Summary
Biz, üç-boyutlu hücre kültürü için gözenekli polimer cips mikroimalat için iki süreç sunuyoruz. Bunlardan birincisi, solvent buhar kaynak işlemi ile birlikte sıcak kabartma. Ikincisi ise, kısa bir süre önce geliştirilen iyon izleme teknolojisi ile üretim önemli bir basitleştirme giden kombine microthermoforming süreci kullanır.
Abstract
Mikroimalat teknolojileri kullanarak, üç-boyutlu hücre kültürü için tekrarlanabilir geometri ve sürekli kalite iskeleleri oluşturmak için bir ön koşuldur. Bu teknolojiler sadece üretim için değil, aynı zamanda farklı uygulamalar için avantajları çok geniş bir yelpaze sunuyoruz. Oluşan hücre kümeleri boyutu ve şekli, kesin ve tekrarlanabilir microfabricated iskele mimarisi ve bu nedenle, besin ve gaz difüzyon yolu uzunluğu Bu tartışmasız apoptoz ve nekroz önlemek için yararlı bir araçtır controlled.1 olabilir etkilemiş olabilir Yetersiz besin ve gaz kaynağı ya da hücresel metabolitleri kaldırılması nedeniyle hücreler.
CellChip olarak adlandırılan polimer çip, microstructured merkezi bir alana sahip 2 x 2 cm dış boyutları vardır. Bu alan, kübik tasarımı (cp-cf-chip) ya da yuvarlak tasarımı (r-chip) için 300 m çapında ve derinliği 300 m kenar uzunluğu tipik bir boyut ile 1156 microcontainers kadar bir dizi bölünmüştür. 2
Şimdiye kadar, sıcak kabartma veya mikro enjeksiyon kalıplama (sonraki zahmetli işleme parçaları ile birlikte) microstructured yongalarının üretiminde kullanılmıştır. Temel olarak, mikro enjeksiyon Ancak, bugüne kadar polimer microstructures.3 seri üretim kapasitesine sahip, tek bir polimer esaslı çoğaltma teknikleri, her iki tekniğin nesil eritebilir viskoz bir polimerin işlenmesi nedeniyle bazı istenmeyen sınırlamalar var , çok ince duvarlar veya deliklerden entegre. CellChip durumda, ince alt katmanları polimer perfore ve tanımlanan boyutu küçük gözenekleri konteyner mikroakışkan perfüzyon kültür ortamı, örneğin hücre kaynağı sağlamak için gereklidir.
, Bu sınırlamaları aşmak için ve aşağı ölçekli termoform sürecinin temelinde yeni mikroteknik bir yaklaşım geliştirdik üretim maliyetleri azaltmak için. Çok gözenekli ve ince duvarlı polimer çiplerin üretim için, ağır iyon ışınlama, microthermoforming ve parça gravür bir kombinasyonunu kullanabilirsiniz. Bu sözde "SMART" sürecinde sözde tanıtan birkaç yüz MeV enerjik ağır mermiler ile ışınlanmış (Yüzey Ve Değişiklik Termoform tarafından çoğaltma) ince polimer film "gizli parça" Daha sonra, kauçuk elastik devlet film üçe oluşur boyutlu parça parça değiştirerek veya tavlama olmadan. Şekillendirme işleminden sonra, seçici kimyasal aşındırma nihayet, ayarlanabilir çaplı silindirik gözeneklerin içine parça dönüştürür.
