Biology

입체 세포 배양을위한 칩 크기의 공사장 공중 발판의 Microfabrication

Published: May 12, 2008 doi: 10.3791/699

Stefan Giselbrecht¹, Eric Gottwald¹, Roman Truckenmueller², Christina Trautmann³, Alexander Welle¹, Andreas Guber⁴, Volker Saile⁴, Thomas Gietzelt⁵, Karl-Friedrich Weibezahn¹

¹Institute for Biological Interfaces, Karlsruhe Research Centre, ²Institute for BioMedical Technology, University of Twente, ³Department of Materials Research, Institute for Heavy Ion Research, ⁴Institute of Microstructure Technology, Karlsruhe Research Centre, ⁵Institute for Micro Process Engineering, Karlsruhe Research Centre

Summary

우리는 세 차원 세포 배양을위한 다공성 고분자 칩의 microfabrication 두 가지 프로세스를 제시한다. 첫 번째는 용매 증기 용접 공정과 결합 핫 엠보싱입니다. 두 번째는 생산의 중요한 단순화하기 위해 선도적인 이온 트랙 기술과 함께 최근에 개발된 microthermoforming 프로세스를 사용합니다.

Abstract

microfabrication 기술을 사용하면 입체 세포 배양에 대한 재현성 기하학과 지속적인 품질의 공사장 공중 발판을 만들 수있는 필수 조건이다. 이러한 기술은 제조뿐만 아니라 다양한 애플 리케이션을위한뿐만 아니라 장점을 다양한 스펙트럼을 제공합니다. 형성 세포 클러스터의 크기와 모양은 정확하고 재현할 microfabricated 발판의 건축과, 따라서 영양분과 가스의 확산 경로 길이가이 의심의 apoptosis와 괴사를 예방하기위한 유용한 도구입니다 controlled.1 수에 의해 영향을받을 수 있습니다 불충 분한 영양 및 가스 공급이나 세포 metabolites의 제거에 의한 세포.

CellChip라는 우리의 폴리머 칩, 중앙 microstructured 지역 2 X 2cm의 외부 크기입니다. 이 지역은 최대 입방 디자인 (CP 또는 CF - 칩) 또는 원형 디자인 (R - 칩)에 300m의 직경과 깊이 300 미터 모서리 길이의 전형적인 차원과 함께 1156 microcontainers에의 배열로 세분화됩니다. 2

지금까지, 핫 엠보싱 또는 마이크로 사출 성형은 (부품의 후속 힘드는 가공와 함께) microstructured 칩 제조에 사용되었다. 기본적으로, 마이크로 사출 성형은 지금까지, 그러나 고분자 microstructures.3의 대량 생산 가능합니다, 유일한 폴리머 기반 복제 기법 중 하나이며, 두 기술은 세대와 함께 녹아 점성 고분자의 처리에 의한 특정 원치 않는 제한이 있습니다 매우 얇은 벽이나 구멍을 통해 통합. CellChip의 경우에는 얇은 아래 레이어는 고분자를 구멍과 용기의 microfluidic 재관류에 의해 문화 매체 예와 세포를 공급하기 위해 정의된 크기의 작은 모공을 제공하기 위해 필요합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 우리가 아래쪽 스케일 thermoforming 프로세스에 기초하여 새로운 microtechnical 접근 방식을 개발 제조 비용을 줄이기 위해. 높은 다공성과 얇은 벽의 폴리머 칩의 제조에 대해서는 무거운 이온 조사, microthermoforming 및 추적 에칭의 조합을 사용합니다. 소위 "스마트"과정에서 (Thermoforming에 의해 기판 변경 및 복제) 박막 고분자 필름이 소위를 소개하는 수백 MeV의 에너지 무거운 projectiles와 조사는 "잠재 트랙은"그 후, 고무 탄성 상태에서 영화는 세에 형성된다 트랙을 수정하거나 어닐링없이 차원 부품. 형성 과정 후, 선택적 화학 에칭이 마침내 조정 직경의 원통형 모공에 트랙을 변환합니다.

