Summary
Detta protokoll beskriver metodiken för embryonal mikroinjektion av ett RCAS(A)-retrovirus som ett verktyg för att studera in situ-funktion och uttryck av proteiner under linsutveckling.
Abstract
Embryonal kyckling (Gallus domesticus) är en väletablerad djurmodell för studier av linsutveckling och fysiologi, med tanke på dess höga grad av likhet med den mänskliga linsen. RCAS(A) är ett replikationskompetent kycklingretrovirus som infekterar celler som delar sig, vilket fungerar som ett kraftfullt verktyg för att studera in situ-uttrycket och funktionen hos vildtypsproteiner och muterade proteiner under linsutveckling genom mikroinjektion i linsvesikelns tomma lumen i tidiga utvecklingsstadier, vilket begränsar dess verkan till omgivande prolifererande linsceller. Jämfört med andra metoder, såsom transgena modeller och ex vivo-odlingar , ger användningen av ett RCAS(A)-replikationskompetent aviärt retrovirus ett mycket effektivt, snabbt och anpassningsbart system för att uttrycka exogena proteiner i kycklingembryon. Specifikt kan riktad genöverföring begränsas till proliferativa linsfiberceller utan behov av vävnadsspecifika promotorer. I den här artikeln kommer vi kortfattat att översiktera de steg som behövs för beredning av rekombinant retrovirus RCAS(A), ge en detaljerad, omfattande översikt över mikroinjektionsproceduren och ge provresultat av tekniken.
Introduction
Målet med detta protokoll är att beskriva metodiken för mikroinjektion av en RCAS(A) (replikationskompetent aviär sarkom/leukosretrovirus A). Effektiv retroviral tillförsel i en embryonal kycklinglins har visat sig vara ett lovande verktyg för in vivo-studier av den molekylära mekanismen och struktur-funktionen hos linsproteiner vid normal linsfysiologi, patologiska tillstånd och utveckling. Dessutom skulle denna experimentella modell kunna användas för identifiering av terapeutiska mål och läkemedelsscreening för tillstånd som medfödd grå starr hos människor. Sammantaget syftar detta protokoll till att fastställa de nödvändiga stegen för utvecklingen av en anpassningsbar plattform för studier av linsproteiner.
Embryonala kycklingar (Gallus domesticus) är, på grund av sin likhet i linsstruktur och funktion med den mänskliga linsen, en väletablerad djurmodell för studier av linsutveckling och fysiologi 1,2,3,4. Användningen av ett RCAS(A)-replikationskompetent aviärt retrovirus har betraktats som ett mycket effektivt, snabbt och anpassningsbart system för att uttrycka exogena proteiner i kycklingembryon. Noterbart är att den har en unik förmåga att begränsa målgenöverföringen till proliferativa linsfiberceller utan behov av vävnadsspecifika promotorer, med hjälp av den unika embryonala utvecklingstidsramen under vilken närvaron av tom linslumen tillåter in situ RCAS(A)-mikroinjektion på det begränsade stället för uttryck av exogena proteiner inom proliferativa linsfiberceller5, 6,7,8.
Mikroinjektionsproceduren för kycklingembryon, som beskrivs ingående här, är ursprungligen delvis baserad på Fekete et:s arbete. al.6 och vidareutvecklades av Jiang et. al.8 och har använts som ett sätt att introducera både virala och icke-virala plasmider i linsen hos embryonala kycklingar 1,9,10,11,12,13. Sammantaget visar det tidigare arbetet potentialen i att använda denna metodik för att studera linsutveckling, differentiering, cellulär kommunikation och sjukdomsprogression, och för upptäckt och testning av terapeutiska mål för linspatologiska tillstånd som grå starr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersökningen har genomförts i enlighet med djurskyddslagen och tillämpningsföreskrifterna för försöksdjur i enlighet med principerna i handboken om skötsel och användning av försöksdjur. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Texas Health Science Center i San Antonio. För en översikt över protokollet, se figur 1; se materialtabellen för detaljer om alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll.
