastslå virusets styrke mot vertscellene. Du finner mer informasjon i 6,7,8,15.- Tine kulturmediet som inneholder virionene.
- Spinn kulturmediet ved 72 000 × g i 2 timer ved 4 °C.
- Dekanter supernatanten og resuspender viruspelleten med gjenværende (~50 μL) medium og oppbevar ved -80 °C til bruk, i ~10 μL virale lagre.
- For titrering, ved bruk av enten QT-6- eller CEF-celler, transfekt cellene med en seriell fortynning av virusbestandene.
- Post confluency, fikse cellene ved hjelp av 4% formaldehyd.
- Immunflekk for virale gag-proteiner eller prosess for alkalisk fosfatase histokjemisk for å oppnå titeren, definert som (kolonidannende enheter) CFU per milliliter (CFU / ml).
Figur 2: Instrumenter og oppsett for mikroinjeksjon av kyllinglinser . (A) P-30 manuell vertikal mikroelektrodemikropipettetrekker. (1) Innfelt som viser en glassmikropipette som trekkes. (B) (2) Egg inkubator. Inkuber kyllingegg i ~ 65-68 timer i en 37 ° C inkubator for å nå trinn 18 (med et forseglet, tomt sentralt lumen) for injeksjon av retrovirus. (C) Oppsett av mikroinjeksjon. (3) belysningsutstyr, (4) Pico-injektor, (5) dissekere mikroskop, (6) Drummond mikromanipulator, (7) datamaskin / kamera for visualisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Chick linse mikroinjeksjon
- Forberedelse av forsyninger
- Fremstilling av glassmikropipetter til mikroinjeksjon17
MERK: Glasskapillærer brukes til å lage glassmikropipetter med et spisspunkt og en ytre diameter (OD) på ~11 μm for mikroinjeksjon. Oppsettet er vist i figur 2A.- Fest kapillæren av borosilikatglass til de polstrede gummiklemmene i den manuelle vertikale mikropipettavtrekkeren.
- Sett varmetemperaturen (HEAT 1) til 950 °C og utfør fortrekk for å oppnå en tynnere og mykere glasskapillær.
- Still inn varmetemperaturen (HEAT 2) til 790 °C og utfør en sekundær trekking for å produsere endelige mikropipetter.
- Med en mikropipettekvern skjerper du spissåpningen til en OD på ~11 μm.
- For fremtidige eksperimenter, hold glassmikropipettene i en svampklemmepute inne i en glassburk.
- Inkubasjon av befruktede egg til utviklingstrinn 18
MERK: Under linseutvikling, ved ~ 65-68 timer embryonal utvikling, skiller linsen seg fra ektodermen og danner en forseglet vesikkel med et sentralt lumen; Injeksjon i dette tomme linselumenprimtallet for begrenset uttrykk til proliferative linseceller 7,8,18.- Inkuber befruktede kyllingegg for ~ 65-68 h i en 37 ° C fuktet gyngende inkubator (figur 2B).
- Fremstilling av glassmikropipetter til mikroinjeksjon17
- Åpning av kyllingegget
MERK: Dette trinnet beskriver identifisering og eksponering av embryoet for mikroinjeksjon. For ytterligere detaljer, se 7,8.- Tørk av arbeidsområdet grundig med 70% etanol.
- Fjern eggene fra inkubatoren, spray dem tungt ned med 70% etanol, og la dem lufttørke.
- Legg egget, med den største enden av egget vendt oppover, på en eggholder.
- Bruk et par skarptannede tang, produser et hull på ~ 2 cm diameter på den større enden av egget ved å forsiktig tappe på eggeskallet og fjerne fragmenter av eggeskallet (figur 3A).
- Bruk et dissekerende mikroskop, finn embryoet.
- Når embryo- og kyllinglinsen er lokalisert, bruk dissekerende mikroskop og findissekerende tang og saks for å kutte av amnionmembranen som umiddelbart dekker toppen av embryoet (figur 3B).
MERK: Ikke kutt for bredt (bare nok til å eksponere embryoet ~ 0,5 cm x 0,5 cm), ellers kan embryoene synke ned i eggeplommemassen; Unngå også å berøre blodkar, hvis mulig. - Dekk eggets åpning med en 60 mm petriskål som forberedelse til de neste trinnene.
