Summary
نقدم لعمليتين التصنيع الدقيق من رقائق البوليمر المسامية لزراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد. أول واحد هو النقش الساخنة جنبا إلى جنب مع عملية لحام المذيبات بخار. والثاني يستخدم في عملية وضعت مؤخرا microthermoforming جنبا إلى جنب مع المسار التكنولوجيا أيون مما يؤدي إلى تبسيط كبير من صنعها.
Abstract
باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق هو شرط أساسي لإنشاء السقالات الهندسة استنساخه ونوعية ثابتة للزراعة خلايا ثلاثية الأبعاد. هذه التقنيات توفر مجموعة واسعة من المزايا ليس فقط من أجل التصنيع ولكن أيضا لتطبيقات مختلفة. ويمكن أن يتأثر حجم وشكل مجموعات تتكون من خلية بنية الدقيق واستنساخه من سقالة microfabricated ، وبالتالي ، فإن طول مسار نشر المواد المغذية والغازات يمكن controlled.1 هذا هو بلا شك أداة مفيدة لمنع موت الخلايا المبرمج وتنخر نتيجة لعدم كفاية المواد الغذائية وامدادات الغاز أو إزالة المستقلبات الخلوية الخلايا.
لدينا شرائح البوليمر ، ودعا CellChip ، له أبعاد خارجية من 2 سم 2 × مع microstructured منطقة المركزية. وينقسم هذا المجال إلى مجموعة تصل إلى 1156 مع microcontainers بعدا نموذجية من 300 متر طول الحافة لتصميم مكعب (أو CP - CF - رقاقة) أو قطرها 300 متر وعمق لتصميم الجولة (ص رقاقة). 2
حتى الآن ، تم استخدام النقش ساخنة أو الجزئي حقن صب (بالاشتراك مع شاقة لتشكيل لاحقة من أجزاء) لتصنيع رقائق microstructured. أساسا ، حقن صب الدقيقة هي واحدة من تقنيات البوليمر فقط يستند إلى تكرار ، حتى الآن ، قادرة على انتاج كميات كبيرة من البوليمر microstructures.3 ومع ذلك ، سواء على قيود غير المرغوب فيها تقنيات معينة بسبب معالجة البوليمر لزجة تذوب مع الجيل جدران رقيقة جدا أو متكاملة من خلال الثقوب. في حالة CellChip ، أسفل طبقات رقيقة ضرورية لخرم البوليمر وتقديم مسام صغيرة الحجم لتوفير خلايا محددة مع مثل مستنبت التي نضح ميكروفلويديك من الحاويات.
من أجل التغلب على هذه القيود وخفض تكاليف التصنيع طورنا نهجا جديدا microtechnical على أساس عملية تحجيم باستمرار بالحرارة. لتصنيع المسامية العالية ورقائق البوليمر رقيقة الجدران ، ونحن نستخدم مزيج من الإشعاع الأيوني الثقيلة ، والنقش microthermoforming المسار. في هذا ما يسمى عملية "سمارت" هي المشع (تعديل الركيزة والتكرار من قبل بالحرارة) أفلام رقيقة البوليمر مع القذائف الثقيلة حيوية عدة مئات من إلكترون فولت إدخال ما يسمى ب "المسارات الكامنة" وبعد ذلك يتم تشكيل الفيلم في حالة مرونة المطاط إلى ثلاثة الأبعاد أجزاء دون تعديل أو الصلب المسارات. بعد عملية التشكيل ، انتقائية النقش الكيماوية أخيرا تحويل المسارات إلى المسام اسطواني قطره قابل للتعديل.
