Summary
La cuticola pianta è un rivestimento ceroso esterno sulle piante che ha un ruolo primario nella conservazione dell'acqua, ma è anche un importante barriera contro l'ingresso di microrganismi patogeni. In questo video, si dimostra l'analisi dei mutanti cuticola piante identificate da marcia avanti e retromarcia approcci genetica.
Abstract
La cuticola pianta è un rivestimento ceroso esterno sulle piante che ha un ruolo primario nella conservazione dell'acqua, ma è anche un importante barriera contro l'ingresso di microrganismi patogeni. La cuticola è costituita da un polimero duro reticolato chiamato "cutina" e uno strato di cera protettiva che sigilla la superficie della pianta. Lo strato ceroso della cuticola è evidente in molte piante, che appare come una pellicola lucida sulla foglia di edera o come rivestimento polveroso esterno sulla superficie di un chicco d'uva o una foglia di cavolo, grazie alla luce cristalli di scattering presenti nella cera. Perché la cuticola è un adattamento essenziale di piante ad un ambiente terrestre, la comprensione dei geni coinvolti nella formazione vegetale cuticola ha applicazioni in agricoltura e silvicoltura. Oggi, ci mostrano l'analisi dei mutanti cuticola piante identificate da marcia avanti e retromarcia approcci genetica.
Protocol
I. schermi visivi e Reverse Approcci genetici per identificare Mutanti cuticola.
Mutanti cuticola nel modello vegetale Arabidopsis thaliana sono chiamati "eceriferum" mutanti, che significa "cera non cuscinetto". Possono essere a schermi visivi, cioè, solo guardando il mutante, si può vedere che il gambo infiorescenze di piante wild-type è biancastra, mentre i mutanti hanno steli lucido verde scuro. Uno dei mutanti che è stato isolato in questo tipo di schermo visivo è questo, chiamato eceriferum4 o cer4.
Un altro modo di scoprire mutanti cuticola è interessante con un approccio inverso genetica: geni candidati scegliendo di interesse e quindi le linee dell'impianto studiando con quel gene interrotto. Questi mutanti hanno TDNA interrompere il gene di interesse, in questo caso, un citocromo P450 che oggi chiamiamo MAH1.
Risultati della PCR (come quello mostrato nel video) in grado di confermare che l'inserimento TDNA è nel gene di interesse. Quando due geni specifici primer sono utilizzati per amplificare DNA wild-type, vediamo un prodotto, ma se il TDNA interrompe, come in questo mutante, non vi è nessun prodotto lì. Al contrario, utilizzando primer specifici per il TDNA e gene, un prodotto è visto solo nel mutante. Siamo alla ricerca di linee omozigoti mutanti, dove sono interrotte sia la copia materna e paterna del gene. Se una copia del gene è interrotto da TDNA e l'altra copia è ancora wild-type, i risultati della PCR sono mescolati.
II. Mediante gascromatografia per determinare la composizione chimica della cera Cutlicle.
Analizziamo la composizione chimica della cera mediante gascromatografia. In primo luogo, i composti solubili in cera vengono rimossi dalla superficie della pianta per immersione nel cloroformio.
Poi, i campioni sono iniettati nella colonna gascromatografica, dove saranno riscaldati e inviati attraverso un flusso di gas. Composti diversi bastone più o meno alle pareti della colonna, che separa i composti, e vengono fuori uno dopo l'altro all'altra estremità della colonna. Poi, come i composti passano sopra il rivelatore a ionizzazione di fiamma, vediamo le cime. Il tempo di ritenzione dei picchi è caratteristico per i composti diversi, dalla spettrometria di massa, abbiamo identificato ciascuno dei componenti di cera Arabidopsis. Le cime più importanti presenti sono quella del C29 alcano, la C29 e la C29 chetone alcol secondario. Le cime minori sono gli alcoli secondari, acidi grassi, aldeidi ed esteri. L'area sotto i picchi, rispetto alla standard, ci dice quanto di ogni composto è presente.
Se si guarda alla cromatogrammi gas da questi mutanti cuticola, si può notare come cer4 manca la alcoli primari ed esteri, mentre mah1 manca di alcoli secondari e chetoni. Questi fenotipi possono dirci molto sulla funzione del gene di interesse nella pianta. Per esempio, prima di sapere quale gene è mutato nella linea cer4, il fenotipo ci ha detto che c'era un problema nel settore alcol primario della via biosintetica. Accertata l'identità molecolare di quel gene è stato studiato in laboratorio Kunst, si è scoperto che è parte di una famiglia di geni di riduttasi acil grassi, che si adatta bene con questo fenotipo chimici.
III. Utilizzando Cryo-SEM per determinare la struttura dei cristalli Cuticle
Quando studiamo la cuticola mutanti di Arabidopsis, possiamo vedere se hanno il verde scuro, lucida o fenotipo wild-type aspetto biancastro sul gambo. Noi usiamo il microscopio elettronico a scansione a guardare la cuticola sulla superficie della pianta e di individuare la base del fenotipo visiva. Noi usiamo crio-SEM, il congelamento delle piante e la visualizzazione a temperatura dell'azoto liquido per mantenere la cuticola intatta perché la SEM richiede un vuoto da utilizzare e senza tenerli congelati, i campioni si asciugano e collasso.
Qui cer4 e mah1 campioni, insieme con la wild-type di controllo, vengono sezionati e congelato sulla matrice SEM. Quando i campioni vengono trasferiti al freddo fase del microscopio, si può vedere che la superficie del wild-type cuticola Arabidopsis stelo è ricoperto di cristalli. E 'la luce che è scattering quei cristalli che dà il tronco il suo aspetto biancastro. Ecco il gambo cer4; ricordare sembrava lucido? Manca i cristalli sulla superficie.
La gente ha fatto esperimenti in cui isolare un composto pura cera dalla cuticola di una pianta e quando lo ricristallizzare in laboratorio, i cristalli di ottenere i profili identici a quelli presenti sulle piante. In Arabidopsis, crediamo che i cristalli sono costituiti da una miscela di composti e la situazione è più complicata. Per esempio, l'analisi chimica ci mostra che in cer4, solo la componente minore di alcoli primari e loro esteri derivati sono mancanti, ma i cristalli del cer4 staminali sono andati. Nel caso di mah1, l'effetto della mutazione in quella degli enzimi del citocromo P450 è che le piante mutanti mancano due componenti principali del, cera alcoli secondari e chetoni, ma i cristalli sulla mah1 piante modulo normalmente.
Per saperne di più su mutanti di Arabidopsis cuticola vai alla Annual Review di Biologia Vegetale .
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