- Mikroinjeksjon av konsentrert virusbestand
MERK: Virale partikler som inneholder målprotein DNA-fragmenter for transduksjon settes inn i celler inne i linsens lumen. Oppsettet er vist i figur 2C. For ytterligere detaljer, se 6,7,8.- Tine de virale aksjene på is.
- For visualisering av virusmaterialet under injeksjon, fortynn 1 μL 10x Fast green til ett hetteglass med viral kraft inneholdende 10 μL.
- For å sikre at det ikke er store biter av uoppløst materiale som kan tette glassmikropipetten, sentrifugerer du oppløsningene i 10 s ved 10 000 × g ved 4 °C for å pelletere "store biter" og overfører supernatantene til nye rør, samtidig som løsningene holdes på is.
- På en 35 mm x 10 mm kulturfat, plasser en strukket laboratorieparafilm og tilsett 1 μL sterilt saltvann (PBS) på toppen av filmen (ikke-sterilisert, med den dekkede siden betraktet som "ren").
- Koble en forberedt glassmikropipette til en automatisk picoinjektor.
- Trykk på fyllmodus for å fylle det sterile saltvannet (PBS) i en glassmikropipette, og bruk deretter injeksjonsmodus for å teste de tildelte 1 μL væske.
- Legg en andre strukket laboratorieparafilm på overflaten av en ny 35 mm x 10 mm cellekulturskål og tilsett 1 μL Fast grønnfargede viruslagre på toppen av filmen.
- Senk spissen av mikropipetten ned i viruslageret og trykk på fyllmodellen for å fylle glassmikropipetten med ~1 μL viruslager.
MERK: For å unngå uttørking, legg spissen av den fylte mikropipetten i steril saltvann (PBS) når det er en pause i prosedyren. - Senk den fylte glassmikropipetten, koblet til en automatisk injektor, inn i målområdet for embryolinsens lumen ved hjelp av et dissekerende mikroskop.
- Juster lyskilden for å sikre klar visualisering av omrisset av linsevesikkelen.
MERK: Lumen i høyre linse (vendt opp) brukes vanligvis til injeksjon, og venstre (vendt ned) holdes intakt som en kontralateral kontroll. - Når du er sikker på at mikropipettens plassering er innenfor riktig sted inne i linsens lumen, injiser 5-40 nL av virusmaterialet (figur 3C).
MERK: Øvelse er svært nødvendig for optimal injeksjonsplassering. - Vent i ~45 s og fjern deretter glassmikropipetten forsiktig.
- Sjekk for vellykket mikroinjeksjon i linsen lumen ved hjelp av dissekere mikroskop ved å undersøke Fast Green fargestoff som skal bo i den tomme lumen av linsen uten lekkasje.
- Etter injeksjonsprosedyren, forsegl eggeskallåpningen med scotch tape.
- Sett embryoet tilbake til den 37 °C fuktede inkubatoren, uten roterende bevegelser, inntil ønsket embryonal alder er nådd for linsedisseksjon.
Figur 3: Microinjection chick prep og skjematisk . (A) Åpning av et kyllingegg. (B) Skjæring av fosterhinnen. (C) Kylling linse lumen mikroinjeksjon skjematisk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter bestemmelse av et spesifikt målprotein (er) og identifisering av tilhørende gensekvens (er), involverer den overordnede eksperimentelle tilnærmingen kloning av gensekvensen (e) til en retroviral RCAS (A) vektor ved den første kloningen i en adaptervektor, etterfulgt av en viral vektor. For det andre fremstilles viruspartikler med høy titer ved hjelp av pakkeceller for å høste og konsentrere virionene. Disse to første hovedtrinnene er i stor grad beskrevet og representative resultater presentert andre steder 6,7,8,14,16.
For denne protokollen er hovedfokusområdet trinnet med mikroinjeksjon. Det er viktig å bestemme suksessen til in situ mikroinjeksjon av RCAS(A) virale partikler som inneholder DNA-fragmenter av proteinmålet av interesse, både på injeksjonstidspunktet og etter linseisolering. Figur 4 viser et bilde av linsens lumen før og etter injeksjon av virusvektorene farget med Fast Green for visualisering og bekreftelse av riktig lokalisering i linselumen. Fast Green er et fargestoff med høy grad av sikkerhet og er godkjent av US Food and Drug Administration som et fargeadditiv som brukes til å farge mat, narkotika og kosmetikk19.
