Summary
La cutícula vegetal es una cubierta cerosa externa en las plantas que tiene un papel primordial en la conservación del agua, pero también es una importante barrera contra la entrada de microorganismos patógenos. En este vídeo, se demuestra el análisis de los mutantes de la cutícula de plantas identificadas por los enfoques de la genética de avance y retroceso.
Abstract
La cutícula vegetal es una cubierta cerosa externa en las plantas que tiene un papel primordial en la conservación del agua, pero también es una importante barrera contra la entrada de microorganismos patógenos. La cutícula está formada por un polímero reticulado resistente llamada "cutina" y una capa de cera protectora que sella la superficie de la planta. La capa cerosa de la cutícula es evidente en muchas plantas, que aparece como una película brillante en la hoja de hiedra o como una capa de polvo en la superficie exterior de una uva o una hoja de col, gracias a cristales de dispersión presentes en la cera. Debido a que la cutícula es una adaptación esencial de las plantas a un medio ambiente terrestre, la comprensión de los genes implicados en la formación de la cutícula vegetal tiene aplicaciones tanto en la agricultura y la silvicultura. Hoy en día, vamos a mostrar el análisis de mutantes de la cutícula de plantas identificadas por los enfoques de la genética de avance y retroceso.
Protocol
I. pantallas visuales y retroceso métodos genéticos para identificar mutantes cutícula.
Mutantes cutícula en la planta modelo Arabidopsis thaliana se llaman "eceriferum" mutantes, lo que significa "cera que no tengan". Pueden ser en las pantallas visuales, es decir, sólo mirando a los mutantes, se puede ver que el tallo de la inflorescencia de plantas silvestres es de color blanquecino, mientras que los mutantes tienen tallos de color verde oscuro brillante. Uno de los mutantes que se aisló en este tipo de pantalla visual es éste, llamado eceriferum4 o cer4.
Otra forma de descubrir los mutantes interesantes cutícula es con un enfoque de la genética inversa: la elección de los genes candidatos de interés y el estudio de las líneas de plantas con el gen alterado. Estos mutantes han tDNA interrumpir el gen de interés, en este caso, un citocromo P450, que ahora llamamos MAH1.
Resultados de la PCR (como la que aparece en el vídeo) puede confirmar que la inserción tDNA se encuentra en el gen de interés. Cuando dos genes específicos de los cebadores se utilizan para amplificar el ADN de tipo salvaje, vemos un producto, pero si el tDNA se interrumpe, como en este mutante, no hay ningún producto allí. Por el contrario, utilizando cebadores específicos para el tDNA y genética, un producto sólo se ve en el mutante. Buscamos líneas mutantes homocigotos, donde tanto la copia materna y paterna del gen se interrumpen. Si una copia del gen es interrumpido por tDNA y la otra copia sigue siendo de tipo salvaje, los resultados de PCR se mezclan.
II. Utilizando cromatografía de gases para determinar la composición química de la cera Cutlicle.
Se analiza la composición química de la cera con la cromatografía de gases. En primer lugar, los compuestos solubles de cera se eliminan de la superficie de la planta por inmersión en cloroformo.
Luego, las muestras se inyecta en la columna de cromatografía de gases, donde se calienta y se envía a través de una corriente de gas. Diferentes compuestos palo más o menos a las paredes de la columna, la separación de los compuestos, y salen uno tras otro en el otro extremo de la columna. Entonces, como los compuestos de pasar por el detector de ionización de llama, vemos los picos. El tiempo de retención de cada pico es característico de los diferentes compuestos y, a partir de la espectrometría de masas, hemos identificado cada uno de los componentes de la cera de Arabidopsis. Los picos más importantes encontrados son los de la alcano C29, C29 de la cetona y el alcohol C29 secundaria. Los picos de menor importancia son los alcoholes secundarios, ácidos grasos, aldehídos y ésteres. El área bajo los picos, en relación a la norma, nos dice qué cantidad de cada compuesto está presente.
Al mirar los cromatogramas de gases de estos mutantes la cutícula, se puede observar cómo cer4 carece de los alcoholes primarios y ésteres, mientras que mah1 carece de alcoholes secundarios y cetonas. Estos fenotipos pueden decirnos mucho acerca de la función del gen de interés en la planta. Por ejemplo, antes de saber qué gen se encuentra mutado en la línea de cer4, el fenotipo nos dijo que había un problema en la rama de alcohol primario de la ruta biosintética. Después de la identidad molecular de ese gen se ha estudiado en el laboratorio Kunst, se descubrió que es parte de una familia de genes de reductasas acilo graso, que encaja muy bien con este fenotipo química.
III. Utilizando Cryo-SEM para determinar la estructura de los cristales de la cutícula
Cuando estudiamos los mutantes de Arabidopsis cutícula, podemos ver si tienen el fenotipo verde oscuro, brillante o la apariencia blanquecina de tipo salvaje en el tallo. Usamos el microscopio electrónico de barrido para ver la cutícula en la superficie de la planta e identificar la base del fenotipo visual. Usamos la crio-SEM, la congelación de las plantas y ver a temperatura de nitrógeno líquido para mantener la cutícula intacta porque el SEM requiere un vacío de operar y sin mantenerlos congelados, las muestras se secan y el colapso.
Aquí cer4 y mah1 muestras, junto con los controles de tipo salvaje, se disecan y se congela en el talón de SEM. Cuando las muestras se transfieren a la fría platina del microscopio, se puede ver que la superficie de la cutícula de Arabidopsis de tipo salvaje tallo está cubierto de cristales. Es la luz que es la dispersión de los cristales que da a la madre de su aspecto blanquecino. Aquí está la madre cer4, recuerda que parecía brillante? Carece de los cristales en la superficie.
La gente ha hecho experimentos en los que aislar un compuesto de cera pura de la cutícula de la planta y cuando lo recristalizar en el laboratorio, los cristales se forman las mismas formas que las que se encuentran en las plantas. En Arabidopsis, creemos que los cristales se componen de una mezcla de compuestos y la situación es más complicada. Por ejemplo, el análisis químico nos muestra que en cer4, sólo el componente de menor importancia de los alcoholes primarios y sus ésteres derivados han desaparecido, sin embargo, los cristales de la cer4 madre se ha ido. En el caso de mah1, el efecto de la mutación en la enzima citocromo P450 es que las plantas mutantes falta dos componentes principales de la cera, alcoholes secundarios y cetonas, sin embargo, los cristales en las plantas mah1 forma normal.
Para obtener más información acerca de los mutantes de Arabidopsis cutícula por favor vaya a revisión anual de Biología Vegetal .
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