Cette vidéo montre des techniques pour l'étiquetage des cellules souches embryonnaires humaines et des cellules souches mésenchymateuses avec des colorants fluorescents. Cette technique peut être utilisée pour un suivi in vivo des cellules souches transplantées avec l'imagerie optique et des corrélations histopathologiques avec la microscopie à fluorescence.
Imagerie optique (IO) est un outil facile, rapide et peu coûteuse pour la surveillance in vivo de nouvelles thérapies basées sur les cellules souches. La technique est basée sur l'étiquetage ex vivo de cellules souches avec un colorant fluorescent, après injection intraveineuse de cellules marquées et la visualisation de leur accumulation dans les organes cibles spécifiques ou des pathologies. La technique présentée montre comment nous appelons cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) par simple incubation avec le colorant lipophile fluorescent DID (C67H103CIN2O3S) et comment nous l'étiquette des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avec la FDA a approuvé un colorant fluorescent vert d'indocyanine (ICG). Le mécanisme d'absorption se fait par l'adhésion et la diffusion du colorant lipophile travers la bicouche membranaire phospholipidique cellulaire. L'efficacité du marquage est généralement améliorée si les cellules sont incubées avec du colorant dans un milieu sans sérum, par opposition à l'incubation dans le sérum contenant des médias. Par ailleurs, l'ajout de l'agent de transfection sulfate de protamine améliore significativement l'absorption de produit de contraste.
OI est une technique relativement nouvelle imagerie, basée sur la détection de la fluorescence. OI est aussi sensible que les techniques d'imagerie basée sur radiotraceur, mais pas associée à une exposition à l'irradiation. OI fournit un moyen efficace de cellules de suivi de façon non invasive et répétitive, offrant ainsi un aperçu de la migration des cellules vers le site cible. Une limitation majeure de la technique est la pénétration tissulaire limité de sondes fluorescentes in vivo. Ainsi, une accumulation de trace…
Ce projet a été soutenu par une subvention Leon J. Thal SEED du California Institute for Regenerative. Tobias Henning a été financée par une allocation de recherche de l'Association allemande de recherche (DFG, SE 4578/1-2). Nous voulons remercier chaleureusement Meneses Juanito pour ses conseils sur la culture de cellules souches embryonnaires humaines.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
DMSO | Reagent | Sigma | D-2650 | |
D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma | D5648 | |
Gelatin | Reagent | Sigma | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO | 14190-144 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Falcon | 352340 | |
DiD | Reagent | Molecular Probes | V-22887 | |
Knockout DMEM | Reagent | GIBCO | 10829018 | |
Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO | 10828028 | |
b-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | 7522 | |
Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO | 11140050 | |
FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO | 25030081 | |
Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO | 15140-122 | |
Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners Inc. |