Figur 5 viser den histologiske evalueringen gjennom immunfluorescens av målproteinet, det kimære connexin Cx50*43L, som ble introdusert i høy-titer rekombinante retrovirus, mikroinjisert i linselumen og evaluert. Siden C-terminalene til de kimære connexins var epitopmerket med FLAG-sekvenser, ble anti-flaggmerking brukt til å identifisere de eksogene konnexinene fra de endogene, ved hjelp av standard fargemetodikk, med sagittale og koronale seksjoner (sagittal vist her), som beskrevet i Liu et al.10 Selv om Cx50 * 43L er lokalisert på plasmamembranen, på grunn av orienteringen av de fremstilte vevsseksjonene, Det ser ut til å lokalisere inne i linsen i visse regioner. I denne studien ble interaksjonen mellom det intercellulære sløyfedomenet til Cx50 og AQP0 evaluert og farget tilsvarende10.
Figur 4: Eksempel på mikroinjeksjon i lumen i kyllinglinsen. (A) Preinjeksjon i linselumen. (B) Etter injeksjon i linselumen. Pil = injeksjonssted. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Mikroinjeksjon og histologisk evaluering. På stadium 18 av embryonal utvikling, som er ~ 65-68 timer av embryonal utvikling, ble en mikroinjeksjon av rekombinante retrovirus som inneholder kimær Cx50 * 43L mutant gjort i det tomme lumen av en kyllinglinse. Vi undersøkte kryoseksjonene av kyllinglinser dissekert ut på embryonale dag 18, som var immunmerket med FLAG (grønn) og AQP0 (rød) antistoffer. Fluoresceinkonjugert anti-mus IgG ble brukt til å påvise primære antistoffer mot anti-FLAG, mens rhodaminkonjugert antikanin IgG ble brukt til å påvise primære antistoffer mot anti-AQP0. Visualiseringen av immunfarging ble gjort ved hjelp av konfokal fluorescensmikroskopi. De tilsvarende sammenslåtte bildene, merket som "Merged", kan ses til høyre. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne eksperimentelle modellen gir muligheten til å uttrykke proteinet (e) av interesse i den intakte linsen, noe som fører til studiet av den funksjonelle relevansen av disse proteinene i linsestruktur og funksjon. Den embryonale kyllingmikroinjeksjonsmodellen er delvis basert på Fekete et.s arbeid. al.6 og ble videreutviklet av Jiang et. al.8 og har blitt brukt som et middel til å sette inn både virale plasmider og midler som agonister, lite forstyrrende RNA (siRNA) og peptider i linsen til kyllinger 1,9,10,11,12,13. Denne plattformen er ideell for å undersøke mekanismene som utløser sykdomsutvikling sammen med å teste mulige legemiddelmål for linsepatologiske tilstander som medfødt grå stær. Etter hvert som vår forståelse av linsepatologiske forhold forbedres og genetiske eller ervervede mutasjoner identifiseres, gjør denne kostnadseffektive dyremodellen det mulig å studere de underliggende mekanismene rundt utviklingen av disse tilstandene eller utfallene av mutasjoner, noe som kan bidra til å løse det store medisinske behovet for ikke-kirurgiske og pålitelige behandlingsregimer for linseforhold1. I tillegg tilbyr dette systemet et in vivo-system for å karakterisere villtype og muterte proteiner med hensyn til proteinmontering og aggregering, som nylig beskrevet 1,11. Denne modellen kan brukes til bred bruk utover linsen.
