Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Summary

Vi presentiamo due processi per la microfabbricazione di chip polimerici porosi tridimensionali coltivazione delle cellule. Il primo è goffratura a caldo combinato con un solvente processo di saldatura vapore. La seconda utilizza un processo recentemente sviluppato microthermoforming combinata con la tecnologia agli ioni di pista che porta ad una significativa semplificazione di fabbricazione.

Abstract

Utilizzando le tecnologie di microfabbricazione è un prerequisito per creare impalcature della geometria riproducibile e qualità costante per tridimensionali coltivazione delle cellule. Queste tecnologie offrono un ampio spettro di vantaggi non solo per la produzione ma anche per applicazioni diverse. Le dimensioni e la forma dei cluster di cellule formate può essere influenzato da quello relativo all'architettura e riproducibile della microfabbricazione patibolo e, di conseguenza, la lunghezza del percorso di diffusione di nutrienti e dei gas può essere controlled.1 Questo è senza dubbio uno strumento utile per prevenire l'apoptosi e necrosi del cellule a causa di una sostanza nutritiva insufficiente e la fornitura di gas o la rimozione di metaboliti cellulari.

Il nostro chip polimero, chiamato CellChip, ha le dimensioni esterne di 2 x 2 cm con una zona centrale microstrutturata. Questa zona è suddivisa in una serie di microcontainers fino al 1156 con una dimensione tipica di 300 m di lunghezza bordo per la progettazione cubi (cp-o cf-chip) o di 300 m di diametro e profondità per la progettazione round (r-chip). 2

Fino ad ora, a caldo o goffratura micro stampaggio ad iniezione (in combinazione con la conseguente lavorazione laboriosa delle parti) è stato utilizzato per la fabbricazione dei chip microstrutturate. In pratica, i micro stampaggio ad iniezione è una delle solo tecniche replica a base polimerica che, fino ad ora, è in grado per la produzione di massa di polimeri microstructures.3 Tuttavia, entrambe le tecniche sono alcune limitazioni indesiderati dovuti al trattamento di un polimero viscoso si fondono con la generazione di pareti molto sottili o integrati attraverso i fori. In caso di CellChip, sottili strati di fondo sono necessari per perforare il polimero e di fornire piccoli pori di dimensioni definite per la fornitura di cellule, ad esempio con terreno di coltura per perfusione microfluidica dei contenitori.

Per superare queste limitazioni e per ridurre i costi di produzione, abbiamo sviluppato un nuovo approccio microtecnica sulla base di una down-scalati processo di termoformatura. Per la produzione di chip a parete altamente porosa e sottili di polimeri, si usa una combinazione di irradiazione di ioni pesanti, microthermoforming e incisione pista. In questo cosiddetto processo "SMART" (Modifica substrato e la replicazione di termoformatura) sottili pellicole polimeriche sono irradiati con energica proiettili pesanti di diverse centinaia di MeV introducendo le cosiddette "tracce latenti" Successivamente, il film in uno stato di gomma elastica è formata in tre parti dimensionale senza modificare o ricottura le tracce. Dopo il processo di formatura, attacchi chimici selettivi converte definitivamente le tracce in pori cilindrici di diametro regolabile.

Protocol

Processo Sequenza # 1: goffratura a caldo, lavorazione e saldatura di vapore solvente

Il CellChip nel suo design cubico è replicato da caldo o goffratura micro stampaggio ad iniezione. Per questo, usiamo uno stampo micromachined ottone con la geometria inversa del chip. I contenitori - disposte in una serie regolare di fino a 1156 contenitori - hanno un design cubico, con una lunghezza dello spigolo di 300 micron. Per goffratura a caldo, il processo di replica viene eseguito su un tradizionale WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Germania). Lo strumento è costituito da due piastre metalliche circolari. In una prima fase, una sottile lastra in PMMA (Lucryl, G77Q11, BASF) si trova nel centro della piastra inferiore dello strumento aperto. L'inserto stampo microstrutturata centrico è montato la piastra superiore. Allora il programma è chiuso per l'evacuazione dello stampo e riscaldato ad una temperatura superiore alla temperatura di transizione vetrosa del polimero. Premendo i piatti insieme, il polimero viscoso viene spinto nelle cavità evacuate fino a quando sono completamente riempito con precisione replicando la geometria dello stampo. Dopo il raffreddamento dello strumento, la parte microstrutturata polimero può essere sformati. Il processo richiede più di massa di polimeri di quanto sia effettivamente necessario per riempire la cavità dello stampo. L'avanzo polimero forma uno strato residuo che può essere utilizzato per facilitare la sformatura del pezzo. Tuttavia, per creare pori di diametro inferiore a 3 micron sul fondo dei contenitori, lo spesso strato residuo deve essere assottigliato verso il basso, o addirittura completamente rimosso e sostituito da una membrana porosa. Per semplificare il processo di integrazione dei pori, la parte posteriore del CellChip replicato viene completamente rimosso dalla lavorazione con un mulino diamante. Per questo, le parti sono fissate su una piastra di raffreddamento di montaggio e, inoltre, le strutture fragili sono congelati in acqua deionizzata per proteggerli da eventuali danni.