Figur 1: Experimentell disposition. 1 . Det första steget i protokollet är bestämning av ett eller flera specifika målproteiner, identifiering av tillhörande gensekvens(er) och generering av DNA-fragment. 2 . Kloning av gensekvensen eller gensekvenserna till en retroviral vektor genom initial kloning till en adaptervektor, 3. följt av en virusvektor . 4 . Beredning av viruspartiklar med hög titer med hjälp av förpackningsceller för att skörda och koncentrera. 5 . Det sista steget, och fokus för detta protokoll, är kycklinglinsmikroinjektionen av RCAS(A)-viruspartiklarna i linslumen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Beredning av rekombinanta retrovirus med hög titer
- Polymeraskedjereaktion (PCR) för att göra DNA-fragment från målproteiner
OBS: Detta avsnitt syftar till att amplifiera DNA-sekvensen som motsvarar mållinsproteinet. För mer information, se 7,8.- Designa primers för PCR, motsvarande proteinet av intresse, för att göra DNA-fragment med deras karboxylterminaler i ramen med eller utan en FLAG-epitopsekvens (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), ett stoppkodon och ett restriktionsenzymställe (dvs. EcoRI) som finns inuti polylinkerregionen av CLa12NCO)) enligt specifikationerna i tidigare publicerade protokoll, med sekvenser för adekvata restriktionsenzymer1, 7,8,10,11.
- Utför PCR-reaktionen10. Kombinera 100 pmol av förnuft och antisense av de designade primers med 0.5 μg connexin cDNA (såsom Cx50, Cx43 eller chimära Cx50*43L-kombinationer), till den valda PCR-reaktionsbufferten. Utför 30 cykler som var och en består av 94 °C i 1 min, 58 °C i 1 minut och 72 °C i 1 min, följt av en slutlig förlängning i 10 min vid 72 °C.
- Isolera och rena PCR-produkter med ett gelreningskit.
- Smält de renade PCR-produkterna med hjälp av restriktionsenzymer enligt tillverkarens anvisningar.
- Kloning av DNA-insatser i adaptorplasmid
OBS: Insättning av DNA-fragment i en adaptervektor eliminerar behovet av hjälparceller/virus för att öka RCAS(A)-vektorstabiliteten14. För mer information, se 7,8.- Subklona DNA-fragment till en adapterplasmid, Cla12NCO med hjälp av en ligeringsreaktion med klibbiga ändar. Blanda PCR-fragmenten med restriktionsenzymer och Cla12NCO i förhållandet 2-5:1. Utför ligering och DNA-transformation med hjälp av kompetenta celler.
- Isolera DNA med hjälp av ett DNA-isoleringskit.
- Sekvensera DNA för att säkerställa noggrannhet.
- Kloning till virusvektorn RCAS(A)
OBS: DNA-fragment sätts in i en vehikel (RCAS(A) retrovirus) för stabil transduktion av en gen till celler i det växande kycklingembryot14,15. För mer information, se 7,8,15.- Smält Cla12NCO-DNA-fragmentet av den intressanta vektorn med ClaI (1 enhet per 1 μg DNA) och gelisolera fragmenten.
- Subklona DNA-fragmenten till en ClaI-linjäriserad RCAS(A)-plasmid. Använd restriktionsenzymet SalI för att särskilja ClaI-platsen på RCAS(A)-plasmiden.
- Bekräfta den korrekta orienteringen av de insatta fragmenten på konstrukten genom uppslutning med ClaI- och SalI-restriktionsenzymer.
- Isolera DNA med hjälp av ett DNA-isoleringskit.
- Bestäm DNA-koncentrationen.
- Transfektion av kycklingembryonala fibroblastceller (CEF) och RCAS(A)-skörd
OBS: Virusförpackningsceller, CEF, används för att erhålla/skörda cellodlingssubstrat som innehåller viruspartiklar15,16. För mer information, se 7,8,15.- Transfektera CEF-celler med rekombinant retroviralt DNA konstrueras med hjälp av transfektionsmedlet enligt tillverkarens instruktioner.
- Utför western blotting av de transfekterade cellerna för att undersöka deras uttryck av proteinet av intresse.
- När de transfekterade cellerna når sammanflödet, börja samla upp supernatantmediet, bearbeta/filtrera det på lämpligt sätt (för att avlägsna eventuellt cellulärt skräp med ett 0,22 μm filter) och förvara vid -80 °C tills det är klart för koncentration.
