Microfabricación de chip del tamaño de andamios para el cultivo de células en tres dimensiones

Summary

Se presentan dos procesos de microfabricación de chips de polímero poroso para el cultivo de células en tres dimensiones. El primero es el estampado en caliente combinado con un proceso de soldadura vapores de disolventes. El segundo utiliza un proceso desarrollado recientemente microthermoforming combinada con la tecnología de iones de la pista que conduce a una simplificación significativa de la fabricación.

Abstract

El uso de tecnologías de microfabricación es un requisito previo para crear los andamios de la geometría reproducible y constante de la calidad para el cultivo de células en tres dimensiones. Estas tecnologías ofrecen una amplia gama de ventajas no sólo para la fabricación, sino también para diferentes aplicaciones. El tamaño y la forma de grupos de células formado puede estar influenciado por la arquitectura exacta y reproducible de la microfabricated andamio y, por tanto, la longitud del camino de difusión de nutrientes y gases pueden ser controlled.1 Este es sin duda una herramienta útil para prevenir la apoptosis y la necrosis de células debido a una insuficiencia de nutrientes y suministro de gas o la eliminación de metabolitos celulares.

Nuestro chip de polímero, llamado CellChip, tiene las dimensiones exteriores de 2 x 2 cm con una superficie microestructurados central. Esta área se subdivide en una serie de hasta 1.156 microcontenedores con una dimensión típica de 300 m longitud de la arista para el diseño cúbico (cp-o CF-chip) o de 300 m de diámetro y profundidad para el diseño redondo (r-chip). 2

Hasta ahora, estampado en caliente o micro inyección (en combinación con el subsiguiente mecanizado laborioso de las partes) se utiliza para la fabricación de los chips de microestructura. Básicamente, micro moldeo por inyección es una de las pocas técnicas de replicación basada en polímeros que, hasta ahora, es capaz de la producción en masa de polímero microstructures.3 Sin embargo, ambas técnicas tienen algunas limitaciones no deseados debido a la transformación de un polímero viscoso se funden con la generación de paredes muy delgadas o integrado a través de los agujeros. En el caso de la CellChip, finas capas inferiores son necesarios para perforar el polímero y dar pequeños poros de tamaño definido para proporcionar células con medio de cultivo, por ejemplo mediante la perfusión de microfluidos de los contenedores.

Con el fin de superar estas limitaciones y reducir los costes de fabricación se ha desarrollado un enfoque microtécnicos nuevo sobre la base de un proceso de abajo-a escala de termoformado. Para la fabricación de chips de paredes muy porosas y delgadas de polímero, se utiliza una combinación de irradiación con iones pesados, microthermoforming y el grabado de pistas. En esta llamada "SMART" del proceso (Modificación del sustrato y la reproducción por termoformado) películas delgadas de polímero son irradiados con energía proyectiles pesados ​​de varios cientos de MeV la introducción de las llamadas "huellas latentes" Posteriormente, la película en un estado de goma elástica se forma en tres piezas tridimensionales sin necesidad de modificar o hibridación de las vías. Después de que el proceso de formación, ataque químico selectivo finalmente convierte las pistas en los poros cilíndricos de diámetro ajustable.

Protocol

Proceso Secuencia N º 1: estampado en caliente, mecanizado y soldadura de vapor de disolventes

El CellChip en su diseño cúbico es replicado por estampado en caliente o micro inyección. Para ello, se utiliza un molde de bronce micromecanizados con la geometría inversa del chip. Los contenedores - dispuestos en una matriz regular de hasta 1.156 contenedores - tienen un diseño cúbico, con una longitud lateral de 300 micras. De estampado en caliente, el proceso de replicación se realiza en una convencional WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Alemania). La herramienta consta de dos placas de metal circular. En un primer paso, una delgada placa de PMMA (Lucryl, G77Q11, BASF) se coloca en el centro de la placa inferior de la herramienta abierta. El inserto de molde microestructurados Esta céntricamente montado en la placa superior. A continuación, la herramienta está cerrada para la evacuación del molde y se calienta a una temperatura por encima de la temperatura de transición vítrea del polímero. Al presionar las placas en conjunto, el polímero viscoso se introduce en la cavidad evacuada hasta que estén completamente llenos de replicar con precisión la geometría del molde. Después de enfriar la herramienta, la microestructura parte polímero puede ser desmoldeado. El proceso requiere más masa de polímero que realmente se necesita para llenar las cavidades del molde. El superávit de polímero forma una capa residual que puede ser utilizado para facilitar el desmolde de la pieza. Sin embargo, la creación de poros con un diámetro de menos de 3 m en la parte inferior de los contenedores, la capa residual de espesor tiene que ser adelgazada, o incluso completamente eliminado y sustituido por una membrana porosa. Para simplificar el proceso de integración de los poros, la parte de atrás de la CellChip replicado es completamente eliminado por mecanizado con una fábrica de diamantes. Para ello, las partes se fijan en una placa de refrigeración de montaje y, además, la fragilidad de las estructuras se congelan en agua desionizada para protegerlos contra daños.