Protocol

공정 순서 # 1 : 핫 엠보싱, 가공 및 용제 Vapour 용접

그 입방 디자인 CellChip 뜨거운 엠보싱 또는 마이크로 사출 성형에 의해 복제됩니다. 이를 위해, 우리는 칩의 반전 기하학과 micromachined 놋쇠 금형을 사용합니다. 용기 - 1,156 용기까지 정기적으로 배열의 배열은 - 300 μm의 가장자리의 길이와 입방 디자인을했습니다. 핫 엠보싱은 복제 프로세스는 종래의 WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, 독일)에 수행됩니다. 도구는 다음 두 가지 원형의 금속 플레이트로 구성되어 있습니다. 첫 번째 단계에서, 얇은 PMMA 접시 (Lucryl, G77Q11, BASF)는 오픈 도구의 낮은 접시의 중앙에 배치됩니다. microstructured 금형 인서트는 centrically 상단 플레이트에 마운트됩니다. 그런 다음 도구는 금형의 피난을위한 폐쇄 및 폴리머의 유리 전이 온도 이상의 온도로 가열합니다. 그들이 완전히 정확 금형의 지오메 트리를 복제 가득 때까지 함께 번호판을 누르면, 점성 고분자는 대피 충치로 밀고있다. 이 도구를 냉각 후, microstructured 폴리머 부분은 demoulded 수 있습니다. 과정은 실제로 금형 충치를 채우기 위해 필요 이상의 고분자 질량이 필요합니다. 폴리머 수지 흑자는 부품의 demoulding을 완화하는 데 사용할 수있는 잔류 레이어를 형성합니다. 그러나, 컨테이너의 하단에서 3 μm의보다 작은 직경의 모공을 만들려면 두꺼운 잔여 계층 다운 thinned 수 있으며, 심지어는 완전히 다공성 막에 의해 제거 및 교체. 기공 통합 프로세스를 단순화하려면 복제 CellChip의 뒷면이 완전히 다이아몬드 공장과 가공에 의해 제거됩니다. 이 경우, 부품 냉각 장착 플레이트에 고정하고, 또한, 깨지기 쉬운 구조가 손상으로부터 그들을 보호하기 위해 deionised 물에 냉동 있습니다.

마지막 공정 단계에서 마지막으로 상용 이온 트랙 에칭 막가 (폴리 카보 네이트, 두께 10 μm의, 기공 크기 3 μm의, 2x10 ⁶ 모공 / cm ², 파이퍼 필터 GmbH의) 컨테이너의 배열의 뒷면에 접착됩니다 이제 모두 오픈 상단과 하단. 결합 과정은 gastight, 온수 챔버 [그림 공연 용매 증기 용접 과정입니다. 1], 통합된 진공 척과 상단 플런저와 움직일 수있는 낮은 접시의 구성. 최대 네 개까지 가공 CellChips 및 트랙 에칭 점막에 ⁴ 실이 철수 후에 증발 용매에 병렬로 노출되어 있습니다. 그런 다음, 몰드 부품 및 안정은 상단 플런저에 의해 함께 누르면됩니다. 노출 (<15 S)의 짧은 기간 후에 챔버 다시함으로써 용매를 제거 철수입니다. 짧은 접촉 시간으로 인해, 물질 근처에만 표면은 해산되고 의한 기계적 하중에 대한 대량 구조의 변형을 피할 수 있습니다. 마지막으로, 챔버가 열립니다과 용제 용접 CellChips 제거 수 있으며, 세포 배양 [그림 준비. 2].

그림 1.

그림 2.

공정 순서 # 2 : 무거운 이온 조사, microthermoforming 및 트랙 에칭 (스마트 프로세스)

스마트 불리는 새로운 프로세스는 기능화 멤브레인 같은 microstructures 제조를위한 최근 개발된 마이크로 기술입니다. ⁵ 기술의 'microthermoforming'라는 microtechnical thermoforming 프로세스에 따라 달라집니다. 매크로에서 적응되었다이 중앙 처리 단계에서 ^6,7가 시트 thermoforming 프로세스를 갇힌, 온수 얇은 폴리머 필름은 금형 캐비티 [그림으로 가스 압력하여 부드럽게, 고무 탄성 상태에서 형성됩니다. 3]. 핫 엠보싱 또는 사출 성형과는 달리,이 과정은 기본 형성되지 않고 고분자는 용해되지 않습니다. 영화가 영구적인 재료 결합과 고체 상태는 아직 형성한다는 사실 때문에, 높은 수평 해상도와 자료 수정 먼저 평면 폴리머 필름에 생성될 수 있으며, 형성 과정 전반에 걸쳐 보존되어 있습니다. microthermoforming 단계 후, 이러한 수정은 더 이상 선택 서부 유럽 표준시 화학 처리에 의해, 예를 들어, 처리할 수 있습니다.

