Summary
Bitki manikür, suyun korunması birincil bir rol vardır ancak bitkiler üzerindeki patojen mikroorganizma girişine karşı önemli bir bariyer bir balmumu dış kaplama. Bu video, ileri ve geri genetik yaklaşımlar tarafından belirlenen bitki manikür mutant analizi göstermektedir.
Abstract
Bitki manikür su korunması birincil bir rolü vardır bitkiler üzerinde mumsu dış kaplama, ama aynı zamanda patojen mikroorganizma girişine karşı önemli bir bariyer. Kütikül "kütin" olarak adlandırılan sert bir çapraz bağlı polimer ve mühürler bitki yüzeyinde koruyucu bir balmumu tabakası oluşur. Manikür mumsu tabaka, sarmaşık yaprağı parlak bir film ya da bir üzüm veya lahana yaprağı sayesinde, balmumu saçılma kristalleri ışık yüzeyi tozlu bir dış kaplama olarak görünen birçok bitki açıktır. Manikür anlayış, karasal ortamda bitkilerin önemli bir uyum olduğundan bitki manikür oluşumunda yer alan genler hem de tarım ve ormancılık uygulamaları vardır. Bugün, ileri ve geri genetik yaklaşımlar tarafından belirlenen bitki manikür mutantların analizi göstereceğiz.
Protocol
I. Görsel ekranlar ve Ters Genetik Yaklaşımlar Tırnak Mutants belirlenmesi.
Model bitki Arabidopsis thaliana Tırnak mutantlar "ibaresi yer almayacak balmumu" anlamına gelen "eceriferum" mutant denir. Görsel ekranlar olabilir, yani sadece mutant bakarak, mutantlar, koyu yeşil parlak kaynaklanıyor ise yabani tip bitkilerin çiçeklenme kök beyazımsı olduğunu görebilirsiniz. Bu tür görsel ekran izole edildi mutantlar biri, bu bir eceriferum4 veya cer4 denilen.
Ilginç manikür mutantlar keşfetmenin bir başka yolu, ters bir genetik yaklaşım ile ilgi seçiminde aday genler ve daha sonra bu gen ile eğitim tesisi hatları bozulur. Bu mutantlar TDNA şimdi MAH1 dediğimiz, bu durumda, bir sitokrom P450 ilgi gen kesintiye var.
PCR sonuçları (videoda gösterildiği gibi) TDNA ekleme ilgi gen olduğunu teyit edebiliriz. Iki gen-spesifik primerler yabanıl tip DNA yükseltmek için kullanıldığında, bir ürün, ama TDNA kesmeleri durumunda, bu mutant gibi, orada herhangi bir ürün yoktur. Tersine, TDNA ve gen için spesifik primerler kullanılarak, bir ürünün sadece mutant görülür. Biz anne ve baba kopya genin bozulmuş olan homozigot mutant hatları, bak. Geninin bir kopyasını TDNA tarafından bozulur ve diğer kopya hala yabani tip ise, PCR sonuçları karıştırılır.
II. Kimyasal Bileşimi Cutlicle Wax belirleme Gaz Kromatografisi kullanma.
Biz, gaz kromatografisi kullanılarak mum kimyasal bileşimi analiz eder. İlk olarak, çözünür balmumu bileşikleri kloroform daldırma bitki yüzeyinden kaldırılır.
Sonra, ısıtmalı ve gaz akışı üzerinden gönderilen olacak örnekleri gaz kromatografi kolonunun içine enjekte edilir. Farklı bileşikler, bileşiklerin ayrılması, sütun duvarlara daha az ya da sopa ve sütunun diğer ucundaki diğer ardına çıkıyor. Bileşikleri alev iyonizasyon dedektörü üzerinden geçerken, biz doruklarına bakın. Her tepe alıkonma zamanı farklı bileşikler için karakteristik olan, kütle spektrometresi, Arabidopsis balmumu bileşenleri her belirledik. Ana zirve mevcut C29 Alkan, keton C29 ve C29 ikincil alkol. Küçük doruklarına ikincil alkoller, yağ asitleri, aldehitler ve esterler. Standardına göre doruklarına altında kalan alan, her bileşiğin ne kadar mevcut söyler.
Bu manikür mutantlar gaz kromatogramlar bakarken, bir mah1 ikincil alkoller ve ketonlar yoksun cer4, birincil alkoller ve esterler yoksun nasıl fark edebilirsiniz. Bu fenotipleri bize ilgi bitki gen fonksiyonu hakkında çok şey söyleyebilir. Örneğin, biz cer4 doğrultusunda hangi genin mutasyona uğramış tanımadan önce, fenotip biyosentetik birincil alkol dalında bir sorun olduğunu anlattı. Bu gen moleküler kimliği Kunst laboratuarında incelenmiştir sonra, bu kimyasal fenotip ile iyi uyum sağlar, yağ açil redüktazlar bir gen ailesinin bir parçası olduğunu keşfetti.
III. Tırnak Kristalleri Yapısı belirleme Cryo-SEM
Koyu yeşil, parlak bir fenotip veya kök yabani tip beyazımsı bir görünüm varsa, Arabidopsis manikür mutantlar çalışmada, biz görebilirsiniz. Biz bitkinin yüzeyinde manikür bakmak ve görsel fenotip temelinde tanımlamak için taramalı elektron mikroskobu kullanın. SEM çalışması için bir vakum gerektirir ve onları donmuş tutmak olmadan numunelerin kuru ve çökeceğini çünkü manikür sağlam tutmak için bitkilerin donma ve sıvı azot sıcaklığında görüntülemek cryo-SEM kullanın.
Cer4 ve mah1 örnekleri, yabani tip kontrolleri ile birlikte disseke ve SEM saplama donmuş. Örnekleri mikroskop soğuk sahne aktarıldığında, yabani tip Arabidopsis kök manikür yüzeyinde kristalleri ile kaplı olduğunu görebilirsiniz. Kök beyazımsı bir görünüm veren bu kristaller kapalı saçılma ışığıdır. Burada cer4 kök; parlak görünüyordu hatırlıyor? Yüzeyde kristaller yoksundur.
Bir bitkinin manikür saf balmumu bileşik izole etmek ve laboratuvarda recrystallize, kristaller, bitkiler üzerinde bulunanlara aynı şekiller oluşturmak İnsanlar deneyler yaptık. Arabidopsis, bileşiklerin bir karışımından oluşan kristaller ve durumun daha karmaşık olduğunu düşünüyorum. Örneğin, kimyasal analiz cer4, birincil alkoller ve bunların türev esterleri sadece küçük bir bileşenin eksik olduğunu bize gösteriyor, ama ce kristallerr4 kök gitti. Mah1 durumunda, bu sitokrom P450 enzim mutasyon etkisi mutant bitkiler, mum, ikincil alkoller ve ketonlar iki temel bileşeni eksikliği, henüz mah1 bitkilerin kristalleri normalde formu.
Arabidopsis manikür mutantlar hakkında daha fazla bilgi edinmek için lütfen gidin Bitki Biyoloji Yıllık Gözden Geçirme .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