- Koncentration och titrering av viruslager
OBS: Pelleten och stora volymer media som härrör från cellerna som innehåller viruspartiklarna måste filtreras. Dessutom måste en viral titeranalys utföras för att fastställa virusets styrka mot värdcellerna. För mer information, se 6,7,8,15.- Tina upp odlingsmedierna som innehåller viruset.
- Centrifugera odlingssubstratet i 72 000 × g i 2 timmar vid 4 °C.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera viruspelleten med restmediet (~50 μL) och förvara vid -80 °C fram till användning, i ~10 μL virusstam.
- För titering, med användning av antingen QT-6- eller CEF-celler, transfekterar cellerna med en seriespädning av virusstammarna.
- Efter sammanflödet, fixera cellerna med 4% formaldehyd.
- Immunfärgning för virala gagproteiner eller process för alkaliskt fosfatas histokemiskt för att erhålla titern, definierad som (kolonibildande enheter) CFU per milliliter (CFU/ml).
Figur 2: Instrument och inställningar för mikroinjektion av kycklinglinser . (A) P-30 manuell vertikal mikroelektrodmikropipettavdragare. (1) Infälld bild av en mikropipett av glas som dras. b) (2) Inkubator för ägg. Inkubera kycklingägg i ~65-68 timmar i en 37 °C inkubator för att nå steg 18 (med en förseglad, tom central lumen) för injektion av retrovirus. (C) Inställning av mikroinjektion. (3) belysningsutrustning, (4) Pico-injektor, (5) dissektionsmikroskop, (6) Drummond-mikromanipulator, (7) dator/kamera för visualisering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Mikroinjektion av kycklinglins
- Förberedelse av förnödenheter
- Beredning av mikropipetter av glas för mikroinjektion17
OBS: Glaskapillärer används för att tillverka glasmikropipetter med en spetspunkt och en ytterdiameter (OD) på ~11 μm för mikroinjektion. Inställningen visas i figur 2A.- Fäst bosilikatglaskapillären på de gummidämpade klämmorna i den manuella vertikala mikropipettavdragaren.
- Ställ in värmetemperaturen (HEAT 1) på 950 °C och utför fördragning för att få en tunnare och mjukare glaskapillär.
- Ställ in värmetemperaturen (HEAT 2) på 790 °C och utför en sekundär dragning för att producera slutliga mikropipetter.
- Slipa spetsöppningen med en mikropipettslipmaskin till en OD på ~11 μm.
- För framtida experiment, förvara glasmikropipetterna i en svampklämdyna inuti en glasburk.
- Ruvning av befruktade ägg fram till utvecklingsstadium 18
OBS: Under linsutvecklingen, vid ~65-68 timmar av embryonal utveckling, separeras linsen från ektodermet och bildar en förseglad vesikel med en central lumen; injektion i denna tomma lins lumen primtal för begränsat uttryck till proliferativa linsceller 7,8,18.- Ruva befruktade hönsägg i ~65-68 timmar i en 37 °C befuktad gunginkubator (Figur 2B).
- Beredning av mikropipetter av glas för mikroinjektion17
- Öppning av hönsägget
OBS: Detta steg beskriver identifiering och exponering av embryot för mikroinjektion. För mer information, se 7,8.- Torka av arbetsområdet noggrant med 70 % etanol.
- Ta ut äggen ur inkubatorn, spraya ner dem kraftigt med 70 % etanol och låt dem lufttorka.
- Placera ägget, med den större änden av ägget uppåt, på en ägghållare.
- Använd en vasstandad pincett för att skapa ett hål med ~2 cm diameter på den större änden av ägget genom att försiktigt knacka på äggskalet och ta bort fragment av äggskalet (Figur 3A).
- Använd ett dissekerande mikroskop för att lokalisera embryot.
- När embryot och kycklinglinsen har lokaliserats, använd dissekeringsmikroskopet och den fina dissekerande pincetten och saxen för att klippa av det amnionmembran som omedelbart täcker embryots ovansida (Figur 3B).
