Mikrofabrikation av Chip-storlek Byggnadsställningar för tredimensionell cellodling

Summary

Vi presenterar två processer för mikrofabrikationslaboratorier av porösa polymera marker för tredimensionell cellodling. Den första är varmpressning kombineras med en lösningsmedelsångor svetsning. Den andra använder en nyligen utvecklad microthermoforming processen kombinerat med ion spåret teknik som leder till en betydande förenkling av tillverkningen.

Abstract

Använda mikrofabrikation teknik är en förutsättning för att skapa byggnadsställningar av reproducerbar geometri och jämn kvalitet för tredimensionell cellodling. Dessa teknologier erbjuder ett brett spektrum av fördelar inte bara för tillverkning, utan också för olika tillämpningar. Storleken och formen på bildade cell kluster kan påverkas av den exakta och reproducerbara arkitektur mikrofabricerade schavotten och därför kan spridningen väglängd av näringsämnen och gaser vara controlled.1 Detta är utan tvekan ett användbart verktyg för att förhindra apoptos och nekros av celler på grund av en otillräcklig näring och gasförsörjning eller borttagning av cellulära metaboliter.

Vår polymer-chip, så kallade CellChip har det yttre dimensionerna 2 x 2 cm med en central mikrostrukturerad område. Detta område är indelat i en rad upp till 1156 microcontainers med en typisk dimension av 300 m kant längd för kubiska design (CP-eller CF-chip) eller 300 m diameter och djup för de runda design (r-chip). 2

Hittills har varmpressning eller mikro formsprutning (i kombination med efterföljande mödosamma bearbetning av de delar) som används för tillverkning av mikrostrukturerad chips. I grunden är mikro formsprutning en av de enda polymerbaserade replikering tekniker som, hittills, har kapacitet för massproduktion av polymerer microstructures.3 Men båda teknikerna har vissa oönskade begränsningar på grund av behandlingen av en trögflytande polymer smälter med den generation av mycket tunna väggar eller integrerade genom hål. I händelse av CellChip, tunn botten skikt är nödvändiga för att perforera polymer och ge små porer definierade storlek att förse cellerna med odlingsmedium t.ex. genom mikroflödessystem perfusion av behållarna.

För att övervinna dessa begränsningar och att minska tillverkningskostnaderna har vi utvecklat en ny microtechnical tillvägagångssätt på grundval av en ned-skalas varmformning process. För tillverkning av mycket poröst och tunnväggiga polymer marker använder vi en kombination av tunga joner bestrålning microthermoforming och spår etsning. I denna så kallade "SMART"-processen (substrat Ändring och replikering av Varmformning) tunn polymerfilm bestrålas med energiska tunga projektiler av flera hundra MeV att införa så kallade "latenta spår" Därefter är filmen i ett gummi elastiskt tillstånd formats till tre dimensionella delar utan att ändra eller glödgning spåren. Efter formningsprocessen, omvandlar selektivt kemisk etsning slutligen spår i cylindriska porer justerbar diameter.

Protocol

Process Sekvens # 1: varmpressning, maskinbearbetning och lösningsmedel Ångor Svetsning

Den CellChip i kubik design är replikeras av varmpressning eller mikro formsprutning. För detta använder vi en micromachined mässing form med inversen geometri chip. Behållarna - ordnade i ett regelbundet utbud av upp till 1156 containers - har en kubisk design med en kant längd av 300 ìm. För varmpressning är replikering process som utförs på en konventionell WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Tyskland). Verktyget består av två runda metallplattor. I ett första steg, är en tunn PMMA platta (Lucryl, G77Q11, BASF) placeras i mitten av den nedre plåten för den öppnade verktyget. Den mikrostrukturerad mögel insatsen är centriskt monterad i den övre plattan. Då verktyget är stängt för evakuering av mögel och upphettas till en temperatur över glasningstemperaturen av polymeren. Genom att trycka på plattorna ihop, är den trögflytande polymeren skjuts in i evakuerade håligheter tills de är helt fyllda exakt replikera geometri formen. Efter kylning verktyget kan mikrostrukturerad polymer delen demoulded. Processen kräver mer polymer massa än vad som faktiskt behövs för att fylla formen hålrum. Polymeren överskottet bildar en återstående lager som kan användas för att underlätta avformning av den del. Men för att skapa porer med en diameter mindre än 3 mikrometer i botten av behållarna har tjockt kvarvarande lagret förtunnas ner, eller helt tas bort och ersättas av ett poröst membran. För att förenkla processen att pore integration, är baksidan av den replikerade CellChip helt avlägsnas genom bearbetning med en diamant kvarn. För detta är de delar fästa på en kyld monteringsplatta och dessutom är den bräckliga strukturer frysta i avjoniserat vatten för att skydda dem mot skador.