Protocol
تسلسل عملية # 1 : النقش الساخنة ، وتصنيع الآلات والمذيبات البخار لحام
يتم نسخ CellChip في تصميمه مكعب بحلول النقش ساخنة أو الجزئي حقن. لهذا ، ونحن نستخدم قالب نحاس مجهريا مع الهندسة العكسية للرقاقة. الحاويات -- مرتبة في مجموعة منتظمة تصل إلى 1156 حاوية -- لديها تصميم مكعب مع طول الحافة من 300 ميكرون. النقش على الساخن ، ويتم تنفيذ عملية النسخ المتماثل على WUM02 التقليدية (Jenoptik Mikrotechnik ، ألمانيا). الأداة تتألف من اثنين من لوحات معدنية دائرية. في خطوة أولى ، يتم وضع صفيحة رقيقة PMMA (Lucryl ، G77Q11 ، BASF) في وسط لوحة أقل من أداة فتح. هي التي شنت centrically إدراج العفن microstructured في اللوحة العلوية. ثم يتم إغلاق أداة لإجلاء من العفن وتسخينها إلى درجة حرارة أعلى من درجة حرارة التحول الزجاجي من البوليمر. عن طريق الضغط على لوحات معا ، هو دفع البوليمر لزج في تجاويف اجلاء حتى تمتلئ تماما أنها تكرار بالضبط هندسة العفن. بعد التبريد الأداة ، يمكن demoulded الجزء microstructured البوليمر. هذه العملية تتطلب المزيد من البوليمر الشامل أكثر مما هو مطلوب فعلا لملء تجاويف القالب. الفائض يشكل طبقة البوليمر المتبقية والتي يمكن استخدامها لتخفيف demoulding الجزء. ومع ذلك ، لخلق مسام قطرها أصغر من 3 ميكرومتر في الجزء السفلي من الحاويات ، وطبقة سميكة المتبقية يجب أن تكون ضعيفة إلى أسفل ، أو حتى إزالتها تماما وحلت محلها غشاء يسهل اختراقها. لتبسيط عملية التكامل المسام ، يتم إزالتها بالكامل الجزء الخلفي من CellChip منسوخة بواسطة طاحونة بالقطع مع الماس. لذلك ، يتم إصلاح الأجزاء على لوحة التركيب وتبريد ، بالإضافة إلى ذلك ، يتم تجميد هياكل هشة في الماء deionised لحمايتها من التلف.
في خطوة عملية الماضي ، المستعبدين أخيرا التجارية ايون المسار محفورا غشاء (البولي ، وسمك 10 ميكرون ، مسام حجم 3 ميكرون ، 2x10 6 المسام / سم ² ، بيبر تصفية شركة محدودة) إلى الجزء الخلفي من مجموعة من حاويات فتحت الآن على حد سواء أعلى وأسفل. عملية التسنيد هو بخار لحام المذيبات عملية تتم في غرفة ، gastight ساخنة [الشكل. 1] ، ويتألف من المكبس العلوي والسفلي لوحة متحركة مع تشوك فراغ متكاملة. 4 يصل إلى أربعة CellChips تشكيله والأغشية المسار محفورا يتعرضون بالتوازي مع مذيب تبخر بعد أن تم اخلاء القاعة. ثم يتم الضغط على أجزاء مقولب والأغشية معا بواسطة المكبس العلوي. بعد فترة قصيرة من التعرض (<15 ق) ، تم إخلاء القاعة من جديد وبالتالي إزالة المذيب. بسبب الوقت القصير الاتصال ، يتم حله إلا بالقرب من سطح المادة ويمكن تجنب تشوه هيكل بالجملة بسبب الحمل الميكانيكية. أخيرا ، يتم فتح الغرفة ويمكن إزالة المذيب CellChips ملحومة وإعدادها للزراعة الخلايا [الشكل. 2].
الشكل 1.
الشكل 2.
تسلسل عملية # 2 : الإشعاع الأيوني الثقيلة ، والنقش على المسار microthermoforming (عملية SMART)
عملية جديدة تسمى SMART هي تقنية تم تطويرها مؤخرا لتصنيع functionalized الصغيرة الغشاء مثل المجهرية. يستند 5 والتكنولوجيا في عملية microtechnical بالحرارة ، ويسمى 'microthermoforming. 6،7 في هذه الخطوة العملية المركزية ، والتي تم تكييفها من العيانية عملية محاصرة ورقة بالحرارة ، ويتم تشكيل ساخن فيلم البوليمر رقيقة خففت الدولة في تقريرها المطاط ، ومرونة عن طريق ضغط الغاز داخل تجويف القالب [الشكل. 3]. على عكس النقش ساخنة أو حقن صب ، وهذه العملية ليست تشكيل الابتدائي وليس ذوبان البوليمر. يرجع ذلك إلى حقيقة أن يتم تشكيل الفيلم لا يزال في حالة صلبة مع تماسك مواد دائمة يمكن ، أولا تعديلات المادة مع قرارات الوحشي عالية يمكن إنشاء مستو على أفلام البوليمر ويتم الحفاظ عليها في جميع مراحل عملية التشكيل. بعد الخطوة microthermoforming ، يمكن زيادة هذه التعديلات بشكل انتقائي معالجتها ، على سبيل المثال ، عن طريق المعالجة الكيميائية الرطبة.
