Summary
Die Kutikula ist eine wachsartige Außenhaut auf Pflanzen, die eine primäre Rolle in Wasserschutzgebieten hat aber auch eine wichtige Barriere gegen das Eindringen von pathogenen Mikroorganismen. In diesem Video zeigen wir die Analyse der Kutikula-Mutanten durch Forward-und Reverse Genetik Ansätze identifiziert.
Abstract
Die Kutikula ist eine wachsartige Außenhaut auf Pflanzen, die eine primäre Rolle in Wasserschutzgebieten hat, ist aber auch eine wichtige Barriere gegen das Eindringen von pathogenen Mikroorganismen. Die Kutikula besteht aus einem harten vernetzten Polymer namens "Cutin" und einer schützenden Wachsschicht, die Dichtungen der Anlage Oberfläche. Die Wachsschicht der Cuticula ist offensichtlich bei vielen Pflanzen, erscheint als glänzender Film auf der Efeublatt oder als eine staubige äußere Hülle auf der Oberfläche von einer Traube oder ein Kohlblatt dank Streuung Kristalle im Wachs Licht. Da die Kutikula ist eine wesentliche Anpassung der Anlagen an eine terrestrische Umwelt, das Verständnis der Gene in Kutikula-Bildung beteiligt hat Anwendungen in Land-und Forstwirtschaft. Heute zeigen wir die Analyse der Kutikula-Mutanten durch Forward-und Reverse Genetik Ansätze identifiziert.
Protocol
I. Visuelle Screens und genetische Ansätze zur Identifizierung Cuticle Mutanten.
Cuticle Mutanten in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana werden als "eceriferum" Mutanten, was bedeutet, "die nicht mit Wachs". Sie können in Sichtschutz sein, das heißt, indem man sich einfach die Mutante, können Sie sehen, dass der Blütenstand Stamm von Wildtyp-Pflanzen weißlich wird, während die Mutanten dunkelgrün glänzende Stängel haben. Einer der Mutanten, die in dieser Art von Sichtschutz isoliert wurde, ist dieser, als eceriferum4 oder cer4.
Eine weitere Möglichkeit der Entdeckung interessanter Nagelhaut Mutanten ist mit einem reversen Genetik Ansatz: Auswahl Kandidatengene von Interesse und dann studieren Anlage Zeilen mit, dass Gen unterbrochen. Diese Mutanten haben tDNA Störung des Gens von Interesse, in diesem Fall ein Cytochrom P450, dass wir heute MAH1.
PCR-Ergebnisse (wie in dem Video zu sehen) kann bestätigen, dass die tDNA Insertion in das Gen von Interesse ist. Wenn zwei Gen-spezifische Primer verwendet werden, um Wildtyp-DNA verstärken, sehen wir ein Produkt, aber wenn die tDNA unterbricht sie, wie in dieser Mutante, gibt es kein Produkt gibt. Umgekehrt unter Verwendung von Primern spezifisch für die tDNA und Gen ist ein Produkt nur in der Mutante zu sehen. Wir suchen homozygot mutierten Linien, bei denen sowohl die mütterlichen und väterlichen Kopien des Gens gestört sind. Wenn eine Kopie des Gens durch tDNA gestört ist und die andere Kopie ist immer noch wild-type, werden die PCR-Ergebnisse gemischt.
II. Mittels Gaschromatographie auf die chemische Zusammensetzung der Cutlicle Wax Bestimmen.
Wir analysieren die chemische Zusammensetzung des Wachses mit Hilfe der Gaschromatographie. Zunächst werden die löslichen Wachsverbindungen aus der Anlage Oberfläche durch Eintauchen in Chloroform entfernt.
