Summary
Мы представляем два процесса для микротехнологий пористого полимера чипов для трехмерного культивирования клеток. Первое горячее тиснение в сочетании с растворителем процесс сварки пара. Второй использует недавно разработанный microthermoforming процесса в сочетании с технологией ионного следа приводит к значительному упрощению производства.
Abstract
Использование микротехнологий технологий является необходимым условием для создания лесов воспроизводимых геометрии и постоянное качество для трехмерного культивирования клеток. Эти технологии обеспечивают широкий спектр преимуществ не только для производства, но и для различных приложений. Размер и форма формируются кластеры клетка может находиться под влиянием точных и воспроизводимых архитектуры microfabricated эшафоте и, следовательно, длина диффузионного пути питательные вещества и газы могут быть controlled.1 Это, несомненно, является полезным инструментом для предотвращения апоптоза и некроза клетки из-за недостаточной питательных веществ и газоснабжения или удаления клеточных метаболитов.
Наши полимера чип, называемый CellChip, имеет внешние размеры 2 х 2 см с центральным микроструктурированных области. Эта территория разделена на массив до 1156 микроконтейнеров с характерным размером в 300 м длиной ребра на кубический дизайн (ф-или CF-чип) или 300 м в диаметре и глубиной для круглых дизайн (г-чип). 2
Пока горячее тиснение или микро литья под давлением (в сочетании с последующей трудоемкой обработки деталей) был использован для изготовления микроструктурированных чипов. В основном, микро литья под давлением является одним из полимера только методы на основе репликации, который до сих пор, способен к массовому производству полимеров microstructures.3 Тем не менее, оба метода имеют некоторые нежелательные ограничения, связанные с обработкой вязких расплава полимера с образованием очень тонкими стенками или интегрированных сквозных отверстий. В случае CellChip, тонкие слои нижней необходимы для перфорации полимерных и предоставлять небольшие поры определенного размера на поставку ячеек с культурой, например, среды микрожидкостных перфузии контейнеров.
Для того чтобы преодолеть эти ограничения и сокращения производственных затрат, мы разработали новый подход microtechnical на основе вниз масштабируется термоформования процесса. Для изготовления высокопористых и тонкостенных чипов полимера, мы используем сочетание облучении тяжелыми иона, microthermoforming и травления треков. В этой так называемой "SMART" процесс (Модификация субстрата и воспроизведения термоформования) тонких полимерных пленок облучении энергичными тяжелыми снарядами нескольких сотен МэВ введения так называемых "латентных треков" Впоследствии фильм в состоянии резиновые упругие формируется на три мерные части без изменения или отжига треков. После формования, избирательное химическое травление, наконец, преобразовывает треки в цилиндрических пор регулируемых диаметре.
Protocol
Процесс Sequence # 1: горячее тиснение, механическая обработка и сварка паров растворителей
CellChip в его кубический дизайн воспроизведены горячего тиснения или микро литья под давлением. Для этого мы используем Micromachined плесень латуни с обратной геометрии чип. Контейнеры - расположены в обычный массив до 1156 контейнеров - есть кубический дизайн с длиной ребра в 300 мкм. Для горячего тиснения, процесс репликации осуществляется на обычных WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Германия). Инструмент состоит из двух круглых металлических пластин. На первом этапе, тонкой пластины ПММА (Lucryl, G77Q11, BASF) помещается в центр нижней пластины открыл инструмент. Микроструктурированных вставить плесень центрически установлен в верхней пластине. Затем инструмент закрыта для эвакуации форму и нагревается до температуры выше температуры стеклования полимера. При нажатии пластины вместе, вязких полимер помещается в полости эвакуированы, пока они полностью заполнены именно тиражирование геометрией формы. После охлаждения инструмента, микроструктурированных часть полимера может быть demoulded. Процесс требует больше полимера массой, чем это реально необходимо заполнить форму полости. Профицит полимер образует остаточный слой, который можно использовать для облегчения распалубки части. Однако, для создания поры диаметром менее 3 мкм в нижней части контейнера, толстые остаточного слоя должна быть похудел, или даже полностью удалена и заменена пористой мембраной. Чтобы упростить процесс интеграции пор, задней реплицируются CellChip полностью удаляется путем механической обработки с мельницей алмаза. Для этого части закреплены на монтажной пластине охлаждения и, кроме того, хрупких структур заморожены в деионизированной воде, чтобы защитить их от повреждения.
В последнем шаге процесса, наконец, коммерческие ионных трековых мембран (поликарбонат, толщина 10 мкм, размер пор 3 мкм, 2x10 6 поры / см ², Пипер Filter GmbH) связан с задней массив контейнеров теперь открываются как на сверху и снизу. Связь процесса сварки паров растворителя процесс осуществляется в газонепроницаемыми, подогрев камеры [рис. 1], состоящий из поршня и верхней подвижной нижней плиты со встроенным патроном вакууме. 4 до четырех обрабатываемых CellChips и трековых мембран подвергаются параллельно испарения растворителя после камере был эвакуирован. Затем, формованных деталей и мембраны прижаты друг к другу по верхней поршень. После короткого периода экспозиции (<15 с), камера снова эвакуировали удаляя растворитель. Из-за короткого времени контакта, только поверхность вблизи материал растворяется и деформации объемной структуры из-за механических нагрузок можно избежать. Наконец, камера открывается и растворителя сварных CellChips может быть удален и подготовлена к культуре клеток [рис. 2].