OBS: Skär inte för brett (bara tillräckligt för att exponera embryot ~0.5 cm x 0.5 cm), annars kan embryona sjunka ner i äggulemassan; Undvik också att röra vid blodkärlen, om möjligt. - Täck äggets öppning med en 60 mm petriskål som förberedelse för nästa steg.
- Mikroinjektion av koncentrerad virusstam
OBS: Viruspartiklar som innehåller målprotein-DNA-fragment för transduktion sätts in i celler inuti linslumen. Inställningen visas i figur 2C. För mer information, se 6,7,8.- Tina upp viruslagren på is.
- För visualisering av virusstammen under injektionen, späd 1 μl 10x Fast green i en injektionsflaska med virusstam innehållande 10 μL.
- För att säkerställa att det inte finns några stora bitar av oupplöst material som kan täppa till glasmikropipetten, centrifugera lösningarna i 10 s vid 10 000 × g vid 4 °C för att pelletera "stora bitar" och överföra supernatanterna till nya rör, samtidigt som lösningarna hålls på is.
- Placera en sträckt laboratorieparafilm på en odlingsskål med måtten 35 x 10 mm och tillsätt 1 μl steril koksaltlösning (PBS) ovanpå filmen (icke-steriliserad, med den täckta sidan som "ren").
- Anslut en förberedd glasmikropipett till en automatisk pico-injektor.
- Tryck på fyllningsläget för att fylla den sterila koksaltlösningen (PBS) i en glasmikropipett och använd sedan injektionsläget för att testa den allokerade 1 μL vätska.
- Placera en andra sträckt laboratorieparafilm på ytan av en ny 35 mm x 10 mm cellodlingsskål och tillsätt 1 μl snabbgrönfärgat viruslager ovanpå filmen.
- Sänk ner spetsen på mikropipetten i virusstammen och tryck på fyllningsmodellen för att fylla glasmikropipetten med ~1 μL virusbuljong.
OBS: För att undvika uttorkning, lägg spetsen på den fyllda mikropipetten i steril koksaltlösning (PBS) när det är en paus i proceduren. - Sänk ner den fyllda glasmikropipetten, ansluten till en automatisk injektor, i målområdet för embryolinslumen med hjälp av ett dissektionsmikroskop.
- Justera ljuskällan för att säkerställa tydlig visualisering av konturerna av linsvesikeln.
OBS: Lumen på den högra linsen (vänd uppåt) används vanligtvis för injektion och den vänstra (vänd nedåt) hålls intakt som en kontralateral kontroll. - När du är säker på att mikropipetten är placerad på rätt plats inuti linslumen, injicera 5-40 nL av virusstammen (Figur 3C).
OBS: Övning är mycket nödvändig för optimal injektionsplacering. - Vänta i ~45 s och ta sedan försiktigt bort glasmikropipetten.
- Kontrollera om mikroinjektionen har lyckats i linsens lumen med hjälp av dissekeringsmikroskopet genom att undersöka Fast Green-färgämnet som ska stanna kvar i linsens tomma lumen utan läckage.
- Efter injektionsproceduren, försegla äggskalsöppningen med tejp.
- Sätt tillbaka embryot i den 37 °C fuktade inkubatorn, utan någon roterande rörelse, tills den önskade embryonala åldern för linsdissektion har uppnåtts.
Figur 3: Mikroinjektion av kycklingförberedelse och schematisk bild . (A) Öppning av ett hönsägg. (B) Skärning av fosterhinnan. (C) Mikroinjektionsschema för kycklinglinslumen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter bestämning av ett eller flera specifika målproteiner och identifiering av den eller de tillhörande gensekvenserna innebär den övergripande experimentella metoden kloning av gensekvensen eller gensekvenserna till en retroviral RCAS(A)-vektor genom den första kloningen till en adaptervektor, följt av en virusvektor. För det andra framställs viruspartiklar med hög titer med hjälp av förpackningsceller för att skörda och koncentrera virionerna. Dessa två första stora steg har i stor utsträckning beskrivits och representativa resultat har presenterats på andra ställen 6,7,8,14,16.
