Summary
Завод кутикулы восковой внешнее покрытие на растения, что имеет первостепенную роль в сохранение водных ресурсов, но также является важным барьером от проникновения патогенных микроорганизмов. В этом видео, мы демонстрируем анализа растений кутикулы мутанты, определенные прямом и обратном подходы генетики.
Abstract
Завод кутикулы восковой внешнее покрытие на растения, что имеет первостепенную роль в водных ресурсов, но и является важным барьером от проникновения патогенных микроорганизмов. Кутикула состоит из жесткой сшитого полимера под названием "кутина" и защитного слоя воска, что тюлени поверхности растения. Воскового слоя кутикулы очевидно на многих заводах, появляясь как блестящая пленка на лист плюща или пыльных внешнее покрытие на поверхности винограда или капустный лист, благодаря рассеянию света кристаллы присутствуют в воск. Потому что кутикула существенных адаптации растений к наземной среде, понимание генов, вовлеченных в формирование кутикулы завода находит применение в сельском хозяйстве и лесном хозяйстве. Сегодня мы покажем анализа растений кутикулы мутанты, определенные прямом и обратном подходы генетики.
Protocol
I. Визуальный Экраны и обратный Генетические подходы к Определить кутикулы мутанты.
Кутикулы мутантов Arabidopsis thaliana завод модель называют "eceriferum" мутантов, что означает "не несущих воска". Они могут быть в визуальных экранов, то есть, просто глядя на мутанта, можно увидеть, что соцветие стволовые дикого типа растений беловато в то время как мутанты темно-зелеными блестящими стеблей. Один из мутантов, выделенный в этом виде визуального экран этот, называемый eceriferum4 или cer4.
Другой способ обнаружения интересных мутантов кутикула с обратной генетики подход: выбор генов-кандидатов интереса, а затем изучения завода линий с этого гена нарушается. Эти мутанты TDNA нарушения гена, в данном случае, цитохрома P450, что мы сейчас называем MAH1.
Результатов ПЦР (как показано на видео) могу подтвердить, что вставки TDNA в интересующего гена. Когда два гена-специфических праймеров используются для усиления дикого типа ДНК, мы видим, продукт, но если TDNA прерывает его, как в этом мутант, нет продуктов и препаратов. С другой стороны, с использованием праймеров, специфичных для TDNA и ген, продукт можно увидеть только в мутанта. Мы ищем гомозиготных мутантных линий, где оба материнской и отцовской копий гена нарушается. Если одна копия гена нарушается TDNA и другие копии по-прежнему дикого типа, ПЦР результаты неоднозначны.
II. Использование газовой хроматографии для определения химического состава Cutlicle Wax.
Мы анализируем химический состав воска с помощью газовой хроматографии. Во-первых, растворимые соединения воском удаляются с поверхности растения, погружая его в хлороформ.
Затем образцы вводятся в колонке газовой хроматографии, где они будут отапливаться и отправили через на поток газа. Различные соединения придерживаться более или менее к стенкам колонны, разделяющие соединений, и они выходят одна за другой на другом конце колонны. Тогда, как соединения переходят детектором ионизации пламени, мы видим, пики. Время удержания каждого пика характерно для разных соединений, а с масс-спектрометрии, мы определили каждый из компонентов Arabidopsis воска. Основных пиков, присутствующих в том, что из С29 алканы, С29 кетона и С29 вторичного спирта. Незначительных пиков вторичных спиртов, жирных кислот, альдегидов и эфиров. Площадь под пиками, по сравнению со стандартными, говорит нам, сколько каждого соединения присутствует.
При взгляде на газ хроматограмм из этих кутикулы мутанты, то можно заметить, как cer4 не хватает первичных спиртов и сложные эфиры, в то время mah1 не хватает вторичных спиртов и кетонов. Эти фенотипы могут рассказать нам много о функции гена в растении. Например, прежде, чем мы знали, какой ген мутировал в cer4 линии, фенотип сказал нам, что существует проблема в основной ветви алкоголя биосинтеза. После молекулярной личность этого гена была изучена в Kunst лаборатории, было обнаружено, что она является частью семейства генов жирных редуктаз ацил, которая хорошо вписывается в эту химического фенотипа.
III. Использование крио-SEM для определения структуры кристаллов кутикулы
Когда мы изучаем Arabidopsis мутантов кутикулы, мы можем увидеть, если они имеют темно-зеленые, блестящие фенотип или дикого типа беловатый появление на стебле. Мы используем сканирующего электронного микроскопа, чтобы смотреть на кутикулы на поверхности растений и определить основе визуального фенотипа. Мы используем крио-SEM, замораживание растений и их просмотра при температуре жидкого азота, чтобы сохранить нетронутой кутикулы, потому SEM требует вакуум в управлении и не держа их замороженные образцы будут высыхать и коллапс.
Здесь cer4 и mah1 образцы, наряду с диким типом управления, расчленены и замороженных на пенек SEM. Когда образцы передаются в холодной стадии микроскоп, можно увидеть, что поверхность дикого типа кутикулы стволовых Arabidopsis покрыта кристаллами. Это свет, который рассеяния от тех кристаллов, что дает стволовых его беловатый вид. Вот cer4 стебля; помните это выглядело глянцевой? Ей не хватает кристаллов на поверхности.
Люди делали эксперименты, в которых они изолируют чистого соединения воск от кутикулы растений и когда они рекристаллизуются его в лаборатории, кристаллы образуют те же формы, как, которые найдены на растениях. В Arabidopsis, мы считаем, что кристаллы состоят из смеси соединений и ситуация более сложная. Например, химический анализ показывает нам, что в cer4 лишь небольшим компонентом первичных спиртов и их производных эфиров не хватает, но кристаллы на сеr4 стволовых ушли. В случае mah1, эффект мутации в том, что фермент цитохром P450 является то, что мутантных растений отсутствием двух основных компонентов воска, вторичные спирты и кетоны, но кристаллы на mah1 растения образуют нормально.
Чтобы узнать больше о Arabidopsis мутантов кутикулы перейдите к Годовой обзор биологии растений .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