Рисунок 1.
Рисунок 2.
Процесс последовательности № 2: облучении тяжелыми иона, microthermoforming и травления треков (SMART процесса)
Новый процесс называется SMART является недавно разработанный микро-технологии для изготовления функционализированных мембраны типа микроструктур. 5 Технология основана на microtechnical термоформования процесс, называемый "microthermoforming. 6,7 В этом центральном шаг процесса, который был адаптирован с макроскопической ловушке лист термоформования процесса, нагретой тонкой полимерной пленки формируется в его смягчилось, резиновые упругие состояние за счет давления газа в полость формы [рис. 3]. В отличие от горячего тиснения или литья под давлением, этот процесс не является первичным формирования и полимер не расплавится. В связи с тем, что фильм формируется еще в твердом состоянии с постоянным сплоченности материала, материала модификации с высокой боковой резолюции может сначала быть сгенерированы на плоских полимерных пленок и сохраняются во всем процессе формирования. После microthermoforming шагом, эти изменения могут быть дополнительно обработаны выборочно, например, по мокрой химической обработки.
Рисунок 3
SMART процесс в принципе состоит из трех этапов процесса:
- создания высокоэффективных решен моделей модификации на плоских тонких полимерных пленок в предварительно обработать
- 3D-форING из фильмов microthermoforming без потерь (узорные) модификаций
- пост-обработку (опционально) для окончательного функционализации тонкостенных микроструктурированных частей
SMART процесса мы в настоящее время применяют для изготовления пористых CellChips включает в себя следующие этапы процесса [рис. 4]. Тонкой полимерной пленки, например, из поликарбоната (Pokalon OG461Gl, 50 мкм, LoFo High Tech Film GmbH, Германия), облучается ускоренных тяжелых ионов (например, Хе, Au или U ионов) на ускорителе объектов GSI (Дармштадт, Германия) с энергией ок. 1 ГэВ и в дозах порядка 106 8 После охлаждения инструментом, тонкостенные часть может быть demoulded. ионов / см ². При проникающих через фильм, каждый ион производит почти прямой след модифицированного материала, называемого скрытого трека. Предварительно обработанных фильмы затем формованием на массив 25x25 тонкостенных микроконтейнеров, каждый с диаметром и глубиной 300 мкм. Процесс в настоящее время осуществляется на изменение горячего тиснения пресса [рис. 5], где полимерная пленка зажимается между двумя металлическими пластинами. Верхняя пластина снабжена Micromachined плесени и нижней части расположены давления и вакуума разъемов. Фильм растягивается на ранее эвакуированы микрорезонаторах пресс-формы азота с давлением до 5 МПа. Пленки образуются вблизи их температуры стеклования предотвращения трек отжига.
Рисунок 4
Рисунок 5
В пост-обработки, ионно треки выборочно травления в поры, погрузив весь микроструктуры в соответствующей среде травления (например, 5 моль / л NaOH, 10% вес / объем метанола). Контролируя травления раз и травления условий, таких как концентрация, температура и специальных добавок (например, травления промоутеров), размер и форму в результате поры могут быть скорректированы [рис. 6].
Рисунок 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя установленные методы полимера microreplication, таких как микро литья под давлением или горячим тиснением, пригодны для изготовления микроструктур, они не очень эффективны в производстве микроструктур с комплексной и строго контролируемых пористость, сколько нужно для CellChip. Громоздкие структуры, например, требуют дорогостоящей обработки уменьшить толщину стенки для последующего перфорация лазером или стен должны быть полностью заменены трековых мембран. SMART является новой и перспективной технологии, которая может решить эти проблемы и подходит для массового производства. Перспективы включают производство тонкостенных микроструктур поименное кормили, похожие на производственных линиях для макроскопических частей. Кроме того, формирование полимерных пленок в состоянии резиновые упругие дает шанс не только создать определенный поры всей структуры (включая вертикальные боковые стенки), но и обеспечить микроструктур с высоким разрешением функционализации, таких как биологически активные модели поверхности, покрытий, и топологии даже в труднодоступных, например, микрожидкостных полостей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Дирка Херрманн, Оливер Вендт, Зигфрид Горн, Хартмут Гутцайт и Йорг Бон за их существенную помощь относительно растворителя сварки пара. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Майкла Хартманна, Алекс Gerwald, и Даниэль Лейзен за техническую помощь.
References
- Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation. J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmüller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Heckele, M., Schomburg, W. K. Review on micro molding of thermoplastic polymers. Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Guber, A. E., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F. Microthermoforming as a novel technique for manufacturing scaffolds in tissue engineering (CellChips. IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 151-157 (2004).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed Microdevices. 8, 191-199 Forthcoming.
- Truckenmüller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips. Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).
- Truckenmüller, R., Giselbrecht, S. Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications. IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).
- Fleischer, R. L., Price, P. B., Walker, R. M. Nuclear tracks in solids. , University of California Press. Berkeley. Forthcoming.