In una fase di processo scorso, infine, un commerciale ioni traccia incisa a membrana (policarbonato, spessore 10 micron, diametro dei pori 3 micron, 2x10 ⁶ pori / cm ², Pieper Filter GmbH) è legato alla parte posteriore della serie di contenitori ora aperto sia a superiore e inferiore. Il processo di incollaggio è un solvente processo di saldatura vapore eseguito in una tenuta di gas, riscaldato da camera [fig. 1], composto da un pistone superiore e un piatto inferiore mobile con un mandrino vuoto integrato. ⁴ Fino a quattro CellChips lavorare e tenere traccia incisa a membrane sono esposti in parallelo ad un solvente vaporizzato dopo la camera è stato evacuato. Poi, i pezzi stampati e le membrane sono premuti insieme per lo stantuffo in alto. Dopo un breve periodo di esposizione (<15 s), la camera viene evacuata nuovamente eliminando il solvente. A causa del tempo di contatto breve, solo in prossimità della superficie materiale è sciolto e una deformazione della struttura del blocco a causa del carico meccanico può essere evitato. Infine, la camera è aperta e il CellChips solvente saldato può essere rimosso e preparato per colture cellulari [fig. 2].

Figura 1.

Figura 2.

Processo Sequenza # 2: irradiazione di ioni pesanti, microthermoforming e incisione traccia (processo SMART)

Il nuovo processo chiamato SMART è una tecnologia sviluppata di recente per la produzione di micro-funzionalizzati membrana come microstrutture. ⁵ La tecnologia si basa su un processo di termoformatura microtecnica, chiamato 'microthermoforming'. ^6,7 In questa fase del processo centrale, che è stato adattato dal macroscopico intrappolati processo di termoformatura foglio, una riscaldata sottile pellicola polimerica è formata nella sua ammorbidito, lo stato di gomma elastica di pressione del gas in una cavità dello stampo [fig. 3]. A differenza di goffratura a caldo o stampaggio ad iniezione, questo processo non è una forma primaria e il polimero non è sciolto. A causa del fatto che il film è formato ancora in uno stato solido con una coesione materiale permanente, modifiche materiale con alta risoluzione laterale può anche essere generata a planare film polimerici e sono conservate in tutto il processo di formatura. Dopo il passo microthermoforming, queste modifiche possono essere ulteriormente elaborati selettivamente, per esempio, mediante trattamento chimico.

Figura 3

Il processo di SMART in linea di principio si compone di tre fasi del processo:

1. creazione di modelli di modifica altamente deliberato planare film sottili di polimeri in un pre-processo
2. 3D Shapzione dei film di microthermoforming senza perdita di (fantasia) modifiche
3. post-processo (optional) per una funzionalizzazione finale delle parti microstrutturate pareti sottili

Il processo di SMART stiamo applicando per la realizzazione di CellChips poroso comprende le seguenti fasi di processo [fig. 4]. Una sottile pellicola polimerica, per esempio, dal policarbonato (Pokalon OG461Gl, 50 micron, LoFo High Tech Film GmbH, Germania), viene irradiato con ioni pesanti accelerati (come Xe, Au o ioni U) presso le strutture acceleratore del GSI (Darmstadt, Germania) con energie di ca. 1 GeV e fluenze nell'ordine di 106 ⁸ Dopo il raffreddamento dello strumento, la parte con pareti sottili possono essere sformati. ioni / cm ². Quando penetrare attraverso la pellicola, ogni ione produce una scia quasi retta di materiale modificato, chiamato traccia latente. La pre-trattati film sono poi termoformato ad un array di 25x25 microcontainers con pareti sottili, ciascuno con un diametro e una profondità di 300 micron. Il processo è attualmente eseguito su una pressa modificata goffratura a caldo [fig. 5], in cui è bloccato il film polimerico tra due lastre di metallo. La piastra superiore è dotata di stampo microlavorati e quello inferiore contiene la pressione e connettori vuoto. Il film è teso in microcavità preventivamente evacuati dello stampo con azoto con una pressione fino a 5 MPa. I film sono formate vicino alla loro temperatura di transizione vetrosa prevenire traccia ricottura.

Figura 4

Figura 5

In un post-processo, le tracce di ioni sono selettivamente incise a pori immergendo il tutto in una microstruttura medio incisione appropriato (per esempio, 5 Mol / L di NaOH, il 10% w / v MeOH). Controllando i tempi di incisione e acquaforte condizioni, quali la concentrazione, la temperatura e speciali additivi (ad esempio, promotori etch), la dimensione e la forma dei pori risultante può essere regolato [fig. 6].

Figura 6

Discussion

Anche se i metodi stabiliti di microreplicazione polimero, come micro-stampaggio ad iniezione o goffratura a caldo, sono adatte per la produzione di microstrutture, non sono realmente efficaci nella produzione di microstrutture con un sistema integrato ed altamente porosità controllata, in quanto è necessario per la CellChip. Strutture ingombranti per esempio richiedono lavorazioni costose per ridurre lo spessore della parete per una perforazione laser successivo o pareti devono essere completamente sostituita da track-incise membrane. SMART è una tecnologia nuova e promettente in grado di superare questi problemi ed è adatto per la produzione di massa. Prospettive includono produzione di pareti sottili microstrutture da Roll Fed, simili a linee di produzione per le parti macroscopiche. Inoltre, la formazione di film polimerici in uno stato di gomma elastica offre la possibilità non solo di creare pori definito tutte sulla struttura (comprese le pareti laterali verticali), ma anche di fornire microstrutture con una funzionalizzazione altamente risolta, come ad esempio modelli di superficie bioattiva, rivestimenti, e topologie anche all'interno difficilmente accessibili, per esempio, cavità microfluidica.