Microfabricação de Chip porte Andaimes para tridimensional de cultivo celular

Summary

Nós apresentamos dois processos para a microfabricação dos chips porosa de polímero para tridimensional cultivo celular. O primeiro é de estampagem a quente combinado com um processo de soldagem solvente vapor. A segunda usa um processo desenvolvido recentemente microthermoforming combinado com tecnologia de iões pista levando a uma significativa simplificação de fabricação.

Abstract

Uso de tecnologias de microfabricação é um pré-requisito para criar andaimes da geometria reprodutíveis e de qualidade constante para tridimensional de cultivo celular. Essas tecnologias oferecem um amplo espectro de vantagens não só para a fabricação, mas também para diferentes aplicações. O tamanho ea forma dos ninhos de células formado pode ser influenciado pela arquitetura exata e reprodutível do andaime microfabricated e, portanto, o comprimento do caminho de difusão de nutrientes e gases podem ser controlled.1 Este é sem dúvida uma ferramenta útil para prevenir a apoptose e necrose de células devido a uma insuficiente de nutrientes e fornecimento de gás ou remoção de metabólitos celulares.

Nosso chip de polímero, chamado CellChip, tem as dimensões exteriores de 2 x 2 cm, com uma área central microestruturada. Esta área é subdividida em uma matriz de até 1156 microcontainers com uma dimensão típica de 300 m comprimento da aresta para o projeto cúbicos (cp ou cf-chip) ou de 300 m de diâmetro e profundidade para o projeto round (r-chip). 2

Até agora, estampagem a quente ou micro moldagem por injeção (em combinação com usinagem trabalhoso subseqüentes das partes) foi usado para a fabricação dos chips microestruturada. Basicamente, micro moldagem por injeção é uma das únicas técnicas de replicação de polímero baseado em que, até agora, é capaz de produção em massa de polímero microstructures.3 No entanto, ambas as técnicas têm certas limitações indesejadas devido ao processamento de um polímero viscoso derreter com a geração de paredes muito finas ou integrados através de furos. No caso do CellChip, camadas inferiores finos são necessários para perfurar o polímero e fornecem pequenos poros de tamanho definido para abastecer as células com meio de cultura por exemplo, por perfusão microfluídicos dos recipientes.

Para superar essas limitações e reduzir os custos de fabricação, desenvolvemos uma nova abordagem microtécnicos com base em um processo de baixo escala termoformagem. Para a fabricação de altamente porosa e fina fichas murada polímero, usamos uma combinação de irradiação de íons pesados, microthermoforming e gravura pista. Neste processo chamado "SMART" (Modificação substrato e replicação por Termoformagem) filmes finos de polímeros são irradiados com energia projéteis pesados ​​de várias centenas de MeV introdução dos chamados "faixas latente" Posteriormente, o filme em um estado elástico de borracha é formado em três partes dimensional sem modificar ou recozimento as faixas. Após o processo de formação, ataque químico seletivo, finalmente, converte as faixas nos poros cilíndricos de diâmetro ajustável.

Protocol

Seqüência de processo # 1: Embossing Hot, Usinagem e Soldagem de vapor de solventes

O CellChip em seu design cúbico é replicado por estampagem a quente ou micro moldagem por injeção. Para isso, usamos um molde de latão microusinados com a geometria inverso do chip. Os recipientes - dispostos em uma matriz regular de até 1.156 contêineres - têm um design cúbico com um comprimento da aresta de 300 mm. Para estampagem a quente, o processo de replicação é executada em um WUM02 convencional (Jenoptik Mikrotechnik, Alemanha). A ferramenta consiste em duas placas de metal circular. Em uma primeira etapa, uma placa fina PMMA (Lucryl, G77Q11, BASF) é colocado no centro da placa inferior da ferramenta aberta. A inserção do molde microestruturada é centralmente montada na placa superior. Em seguida, a ferramenta está fechado para a evacuação do molde e aquecido a uma temperatura acima da temperatura de transição vítrea do polímero. Pressionando as placas em conjunto, o polímero viscoso é empurrado para dentro das cavidades evacuados até que estejam completamente cheios precisamente reproduzindo a geometria do molde. Após o resfriamento da ferramenta, a parte de polímero microestruturada pode ser desmoldados. O processo requer mais massa de polímero que é realmente necessário para preenchimento das cavidades do molde. O excedente forma uma camada de polímero residual que pode ser utilizado para facilitar a desmoldagem da peça. No entanto, para criar poros de diâmetro menor que 3 mm no fundo dos recipientes, a espessa camada residual tem de ser diluído para baixo, ou até mesmo completamente removido e substituído por uma membrana porosa. Para simplificar o processo de integração dos poros, a parte de trás do CellChip replicado é completamente removido por usinagem com uma fábrica de diamantes. Para isso, as peças são fixadas em uma placa de refrigeração de montagem e, adicionalmente, as estruturas frágeis são congelados em água desionizada para protegê-los contra danos.