Protocol
İşlem Sırası # 1: Sıcak Kabartma, Talaşlı İmalat ve Solvent Buhar Kaynak
Kübik tasarımı CellChip sıcak kabartma veya mikro enjeksiyon ile çoğaltılır. Bunun için çip ters geometri Mikroişlenmiş pirinç kalıp kullanın. Konteynerleri - 1156 kaplar kadar düzenli bir dizi düzenlenen bir kenar uzunluğu 300 mm olan bir küp tasarımı var. Sıcak kabartma için geleneksel bir WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Almanya), çoğaltma işlemi yapılır. Aracı iki yuvarlak metal plaka oluşur. İlk adım olarak, ince bir PMMA plaka (Lucryl, G77Q11, BASF) açılan aracın alt plaka merkezinde yer almaktadır. Microstructured kalıp eklemek merkez üst plaka monte edilir. Sonra aracı kalıp tahliye için kapalı ve polimerin camsı geçiş sıcaklığı üzerinde bir sıcaklığa kadar ısıtılır. Plakalar birlikte basarak, tam kalıp geometrisi kopyalayan tamamen dolana kadar viskoz polimer tahliye boşlukları içine itilir. Aracı Soğuduktan sonra, microstructured polimer parçası demoulded olabilir. Bu süreç aslında kalıp boşlukları doldurmak için gerekli olan daha fazla polimer kitle gerektirir. Polimer fazlalık parça kalıptan çıkarma kolaylığı için kullanılabilir kalan bir tabaka oluşturur. Ancak, konteynerlerin altında 3 mm daha küçük çaplı gözenekler oluşturmak için, kalın kalan tabaka inceltilerek, hatta tamamen gözenekli bir zar ile kaldırılır ve yerine. Gözenek entegrasyon sürecini kolaylaştırmak için, çoğaltılmış CellChip tamamen geri bir elmas değirmeni ile işleme tarafından kaldırılır. Bunun için, parça soğutmalı bir montaj plakası sabit ve buna ek olarak, kırılgan yapıları hasara karşı onları korumak için deiyonize su dondurulur.
Bir son süreç adım, nihayet bir ticari iyon parça-kazınmış membran (polikarbonat, kalınlığı 10 mikron gözenek boyutu 3 mm, 2x10 6 gözenekleri / cm ², Pieper Filtre GmbH) konteyner dizinin arkasına yapıştırılır. Şimdi hem de açıldı üst ve alt. Yapıştırma işlemi, gaz geçirmez, ısıtmalı hazneli [Şekil yapılan solvent buhar kaynak işlemidir. 1], entegre bir vakum mandreni ile bir üst piston ve hareketli bir alt tablası oluşan dört işlenmiş CellChips ve track-kazınmış membranlar 4 odanın tahliye edildikten sonra buharlaşarak çözücü paralel olarak maruz kalmaktadır. Daha sonra üst piston, kalıp parçaları ve membranlar birlikte bastırılır. Pozlama (<15 s) kısa bir süre sonra tekrar böylece solvent kaldırma, oda boşaltıldı. Kısa temas süresi nedeniyle, sadece yüzey malzemesi yakın çözülür ve toplu yapı nedeniyle mekanik yük deformasyon önlenebilir. Son olarak, oda açıldı ve solvent kaynaklı CellChips silinebilir ve hücre kültürü [Şekil için hazırlanmıştır. 2].
Şekil 1.
Şekil 2.
İşlem Sırası # 2: ağır iyon ışınlama, microthermoforming ve parça gravür (SMART süreci)
SMART olarak adlandırılan yeni bir süreç Fonksiyonlu membran benzeri mikro üretim için son zamanlarda geliştirilen mikro teknoloji 5 'microthermoforming' adında bir mikroteknik termoform süreç, teknoloji tabanlı. Makroskopik uyarlanan bu merkezi işlem adımında 6,7 , sac termoform işlemi sıkışıp, ısıtmalı ince polimer film, kalıp boşluğuna [Şekil içine gaz basıncı ile yumuşatılmış, kauçuk elastik devlet oluşur. 3]. Sıcak kabartma veya enjeksiyon aksine, bu sürecin birincil bir oluşum değildir ve polimerin eritilerek değildir. Film kalıcı bir malzeme uyum hala sağlam bir devlet oluşmuş olduğu gerçeği nedeniyle, yüksek yanal kararları malzeme modifikasyonlar düzlemsel polimer filmlerin ilk oluşturulur ve şekillendirme süreci boyunca korunur. Microthermoforming adımdan sonra, bu değişiklikler daha seçici ıslak kimyasal arıtma, örneğin, işlenmiş olabilir.
