Summary
Anläggningen nagelband är en vaxartad yttre höljet på växter som har en primär roll i vattenvård men är också en viktig barriär mot inträde av patogena mikroorganismer. I denna video visar vi en analys av mutanter anläggning nagelband identifierats av framåt och bakåt genetik metoder.
Abstract
Anläggningen nagelband är en vaxartad yttre höljet på växter som har en primär roll i vattenvård, men är också en viktig barriär mot inträde av patogena mikroorganismer. Nagelbanden består av en tvärbunden tuff polymer som kallas "inkoppling" och ett skyddande vax skikt som tätar anläggningen ytan. Det vaxartade lagret av nagelbanden är uppenbart på många växter, visas som en glänsande hinna på murgröna blad eller som en dammig yttre höljet på ytan av en druva eller ett kål tack löv till ljusspridning kristaller finns i vax. Eftersom nagelbanden är en viktig anpassning av växter till en landmiljö, förstå de gener som är inblandade i anläggningen nagelband bildning har tillämpningar inom både jordbruk och skogsbruk. Idag visar vi en analys av mutanter anläggning nagelband identifierats av framåt och bakåt genetik metoder.
Protocol
I. Visual skärmar och Omvänd genetiska tillvägagångssätt för att identifiera Cuticle mutanter.
Ytterhud mutanter i modellen växten backtrav kallas "eceriferum" mutanter, som betyder "inte bär vax". De kan vara visuella skärmar, det vill säga att bara titta på den muterade, kan du se att blomställning stam av vild-typ växter är vitaktig medan mutanterna har mörkgröna glänsande stammar. En av de mutanter som var isolerad i denna typ av visuella skärmen är den här, som kallas eceriferum4 eller cer4.
Ett annat sätt att upptäcka intressanta nagelband mutanter är med en omvänd genetik tillvägagångssätt: att välja kandidat gener av intresse och sedan studera linjer växt med att genen störs. Dessa mutanter har TDNA störa gen, i detta fall, ett cytokrom P450 som vi idag kallar MAH1.
PCR-resultat (som det som visas i videon) kan bekräfta att TDNA insättning är i genen av intresse. När två genspecifika primers används till att förstärka vildtyps-DNA, ser vi en produkt, men om TDNA avbryter den, som i detta mutant, det finns inga där. Omvänt, med hjälp av primers specifikt för TDNA och genen är en produkt bara sett i mutant. Vi söker homozygot mutant linjer, där både moderns och faderns kopior av genen störs. Om en kopia av genen störs av TDNA och den andra kopian är fortfarande vild-typ, är PCR-resultaten blandade.
II. Genom gaskromatografi Avgöra den kemiska sammansättningen av Cutlicle Wax.
Vi analyserar den kemiska sammansättningen av vaxet med hjälp av gaskromatografi. Först är de lösliga vax föreningar avlägsnas från anläggningen yta genom att doppa den i kloroform.
Sedan är prov sprutas in i Gaskromatografikolonn, där de kommer att värmas upp och skickas via en ström av gas. Olika föreningar stick mer eller mindre på väggarna i kolumnen separera föreningar, och de kommer ut en efter den andra i andra änden av kolonnen. Då, som de föreningar passerar över flamjonisationsdetektor, ser vi topparna. Retentionstiden för varje topp är kännetecknande för olika föreningar och från masspektrometri har vi identifierat de olika komponenterna i Arabidopsis vax. De stora toppar finns den i C29 alkan, den C29 keton och C29 sekundära alkohol. De små topparna är de sekundära alkoholer, fettsyror, aldehyder och estrar. Området under topparna, i förhållande till standard, berättar hur mycket av varje ämne är närvarande.
När du tittar på gas kromatogram från dessa nagelband mutanter kan man märka hur cer4 saknar den primära alkoholer och estrar, medan mah1 saknar sekundära alkoholer och ketoner. Dessa fenotyper kan berätta mycket om funktionen av genen av intresse i anläggningen. Till exempel, innan vi visste vilken gen som var muterad i cer4 linje berättade fenotyp oss att det var ett problem i den primära alkoholen gren av biosyntesen. Efter den molekylära identiteten hos den genen har studerats i Kunst labbet, upptäcktes det att det är en del av en gen familj av feta acyl reductases, vilket passar bra med denna kemikalie fenotyp.
III. Använda Cryo-SEM att bestämma strukturen av Cuticle Kristaller
När vi studerar den Arabidopsis nagelband mutanter kan vi se om de har den mörkgröna, glänsande fenotyp eller vildtyp vitaktigt utseende på stjälken. Vi använder svepelektronmikroskop för att titta på nagelbanden på ytan av växten och identifiera grundval av den visuella fenotyp. Vi använder oss av Cryo-SEM, frysning växterna och visa dem i flytande kväve temperatur för att hålla nagelbanden intakt eftersom SEM kräver ett vakuum för att driva och utan att hålla dem frysta, skulle proverna torka ut och kollaps.
Här cer4 och mah1 prover, tillsammans med vildtyp kontroller, dissekeras och frusen på SEM stöta. När proverna förs över till den kalla-skede av mikroskop kan man se att ytan på vildtyp Arabidopsis stamceller nagelband är täckt med kristaller. Det är ljuset som är spridningen av dessa kristaller som ger stammen dess vitaktigt utseende. Här är cer4 stam, kom ihåg det såg glansig? Det saknar kristaller på ytan.
Människor har gjort experiment där de isolera en ren vax förening från nagelband av en växt och när de recrystallize det i labbet, det bildas kristaller i samma former som de som finns på växterna. I Arabidopsis, tror vi att kristallerna består av en blandning av föreningar och situationen är mer komplicerad. Till exempel visar den kemiska analysen oss att i cer4, är bara liten del av primära alkoholer samt derivat estrar saknas, men kristallerna på CER4 spindeln är borta. I fallet mah1 är effekten av mutationen i den cytokrom P450 enzym som den muterade växter saknar två viktiga komponenter i vax, sekundära alkoholer och ketoner, men kristallerna på mah1 växterna bildar normalt.
För mer information om Arabidopsis nagelband mutanter gå till Annual Review för växtbiologi .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