För detta protokoll är huvudfokusområdet steget mikroinjektion. Det är absolut nödvändigt att fastställa framgången för in situ mikroinjektion av RCAS(A)-viruspartiklar som innehåller DNA-fragment av proteinmålet av intresse, både vid injektionstillfället och efter linsisolering. Figur 4 visar en bild av linslumen före och efter injektion av de virala vektorerna färgade med Fast Green för visualisering och bekräftelse av korrekt lokalisering i linslumen. Fast Green är ett färgämne med hög grad av säkerhet och är godkänt av US Food and Drug Administration som en färgtillsats som används för att färga mat, läkemedel och kosmetika19.
Figur 5 visar den histologiska utvärderingen genom immunofluorescens av målproteinet, det chimära connexin Cx50*43L, som introducerades i rekombinanta retrovirus med hög titer, mikroinjicerades i linslumen och utvärderades. Eftersom C-terminalerna för de chimära konnexinerna var epitopmärkta med FLAG-sekvenser, användes anti-flaggmärkning för att identifiera de exogena konnexinerna från de endogena, med hjälp av standardfärgningsmetodik, med sagittala och koronala snitt (sagittal visas här), som beskrivs i Liu et al.10 Även om Cx50*43L är lokaliserad på plasmamembranet, på grund av orienteringen av de förberedda vävnadssnitten, Det verkar lokaliseras inuti linsen i vissa regioner. I denna studie utvärderades interaktionen mellan den intercellulära loopdomänen för Cx50 och AQP0 och färgades därefter10.
Figur 4: Exempel på mikroinjektion i kycklinglinslumen. (A) Förinjektion i linslumen. (B) Efter injektion i linslumen. Pil = injektionsställe. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Mikroinjektion och histologisk utvärdering. I stadium 18 av embryonal utveckling, vilket är ~65-68 timmar av embryonal utveckling, gjordes en mikroinjektion av rekombinanta retrovirus innehållande chimär Cx50*43L-mutant i den tomma lumen på en kycklinglins. Vi undersökte kryosektionerna av kycklinglinser som dissekerades ut på embryonal dag 18, som immunmärktes med FLAG (gröna) och AQP0 (röda) antikroppar. Fluoresceinkonjugerat anti-mus-IgG användes för att detektera primära antikroppar mot anti-FLAG, medan rodaminkonjugerat anti-kanin-IgG användes för att detektera primära antikroppar mot anti-AQP0. Visualiseringen av immunfärgning gjordes med hjälp av konfokalfluorescensmikroskopi. Motsvarande sammanfogade bilder, märkta som "Sammanfogade", kan ses till höger. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna experimentella modell ger möjlighet att uttrycka protein(er) av intresse i den intakta linsen, vilket leder till studier av den funktionella relevansen av dessa proteiner i linsens struktur och funktion. Mikroinjektionsmodellen för embryonala kycklingar är delvis baserad på Fekete et:s arbete. al.6 och vidareutvecklades av Jiang et. al.8 och har använts som ett sätt att föra in både virala plasmider och medel såsom agonister, små störande RNA (siRNA) och peptider i linsen på kycklingar 1,9,10,11,12,13. Denna plattform är idealisk för att undersöka de mekanismer som utlöser sjukdomsutveckling tillsammans med att testa möjliga läkemedelsmål för linspatologiska tillstånd som medfödd grå starr. I takt med att vår förståelse av linspatologiska tillstånd förbättras och genetiska eller förvärvade mutationer identifieras, möjliggör denna kostnadseffektiva djurmodell studier av de underliggande mekanismerna kring utvecklingen av dessa tillstånd eller resultaten av mutationer, vilket kan bidra till att tillgodose det stora medicinska behovet av icke-kirurgiska och tillförlitliga behandlingsregimer för linstillstånd1. Dessutom erbjuder detta system ett in vivo-system för att karakterisera vildtypsproteiner och muterade proteiner med avseende på proteinsammansättning och aggregering, som nyligen beskrivits 1,11. Denna modell kan användas för bred användning bortom linsen.