الشكل 3
عملية SMART من حيث المبدأ يتكون من خطوات عملية من ثلاث :
- إنشاء أنماط التعديل إلى حد كبير على حل مستو أفلام البوليمر رقيقة في عملية ما قبل
- 3D حالات العسر الشديدجي من الأفلام التي microthermoforming دون خسارة (المنقوشة) تعديلات
- بعد عملية (اختياري) لfunctionalisation النهائي رقيقة الجدران أجزاء microstructured
عملية SMART نحن نطبق حاليا لتصنيع CellChips مسامية يتضمن الخطوات العملية التالية [الشكل. 4]. غير المشع فيلم البوليمر رقيقة ، على سبيل المثال ، من البولي (Pokalon OG461Gl ، 50 ميكرون ، LoFo عالية التقنية السينمائي محدودة ، ألمانيا) ، مع تسارع الأيونات الثقيلة (مثل XE ، الاتحاد الافريقي أو الأيونات U) في مرافق التسريع من GSI (دارمشتات ألمانيا) مع طاقات تقريبا. 1 جيف وfluences في الترتيب من 106 8 بعد التبريد الأداة ، يمكن demoulded الجزء رقيقة الجدران. ايونات / سم ². عندما يخترق من خلال الفيلم ، كل أيون ينتج درب مستقيم تقريبا من المواد المعدلة ، ودعا المسار الكامنة. ثم يتم حراريا الأفلام قبل المعالجة لمجموعة من microcontainers 25x25 رقيقة الجدران ، مع كل قطر وعمق 300 ميكرون. تتم حاليا عملية النقش على الصحافة الساخنة تعديل [الشكل. 5] ، حيث فرضت البوليمر في الفيلم بين لوحات معدنية اثنين. وقد تم تجهيز اللوحة العلوية مع العفن مجهريا واحد يحتوي على أقل من الضغط والموصلات الكهربائية. ويمتد الفيلم إلى microcavities اجلاء سابقا من العفن بواسطة النتروجين مع ضغط يصل إلى 5 ميغاباسكال. وتشكل هذه الأفلام بالقرب من درجة حرارة التحول الزجاجي منع المسار الصلب.
الشكل 4
الشكل 5
في عملية واحدة آخر ، وحفرت بشكل انتقائي لايون المسارات المسام بغمر المجهرية بأكمله إلى وسيلة النقش المناسب (على سبيل المثال ، 5 مول / لتر هيدروكسيد الصوديوم ، و 10 ٪ ث / MeOH الخامس). من خلال التحكم في أوقات الحفر والنقش على الشروط ، مثل درجة الحرارة ، وتركيز والمواد المضافة الخاصة (على سبيل المثال ، حفر المروجين) ، ويمكن تعديل حجم وشكل المسامات الناتجة [الشكل. 6].
الشكل 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من الأساليب المتبعة في microreplication البوليمر ، مثل حقن صب الجزئي أو النقش الساخنة ، هي مناسبة لإنتاج المجهرية ، فهي ليست فعالة حقا في إنتاج المجهرية مع المسامية متكاملة ورقابة شديدة ، كما هو مطلوب لCellChip. هياكل ضخمة تتطلب على سبيل المثال بالقطع مكلفة للحد من سمك الجدار لثقب الليزر لاحقة أو الجدران لها لتكون بديلا تماما المسار محفورا الأغشية. SMART هي التكنولوجيا الجديدة والواعدة التي يمكن التغلب على هذه المشاكل وغير مناسبة للانتاج بالجملة. وتشمل وجهات نظر تصنيع رقيقة الجدران المجهرية التي تتغذى لفة ، مشابهة لخطوط الإنتاج لقطع العيانية. علاوة على ذلك ، تشكيل لأفلام البوليمر في حالة مرونة المطاط يوفر فرصة ليس فقط لخلق المعرفة في جميع أنحاء المسام الهيكل (بما في ذلك الجدران الجانبية عمودية) ، ولكن أيضا لتوفير المجهرية مع functionalisation حل للغاية ، مثل أنماط السطحية النشطة بيولوجيا ، والطلاء ، وحتى داخل طبولوجيا ، على سبيل المثال لا يكاد يمكن الوصول إليها ، وتسوس الأسنان ميكروفلويديك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر ديرك هيرمان ، يندت أوليفر القرن سيغفريد ، Gutzeit هارتموت وبون يورج لما قدموه من مساعدة كبيرة فيما يتعلق اللحام بخار المذيب. وعلاوة على ذلك ، نود أن نعترف مايكل هارتمان ، Gerwald أليكس ، ودانيال Leisen لما قدموه من مساعدة تقنية.
References
- Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation. J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmüller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Heckele, M., Schomburg, W. K. Review on micro molding of thermoplastic polymers. Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Guber, A. E., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F. Microthermoforming as a novel technique for manufacturing scaffolds in tissue engineering (CellChips. IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 151-157 (2004).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed Microdevices. 8, 191-199 Forthcoming.
- Truckenmüller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips. Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).
- Truckenmüller, R., Giselbrecht, S. Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications. IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).
- Fleischer, R. L., Price, P. B., Walker, R. M. Nuclear tracks in solids. , University of California Press. Berkeley. Forthcoming.