Dann werden die Proben in die Gas-Chromatographie-Säule injiziert, wo sie erhitzt und geschickt durch auf einem Gasstrom. Verschiedene Verbindungen stick mehr oder weniger an den Wänden der Säule, die Trennung der Verbindungen, und sie kommen aus einer nach dem anderen am anderen Ende der Spalte. Dann, als die Verbindungen über den Flammenionisationsdetektor passieren, sehen wir die Gipfel. Die Verweildauer der einzelnen Peaks ist charakteristisch für die verschiedenen Verbindungen und von Massenspektrometrie, haben wir jede der Komponenten von Arabidopsis Wachs identifiziert. Die wichtigsten Peaks vorhanden sind, dass der C29-Alkan, das C29-Keton und die C29 sekundärer Alkohol. Der kleinere Gipfel sind die sekundären Alkohole, Fettsäuren, Aldehyde und Ester. Die Fläche unter den Peaks, bezogen auf Standard, erzählt uns, wie viel von jeder Verbindung vorhanden ist.
Bei der Betrachtung Gaschromatogramme von diesen Nagelhaut Mutanten, kann man feststellen, wie cer4 die primären Alkohole und Ester fehlt, während MAH1 fehlt sekundäre Alkohole und Ketone. Diese Phänotypen können uns viel über die Funktion des Gens von Interesse in der Anlage. Zum Beispiel, bevor wir wussten, welche Gen wurde in die cer4 Linie mutiert, sagte der Phänotyp uns, dass es ein Problem in der primären Alkohol Zweig der Biosyntheseweg. Nach der molekularen Identität des Gens in der Kunst-Labor untersucht wurde, wurde festgestellt, dass es Teil einer Genfamilie von Fettacyl Reduktasen, die gut mit dieser chemischen Phänotyp ist.
III. Mit Cryo-SEM, um die Struktur der Kutikula Kristalle bestimmen
Wenn wir das Arabidopsis-Mutanten Nagelhaut studieren, können wir sehen, ob sie den dunkelgrünen, glänzenden Phänotyp oder der Wildtyp-weißliches Aussehen auf dem Vorbau zu haben. Wir verwenden das Rasterelektronenmikroskop an der Kutikula auf der Oberfläche der Pflanze suchen und identifizieren anhand der visuellen Phänotyp. Wir verwenden Kryo-SEM, das Einfrieren der Pflanzen und betrachten bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs in Ordnung zu halten die Schuppenschicht intakt, weil die SEM erfordert ein Vakuum zu bedienen und ohne halten sie gefroren, die Proben würden austrocknen und zerfallen.
Hier cer4 und MAH1 Proben, zusammen mit dem Wildtyp-Kontrollen sind präpariert und eingefroren auf dem SEM Stummel. Als die Proben zu den kalten Stufen des Mikroskops übertragen werden, können Sie sehen, dass die Oberfläche des Wildtyp-Arabidopsis Stammzellen Nagelhaut mit Kristallen bedeckt ist. Es ist das Licht, Streuung an ist die Kristalle, die die Stammzellen gibt seinen weißliches Aussehen. Hier ist die cer4 Stammzellen; erinnern sah es glänzend? Es fehlt die Kristalle auf der Oberfläche.
Die Menschen haben Experimente gemacht, wo sie ein reines Wachs Verbindung aus der Kutikula einer Pflanze und zu isolieren, wenn sie es rekristallisieren im Labor bilden die Kristalle die gleiche Form wie die auf den Pflanzen gefunden. In Arabidopsis, glauben wir, dass die Kristalle bestehen aus einer Mischung von Verbindungen hergestellt und die Situation ist komplizierter. Zum Beispiel zeigt die chemische Analyse uns, dass in cer4, nur die kleinere Komponente des primären Alkohole und ihre Derivate Ester fehlen, doch die Kristalle auf der cer4 Stammzellen sind weg. Im Falle von MAH1, ist der Effekt der Mutation in das Cytochrom-P450-Enzym, das die mutierte Pflanzen zwei Hauptkomponenten des Wachses, sekundäre Alkohole und Ketone Mangel, doch die Kristalle auf der MAH1 Pflanzen bilden in der Regel.
Wenn Sie mehr über Arabidopsis-Mutanten Kutikula finden Sie unter Annual Review of Plant Biology .
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