RCAS(A) är ett replikationskompetent aviärt retrovirus8. Dess användning, i kombination med en embryonal kycklinglins (en väletablerad djurmodell för studier av linsutveckling och fysiologi 1,2,3,4), betraktas som ett unikt och effektivt sätt att uttrycka exogena proteiner i kycklingembryon. Med tanke på den unika embryonala utvecklingstidslinjen och strukturen, där linsen, i utvecklingsstadium 18 (~65-68 timmar embryonal utveckling), separeras från ektodermet och bildar en förseglad vesikel med en central lumen, förbereder detta mikroinjektionen i denna tomma linslumen för att begränsa uttrycket till proliferativa linsceller 7,8,18. Även om det mest är en styrka för vårt syfte, är det också en anmärkningsvärd begränsning eftersom på grund av den retrovirala injektionens natur endast proliferativa celler förändras genom denna metod. Transfektionen (injektionen) av retrovirus är inte ett övergående uttryck och exogena gener införlivas i genomet. Denna metod för genleverans är mycket effektiv och tidigare data visar att nästan alla proliferativa celler kan infekteras 8,10. Noterbart är att våra tidigare studier visade att enbart mikroinjektion inte orsakar uppenbar skada på linsen som bestäms av linsmorfologi och avsaknad av kataraktbildning vid injektionsstället1.
I motsats till detta tillvägagångssätt kan in vitro-metoder som använder odlade linsceller användas, men är begränsade till rekapitulation av de tidiga stadierna av linsfiberutveckling 20,21,22,23,24. Dessutom har ex vivo linsexplantationssystem också använts i stor utsträckning som ett sätt att studera linsdifferentiering och kataraktogenes25,26. Denna modell och relaterade linskapselkulturer27, även om de är kraftfulla, är förenklade odlingsmodeller, som har begränsningar och komplexitet beroende på deras avsedda tillämpning24,26. Användningen av transgena metoder i antingen mus- eller kycklinglins har haft olika begränsningar, där den murina linsen inte delar väsentliga likheter med den mänskliga linsen 1,2,3,4, och kycklinglinser har haft begränsningar i effektivitet och stabilitet28.
Vid utförandet av protokollet måste stor försiktighet iakttas för att säkerställa adekvat amplifiering av DNA-fragment, retrovirustittning, transfektion och steril beredning av virusstammar eftersom bakterie- och jästkontaminering vid mikroinjektion kan orsaka dödlighet för kycklingembryon7. För själva mikroinjektionen är de kritiska stegen korrekt lokalisering av kycklingembryot och linsen tillsammans med placering av mikropipetten i linslumen och noggrann uppmärksamhet måste ägnas åt att inte överfylla linskapseln under injektionen. I allmänhet bör övning göras med noggrann notering av anatomiska platser och extra ägg bör förberedas för experimentet för att ta hänsyn till fel. Avvikelser under mikroinjektionsprocessen, såsom oavsiktlig bristning av blodkärl, bör noteras och användning av dessa embryon bör undvikas. Dessutom bör man ha begränsningar i det retrovirala RCAS-systemet i åtanke, såsom dess förmåga att skapa ektopiskt uttryck av en gen utanför ett bestämt fönster eller en viss plats, brist på enkel reglering av uttrycksnivån, och slutligen finns det begränsningar för storleken på insatsen, särskilt >2 kb15,29. Slutligen bör man vara noga med att välja tidpunkt för utvärderingen. I detta experiment valde vi fram till embryonal dag 18, som är nära äggkläckning, för att bestämma den totala effekten av exogent genuttryck på intakt lins. Efter injektionen är kläckningshastigheten mycket låg och de flesta embryon kan inte överleva på grund av störningar i vitellinmembranet.
Sammanfattningsvis presenterar användningen av denna RCAS(A) mikroinjektionsmodell för kycklinglinser ett mycket effektivt, snabbt och anpassningsbart system för att uttrycka exogena proteiner för att möjliggöra design och uttryck av proteiner för att ta itu med deras funktion i linsfysiologi och utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (till J.X.J) och F32DK134051 (till F.M.A), och Welch Foundation-bidrag: AQ-1507 (till J.X.J.). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis National Institutes of Healths officiella åsikter. Figurerna skapades delvis med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | - | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | - | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | - | - | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | - | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
References
- Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
- Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
- Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
- McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
- Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
- Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
- Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
- Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
- Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
- Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Yan, R. T., Wang, S. Z.
- Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
- Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
- Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
- Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
- West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
- Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
- Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
- Hughes, S. H.