RCAS(A) er et replikasjonskompetent aviært retrovirus8. Dens bruk, i kombinasjon med en embryonal kyllinglinse (en veletablert dyremodell for studiet av linseutvikling og fysiologi 1,2,3,4), regnes som en unik og effektiv måte å uttrykke eksogene proteiner i kyllingembryoer. Gitt den unike kyllingembryonale utviklingstidslinjen og strukturen, med linsen, på utviklingsstadiet 18 (~ 65-68 h embryonal utvikling), som skiller seg fra ektodermen og danner en forseglet vesikkel med et sentralt lumen, primer dette for mikroinjeksjonen i dette tomme linselumen for å begrense ekspresjon til proliferative linseceller 7,8,18. Selv om det for det meste er en styrke for vårt formål, er det også spesielt en begrensning som på grunn av arten av den retrovirale injeksjonen, blir bare proliferative celler endret gjennom denne metoden. Transfeksjonen (injeksjonen) av retrovirus er ikke et forbigående uttrykk, og eksogene gener blir innlemmet i genomet. Denne genleveringsmetoden er svært effektiv, og tidligere data viser at nesten alle proliferative celler kan infiseres 8,10. Spesielt viste våre tidligere studier at mikroinjeksjon alene ikke forårsaker tilsynelatende skade på linsen som bestemt av linsemorfologi og mangel på kataraktdannelse ved injeksjonspunktet1.
I motsetning til denne tilnærmingen kan in vitro-tilnærminger ved bruk av dyrkede linseceller benyttes, men er begrenset til rekapitulering av de tidlige stadiene av linsefiberutvikling 20,21,22,23,24. I tillegg har ex vivo linseeksplanteringssystemer også blitt mye brukt som et middel til å studere linsedifferensiering og kataraktogenese25,26. Denne modellen og relaterte linsekapselkulturer27, men kraftige, er forenklede kulturmodeller, som har begrensninger og kompleksiteter avhengig av deres tiltenkte anvendelse24,26. Bruken av transgene tilnærminger i enten mus eller kylling linse har hatt ulike begrensninger, med murine linse ikke deler vesentlige likheter med den menneskelige linsen 1,2,3,4, og kylling linser har hatt begrensninger i effektivitet og stabilitet28.
Når protokollen utføres, må det utvises stor forsiktighet for å sikre tilstrekkelig amplifisering av DNA-fragmenter, retrovirustittering, transfeksjon og steril fremstilling av viruslagre fordi bakteriell og gjærforurensning i mikroinjeksjon kan forårsake dødelighet for kyllingembryoer7. For selve mikroinjeksjonen er korrekt lokalisering av kyllingembryo og linse avgjørende trinn sammen med mikropipettens plassering i linsens lumen, og man må være nøye med å ikke overfylle linsekapselen under injeksjon. Generelt bør praksis gjøres med nøye notasjon av anatomiske steder, og ekstra egg bør preppes for eksperimentet for å ta hensyn til feil. Anomalier under mikroinjeksjonsprosessen, som utilsiktet ruptur av blodkar, bør noteres, og bruk av disse embryoene unngås. I tillegg bør begrensninger i RCAS retrovirale systemet holdes i tankene, for eksempel dets evne til å skape ektopisk uttrykk for et gen utenfor et bestemt vindu eller sted, mangel på enkel regulering av uttrykksnivået, og til slutt er det begrensninger i størrelsen på innsatsen, spesielt >2 kb15,29. Til slutt bør det utvises forsiktighet ved valg av evalueringstidspunkt. I dette forsøket valgte vi opp til embryonal dag 18 som er nær eggklekking, for å bestemme den totale effekten av eksogent genuttrykk på intakt linse. Etter injeksjon er klekkehastigheten svært lav, og de fleste embryoer kan ikke overleve på grunn av forstyrrelse av vitellinemembranen.
Avslutningsvis presenterer bruken av denne RCAS(A) kyllinglinsemikroinjeksjonsmodellen et svært effektivt, raskt og tilpassbart system for å uttrykke eksogene proteiner for å tillate design og uttrykk av proteiner for å adressere deres funksjon i linsefysiologi og utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (til JXJ) og F32DK134051 (til FMA), og Welch Foundation tilskudd: AQ-1507 (til JXJ). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Figurene ble delvis laget med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | - | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | - | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | - | - | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | - | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
References
- Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
- Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
- Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
- McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
- Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
- Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
- Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
- Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
- Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
- Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Yan, R. T., Wang, S. Z.
- Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
- Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
- Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
- Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
- West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
- Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
- Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
- Hughes, S. H.