Em uma etapa do processo passado, finalmente, um comercial de íons da membrana track-gravado (policarbonato, espessura de 10 mM, pore tamanho 3 mm, 2x10 ⁶ poros / cm ², Pieper Filter GmbH) é ligada à parte traseira do conjunto de recipientes abertos agora tanto no superior e inferior. O processo de ligação é um processo de soldagem de vapor de solventes realizado em uma câmara, estanque aos gases aquecidos [Fig. 1], que consiste em um êmbolo superior e uma placa móvel inferior com um mandril de vácuo integrado. ⁴ Até quatro CellChips usinadas e-track gravado membranas são expostas em paralelo com um solvente vaporizado após a câmara foi evacuada. Então, as peças moldadas e as membranas são pressionadas juntas pelo êmbolo superior. Após um curto período de exposição (<15 s), a câmara é evacuada novamente, eliminando assim o solvente. Devido ao curto tempo de contato, apenas a superfície perto material é dissolvido e uma deformação da estrutura em massa devido à carga mecânica pode ser evitado. Finalmente, a câmara é aberta eo CellChips solvente soldadas podem ser removidos e preparados para cultura de células [Fig. 2].

Figura 1.

Figura 2.

Seqüência de processo # 2: irradiação de íons pesados, microthermoforming e gravura track (processo SMART)

O novo processo chamado SMART é uma tecnologia recentemente desenvolvida para a fabricação de micro-funcionalizados membrana como microestruturas. ⁵ A tecnologia é baseada em um processo de microtécnica de termoformagem, chamado "microthermoforming" ^6,7. Nesta etapa do processo central, que foi adaptado a partir do macroscópica processo preso folha de termoformagem, uma aquecida fina película de polímero é formado em sua amolecida Estado de borracha elástica, por pressão de gás em uma cavidade do molde [Fig. 3]. Ao contrário de estampagem a quente ou de moldagem por injeção, esse processo não é uma formação primária e do polímero não é derretido. Devido ao fato de que o filme é formado ainda em estado sólido, com uma coesão material permanente, material de modificações com alta resolução lateral pode ser gerado no primeiro planar filmes de polímero e são preservados durante o processo de formação. Após a etapa de microthermoforming, essas modificações podem ser ainda mais seletiva processados, por exemplo, por tratamento químico úmido.

Figura 3

O processo SMART em princípio consiste de três etapas do processo:

1. criação de padrões de modificação altamente resolvidas em planar filmes finos de polímero em um processo de pré-
2. 3D shapção de filmes por microthermoforming sem perda de (padrão) modificações
3. pós-processamento (opcional) para uma funcionalização final de peças de paredes finas microestruturada

O processo INTELIGENTE atualmente estamos aplicando para a fabricação de CellChips porosa inclui os seguintes etapas de processo [Fig. 4]. Uma fina película de polímero, por exemplo, de policarbonato (Pokalon OG461Gl, 50 mm, LOFO High Tech Film GmbH, Alemanha), é irradiado com íons pesados ​​acelerados (como Xe, Au ou íons U) nas instalações do acelerador de GSI (Darmstadt, Alemanha) com energias de aprox. 1 GeV e fluências na ordem de 106 ⁸ Após o resfriamento da ferramenta, a parte de paredes finas podem ser desmoldados. íons / cm ². Ao penetrar através do filme, cada íon produz uma trilha quase reta de material modificado, chamado de faixa latente. Os filmes pré-tratados são, então, termoformados para uma matriz de 25x25 fina microcontainers paredes, cada uma com um diâmetro e profundidade de 300 mm. O processo é realizado atualmente em um cunho modificado hot [Fig. 5], onde o filme de polímero é fixada entre duas placas de metal. A placa superior é equipada com o molde microusinados ea inferior contém a pressão e conectores de vácuo. O filme é esticado em microcavidades previamente evacuado do molde de nitrogênio com uma pressão de até 5 MPa. Os filmes são formados perto de sua temperatura de transição de vidro, evitando faixa de recozimento.

Figura 4

Figura 5

Em um pós-processamento, as faixas de íons são seletivamente gravado para pores por imersão a microestrutura inteiro em um meio de gravação apropriado (por exemplo, 5 Mol / L NaOH, 10% w / v MeOH). Ao controlar os tempos de gravura e gravura condições, tais como temperatura, concentração e aditivos especiais (por exemplo, os promotores etch), o tamanho ea forma dos poros resultante pode ser ajustado [fig. 6].

Figura 6

Discussion

Embora os métodos estabelecidos de polímero microrreplicação, como micro moldagem por injeção ou estampagem a quente, são adequados para a produção de microestruturas, eles não são realmente eficazes na produção de microestruturas com uma porosidade integrada e altamente controlada, como é necessário para o CellChip. Estruturas volumosas por exemplo, requerem usinagem caros para reduzir a espessura da parede de uma perfuração a laser subseqüente ou paredes têm de ser completamente substituídos por faixas gravadas membranas. A SMART é uma tecnologia nova e promissora que pode superar esses problemas e é adequada para produção em massa. Perspectivas incluem fabricação de paredes finas microestruturas por rolo alimentado, similar às linhas de produção para peças macroscópicas. Além disso, a formação de filmes poliméricos em um estado elástico de borracha oferece a oportunidade não só para criar poros definidos em todo a estrutura (incluindo paredes laterais verticais), mas também para fornecer microestruturas com uma funcionalização altamente resolvidos, tais como padrões de superfície bioativa, revestimentos, e topologias mesmo dentro de difícil acesso, por exemplo, cavidades microfluídicos.