Şekil 3
SMART ilkesine süreci üç süreç adımları oluşur:
- bir ön işlem düzlemsel ince polimer film çok çözülmesi değişiklik desen oluşturma
- 3D Shapkaybı (desenli) değişiklikler olmadan microthermoforming filmlerin ing
- son bir fonksiyonelleştirilmesi, ince duvarlı microstructured parçalar için işlem sonrası (isteğe bağlı)
SMART süreci şu anda gözenekli CellChips fabrikasyon için başvuran, aşağıdaki işlem adımları [Şekil içerir. 4]. Ince polimer film, örneğin, polikarbonat (Pokalon OG461Gl, 50 mikron, LoFo High Tech Film GmbH, Almanya), (Darmstadt, GSI hızlandırıcı tesislerinde hızlandırılmış ağır iyonları (örneğin Xe, Au veya U iyonları gibi) ile ışınlanmış yaklaşık enerjiler ile Almanya). 1 GeV ve aracı soğutma sonra 106 8 amacıyla fluence, ince duvarlı bir parçası demoulded olabilir . iyonları / cm ² 'dir. Film aracılığıyla nüfuz zaman, her iyon gizli track denilen değiştirilmiş materyalinin neredeyse düz bir iz üretir. Önişlemden filmler sonra 25x25, ince duvarlı microcontainers, çapı 300 mm ve derinliği her bir dizi için ısıyla. Bu süreç şu anda değiştirilmiş bir sıcak kabartma basın [Şekil yapılır. 5], polimer filmin, iki metal plaka arasına sıkıştırılır. Mikroişlenmiş kalıp üst plakası ile donatılmıştır ve düşük basınç ve vakum konnektörleri içerir. Film, 5 MPa kadar bir basınç ile azot kalıp, daha önce tahliye microcavities gerilir. Filmler tavlama parça önlenmesi cam geçiş sıcaklığına yakın oluşur.
Şekil 4
Şekil 5
Bir süreç sonrası, tüm mikroyapı uygun bir gravür orta (örneğin, 5 Mol / L NaOH,% 10 w / v MeOH) içine çeker seçici iyon parçaları gözenekleri kazınmış. Gravür kez kontrol ve konsantrasyon, sıcaklık ve özel katkı maddeleri (örneğin, aşındırma yararlanıcı grup) olarak koşulları, gravür, gözeneklerin boyutunu ve şeklini [Şekil ayarlanabilir. 6].
Şekil 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
, Mikro enjeksiyon kalıplama veya sıcak kabartma olarak polimer microreplication, kurulan yöntemleri, mikro üretimi için uygun olmasına rağmen, onlar CellChip için gerekli olduğu gibi, gerçekten entegre ve çok kontrollü bir gözenekli mikro üreten etkili değildir. Büyük hacimli yapılar, örneğin bir sonraki lazer perforasyon için duvar kalınlığı azaltmak için pahalı işleme gerektiren veya duvarları tamamen yerine parça kazınmış membranlar olmak zorunda. SMART, bu sorunların üstesinden gelmek ve seri üretim için uygun olan ve gelecek vaat eden yeni bir teknolojidir. Perspektifler, rulo beslemeli, makroskopik parçalar için üretim hatları benzer ince duvarlı mikro imalat içerir. Ayrıca, bir lastik elastik devlet polimer film şekillendirme, yapısı (dikey yan duvarları da dahil olmak üzere) tüm üzerinden tanımlanan gözenekleri oluşturmak için değil, aynı zamanda, biyoaktif yüzey desenleri, kaplama gibi bir çok çözülmesi fonksiyonelleştirilmesi mikro vermemeyi şansı sunuyor ve hatta içinde topolojileri zor erişilebilir, örneğin mikroakışkan boşluklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Dirk Herrmann, Oliver Wendt, Siegfried Horn, Hartmut Gutzeit ve Joerg Bohn çözücü buhar kaynağı ile ilgili önemli yardım için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, kendi teknik yardım için Michael Hartmann, Alex Gerwald, Daniel Leisen kabul etmek istiyorum.
References
- Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation. J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmüller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Heckele, M., Schomburg, W. K. Review on micro molding of thermoplastic polymers. Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Guber, A. E., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F. Microthermoforming as a novel technique for manufacturing scaffolds in tissue engineering (CellChips. IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 151-157 (2004).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed Microdevices. 8, 191-199 Forthcoming.
- Truckenmüller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips. Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).
- Truckenmüller, R., Giselbrecht, S. Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications. IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).
- Fleischer, R. L., Price, P. B., Walker, R. M. Nuclear tracks in solids. , University of California Press. Berkeley. Forthcoming.