En una última fase, por último, un ion comerciales pista grabada con membrana (policarbonato, un espesor de 10 micras, de tamaño de poro 3 micras, 2x10 ⁶ poros / cm ², Pieper Filter GmbH) se une a la parte posterior de la matriz de los contenedores ahora abierto, tanto en superior e inferior. El proceso de unión es un solvente proceso de vapor de soldadura realizada en una cámara hermética, con calefacción [fig. 1], que consiste en un émbolo superior y una placa móvil más baja con un plato vacío integrado. ⁴ hasta cuatro CellChips mecanizadas y las membranas pista grabada se exponen de forma paralela a un solvente vaporizado tras la cámara fue evacuada. Luego, las piezas moldeadas y las membranas se presionan entre sí por el émbolo superior. Después de un corto período de exposición (<15 s), la cámara se evacua de nuevo lo que elimina el disolvente. Debido al tiempo de contacto corto, sólo cerca de la superficie de material se disuelva y una deformación de la estructura debido a la mayor parte de la carga mecánica se puede evitar. Finalmente, la cámara se abre y el CellChips cementada se puede quitar y se preparó para el cultivo de células [fig. 2].

Figura 1.

Figura 2.

Proceso Secuencia N º 2: la irradiación de iones pesados, microthermoforming y el grabado de pistas (proceso de SMART)

El nuevo proceso llamado SMART es una tecnología recientemente desarrollada para la fabricación de micro funcionalizados como membrana microestructuras. ⁵ La tecnología se basa en un proceso microtécnicos termoformado, llamado "microthermoforming. ^6,7 En esta etapa del proceso central, que fue adaptado de la macroscópica atrapados proceso de hoja de termoformado, una película delgada de polímero se calienta se forma en su estado ablandado, goma elástica por la presión de gas en una cavidad del molde [fig. 3]. A diferencia de estampado en caliente o de moldeo por inyección, este proceso no es una forma primaria y el polímero no se derrita. Debido al hecho de que la película está formado todavía en un estado sólido con una cohesión material permanente, las modificaciones de material con alta resolución lateral primero se pueden generar en el plano películas de polímero y se conservan durante todo el proceso de formación. Después del paso de microthermoforming, estas modificaciones pueden ser más selectiva procesados, por ejemplo, mediante un tratamiento químico húmedo.

Figura 3

El proceso de SMART, en principio, consta de tres pasos del proceso:

1. creación de los patrones de modificación en planos muy resuelto capas delgadas de polímeros en un proceso de pre-
2. 3D shapción de las películas de microthermoforming sin perder (con dibujos) modificaciones
3. post-proceso (opcional) para funcionalización final de piezas de paredes delgadas microestructurados

El proceso de SMART que se aplican actualmente para la fabricación de CellChips porosa incluye los siguientes pasos del proceso [fig. 4]. Una delgada película de polímero, por ejemplo, de policarbonato (Pokalon OG461Gl, 50 micras, Lofo High Tech Film GmbH, Alemania), se irradia con iones pesados ​​acelerados (como Xe, Au o iones U) en las instalaciones del acelerador de GSI (Darmstadt, Alemania), con las energías de aprox. 1 GeV y fluencias en el orden de los 106 ⁸ Después de enfriar la herramienta, la parte de pared delgada puede ser desmoldeado. iones / cm ². Al penetrar a través de la película, cada ion produce un rastro casi recta de material modificado, llamado pista latente. Las películas pre-tratados son entonces termoformados a una serie de 25x25 microcontenedores de paredes delgadas, cada uno con un diámetro y una profundidad de 300 micras. El proceso se realiza actualmente en una prensa de estampado en caliente modificado [fig. 5], donde se fija la película de polímero entre dos placas de metal. La placa superior está equipado con el molde micromecanizados y el inferior contiene la presión y los conectores de vacío. La película se estira en microcavidades evacuada previamente del molde por nitrógeno con una presión de hasta 5 MPa. Las películas se forman cerca de su temperatura de transición vítrea prevención de la pista de recocido.

Figura 4

Figura 5

En un proceso posterior, las pistas de iones son selectivamente grabado a los poros mediante la inmersión de la microestructura de todo en un medio grabado apropiado (por ejemplo, 5 mol / L NaOH, 10% w / v MeOH). Al controlar los tiempos de grabado y el aguafuerte condiciones, tales como concentración, temperatura y aditivos especiales (por ejemplo, los promotores de etch), el tamaño y la forma de los poros resultantes se puede ajustar [fig. 6].

Figura 6

Discussion

Aunque los métodos establecidos de la micro replicación de polímero, tales como micro moldeo por inyección o estampado en caliente, son aptos para la producción de microestructuras, que no son realmente eficaces en la producción de micro con un sistema integrado y altamente controlado porosidad, lo que se necesita para la CellChip. Estructuras voluminosas por ejemplo, requieren el mecanizado costoso para reducir el espesor de la pared de una perforación láser posterior o las paredes tienen que ser totalmente sustituida por la pista grabada con membranas. SMART es una tecnología nueva y prometedora que puede superar estos problemas y es adecuado para la producción en masa. Perspectivas incluyen la fabricación de paredes delgadas de microestructuras de bobina, de forma similar a las líneas de producción de piezas macroscópicas. Por otra parte, la formación de películas de polímero en un estado de goma elástica ofrece la oportunidad no sólo para crear poros define toda la estructura (incluyendo las paredes laterales verticales), sino también para proporcionar microestructuras con una funcionalización de una alta resolución, tales como patrones de superficie bioactiva, revestimientos, y topologías incluso dentro de muy difícil acceso, por ejemplo, las caries, de microfluidos.