I ett sista processteg, är äntligen en kommersiell jon spår-etsade membran (polykarbonat, tjocklek 10 mikrometer, porstorlek 3 mikrometer, 2x10 ⁶ porer / cm ², Pieper Filter GmbH) bundna till baksidan av arrayen av containrar nu öppnat både på topp och botten. Limning processen är en lösningsmedelsångor svetsprocess utförs i en gastät, uppvärmd kammare [Fig.. 1], bestående av en övre kolven och en flyttbar nedre plattan med en integrerad vakuum chuck. ⁴ Upp till fyra bearbetade CellChips och spår-etsade membran utsätts parallellt med en förångas lösningsmedel efter kammaren evakuerades. Sedan är de gjutna delarna och membran pressas samman av den övre kolven. Efter en kort tids exponering (<15 s), är kammaren evakueras igen fritas från lösningsmedel. På grund av den korta kontakttiden är bara yta nära materialet upplöstes och en deformation av bulk struktur på grund av den mekaniska belastningen kan undvikas. Slutligen är kammaren öppnas och lösningsmedlet svetsade CellChips kan tas bort och förberedd för cellodling [Fig.. 2].

Figur 1.

Figur 2.

Process Sequence # 2: Heavy Ion bestrålning, microthermoforming och spåra etsning (SMART-processen)

Den nya processen kallas SMART är ett nyligen utvecklat mikro teknik för tillverkning av functionalized membran-liknande mikrostruktur. ⁵ Tekniken bygger på en microtechnical varmformning process, som kallas "microthermoforming". ^6,7 I denna centrala process steg, som var anpassad från makroskopiska fångade plåt varmformning process, är en uppvärmd tunn polymerfilm som bildas i sin mjuka, gummi elastisk tillstånd genom att gastrycket i en form hålighet [Fig.. 3]. Till skillnad från varmpressning eller formsprutning, är denna process inte en primär formning och polymeren inte smält. Eftersom att filmen bildas fortfarande i en fast form med en permanent material sammanhållning, kan väsentliga ändringar med höga laterala upplösning först genereras på plana polymerfilm och bevaras under hela formningsprocessen. Efter microthermoforming steg, kan dessa ändringar ytterligare selektivt bearbetas, t.ex. genom våtkemisk behandling.

Figur 3

SMART-processen i princip består av tre processteg:

1. skapandet av mycket löst modifiering mönster på plana tunna polymerfilm i en pre-process
2. 3D Shapning av filmer av microthermoforming utan förlust av (mönstrade) ändringar
3. post-processen (tillval) för en sista functionalisation av tunnväggiga mikrostrukturerad delar

SMART process vi tillämpar för närvarande för tillverkning av porösa CellChips omfattar följande processteg [Fig.. 4]. En tunn polymerfilm, t.ex. från polykarbonat (Pokalon OG461Gl, 50 ìm, LoFo High Tech Film GmbH, Tyskland), bestrålas med accelererad tunga joner (t.ex. Xe, Au eller U joner) i acceleratoranläggningar av GSI (Darmstadt, Tyskland) med energier på ca. 1 GeV och fluences i storleksordningen 106 ⁸ Efter kylning verktyget kan tunnväggiga delen demoulded. joner / cm ². Då tränger genom filmen, producerar varje jon en nästan rak spår av modifierade material, som kallas latent spår. Det förbehandlade filmer är sedan termoformade till en rad 25x25 tunnväggiga microcontainers, vardera med en diameter och djup av 300 ìm. Processen är för närvarande utförs på en modifierad heta relieftryck [Fig.. 5], där polymerfilm kläms mellan två metallplattor. Den övre plattan är försedd med micromachined mögel och den nedre en innehåller trycket och kontakter vakuum. Filmen är sträckt i tidigare evakuerade microcavities av formen av kväve med ett tryck på upp till 5 MPa. Filmerna bildas i närheten av sina glasningstemperatur förhindra spåret glödgning.

Figur 4

Figur 5

I en post-process är de jon spåren selektivt etsat till porerna genom att sänka ner hela mikrostrukturen i ett lämpligt etsning medium (t.ex., 5 mol / l NaOH, 10% w / v MeOH). Genom att kontrollera etsning tider och etsning villkor, såsom koncentration, temperatur och speciella tillsatser (t.ex. etch initiativtagare), kan storleken och formen på den resulterande porerna justeras [Fig.. 6].

Figur 6

Discussion

Även etablerade metoder av polymera microreplication, såsom mikro formsprutning eller varmpressning, lämpar sig för framställning mikrostrukturer är de inte riktigt effektiva i att producera mikrostrukturer med en integrerad och mycket kontrollerad porositet, som behövs för CellChip. Skrymmande strukturer kräver t.ex. kostsamma bearbetning för att minska väggtjockleken för en efterföljande laserperforering eller väggar måste vara helt ersättas av spår-etsade membran. SMART är ett nytt och lovande teknik som kan lösa dessa problem och är lämplig för massproduktion. Perspektiv omfattar tillverkning av tunnväggiga mikrostrukturer med namnupprop matas, liknande produktionslinjer för makroskopiska delar. Dessutom erbjuder utformningen av polymerfilm i en gummi elastiskt tillstånd chansen att inte bara skapa definierade porerna hela strukturen (inklusive vertikala sidoväggar) men också att ge microstructures med en mycket löst functionalisation, såsom bioaktiva ytmönster, beläggningar, och topologier även inne knappast tillgänglig, t.ex. mikroflödessystem hålrum.