그림 3

원칙적으로 스마트 프로세스는 세 단계 프로세스로 구성됩니다 :

예비 과정에서 평면 얇은 폴리머 필름에 높은 해결 수정 패턴 생성
3D 샤프의 손실 (패턴) 변경하지 않고 microthermoforming에 의해 영화 주입
얇은 벽으로 둘러싸인 microstructured 부품의 최종 functionalisation에 대한 사후 처리 (옵션)

현재 다공성 CellChips의 제조를 위해 신청하는 스마트 프로세스는 다음 프로세스 단계 [그림이 포함되어 있습니다. 4]. 얇은 폴리머 필름, 폴리 카보 네이트 (Pokalon OG461Gl, 50 μm의, LoFo 하이테크 필름 GmbH를, 독일)에서 예은 (다름슈타트, GSI의 가속기 시설에서 가속 무거운 이온 (예 : XE, 오거나 U 이온 등)로 조사입니다 약 에너지와 함께 독일). 1 GeV 및 도구를 냉각 후 106 ⁸ 순서 fluences은 얇은 벽으로 둘러싸인 부분 demoulded 수 있습니다. 이온 / cm ². 영화를 통해 관통하면 각 이온은 잠재 트랙이라고, 수정된 자료를 거의 직선 흔적을 생산하고 있습니다. 사전 처리 필름은 다음 25x25 얇은 벽으로 둘러싸인 microcontainers, 300 μm의의 직경과 깊이로 각 배열에 thermoformed 수 있습니다. 프로세스는 현재 수정된 핫 엠보싱 프레스 [그림에서 수행됩니다. 폴리머 필름 두 금속판 사이에 고정되어있다 5]. 상부 판은 micromachined 금형을 갖춘 하나의 아래쪽은 압력과 진공 커넥터를 포함합니다. 이 영화는 최대 5 MPA에의 압력으로 질소에 의한 금형의 이전 대피 microcavities으로 뻗어있다. 필름은 어닐링 추적을 방지 그들의 유리 전이 온도 근처에서 형성됩니다.

그림 4

그림 5

후 공정에서 이온 트랙 선택 적절한 에칭 매체 (예, 5 몰 / L NaOH 10 % W / V MeOH)로 전체 미세 구조를 immersing하여 모공에 새겨져 있습니다. 에칭 시간을 조절하는 등 집중, 온도 및 특수 첨가제 (예 : 에칭 발기인)와 같은 조건을 에칭함으로써, 결과 모공의 크기와 모양은 [그림을 조정할 수 있습니다. 6].

그림 6

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Discussion

이러한 마이크로 사출 성형 또는 핫 엠보싱과 같은 폴리머 microreplication, 설립 방법 microstructures 제작에 적합하지만, 그들은 CellChip 필요합니다로 통합되고 고도의 제어 다공성과 microstructures 생산에 정말 효과가 없습니다. 대형 구조물 등 후속 레이저 천공을위한 벽 두께를 줄이기 위해 비싼 가공을 필요로하거나 벽 완전히 트랙 에칭 세포막으로 대체해야합니다. SMART는 이러한 문제를 극복하고 대량 생산에 적합한 수있는 새로운 유망 기술입니다. 관심이 매크로 부품 생산 라인과 비슷한 롤 먹이로 얇은 벽으로 microstructures 제조 있습니다. 또한, 고무 탄성 상태에서 고분자 필름의 형성, 모든 구조 (수직 측면 벽 포함) 이상의 정의 모공을 만들지만, 또한 bioactive 표면 패턴, 코팅으로 매우 해결 functionalisation와 microstructures를 제공할뿐만 아니라 기회를 제공합니다 심지어 내부 토폴로지 거의 접근, 예를 들어, microfluidic 충치.

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Acknowledgments

저자는 용매 증기 용접에 관한 자신의 실질적인 도움을 더크 허만, 올리버 웬트, 지그프 리드 호른, 하르트무트 Gutzeit 및 Joerg 본 감사하고 싶습니다. 또한, 우리는 그들의 기술 지원에 대한 마이클 하트만, 알렉스 Gerwald, 그리고 다니엘 Leisen을 인정하고 싶습니다.

References

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