Summary
De plant cuticula is een wasachtige buitenste laag met planten die een primaire rol in het waterbeheer heeft, maar is ook een belangrijke barrière tegen het binnendringen van pathogene micro-organismen. In deze video, tonen we de analyse van de plant cuticula mutanten geïdentificeerd door vooruit en reverse genetics benaderingen.
Abstract
De plant cuticula is een wasachtige buitenste laag met planten die een primaire rol in het waterbeheer heeft, maar is ook een belangrijke barrière tegen het binnendringen van pathogene micro-organismen. De cuticula is opgebouwd uit een taaie verknoopt polymeer genaamd "cutine" en een beschermende waslaag dat de zeehonden de plant oppervlak. De wasachtige laag van de cuticula is duidelijk op veel planten, die als een glanzende film op de klimop blad of als een stoffige buitenbekleding op het oppervlak van een druif of een koolblad dankzij verstrooiing kristallen aanwezig zijn in de was licht. Omdat de cuticula is een essentiële aanpassing van de planten aan een terrestrische milieu, het begrijpen van de genen die betrokken zijn in de fabriek cuticula formatie heeft toepassingen in zowel de land-en bosbouw. Vandaag laten we de analyse van de plant cuticula mutanten geïdentificeerd door vooruit en reverse genetics benaderingen.
Protocol
I. Visual Schermen en Reverse genetische benaderingen te Cuticle Mutanten identificeren.
Cuticula mutanten in de modelplant Arabidopsis thaliana worden "eceriferum" mutanten, wat betekent "niet voorzien was". Ze kunnen worden in de visuele schermen, dat wil zeggen, alleen maar door te kijken naar de mutant, kun je zien dat de bloeiwijze stam van de wild-type planten wittig is, terwijl de mutanten zijn donkergroen glanzend stengels. Een van de mutanten die werd geïsoleerd in dit soort visuele scherm is dit een, genaamd eceriferum4 of cer4.
Een andere manier om te ontdekken interessante cuticula mutanten is met een reverse genetics aanpak: het kiezen van de kandidaat-genen van belang en dan het bestuderen van planten lijnen met dat gen verstoord. Deze mutanten hebben TDNA het verstoren van de gen van belang, in dit geval, een cytochroom P450 die we nu MAH1 noemen.
PCR-resultaten (zoals weergegeven in de video) kan bevestigen dat de TDNA toevoeging is in het gen van belang. Wanneer twee gen-specifieke primers worden gebruikt om wild-type DNA te amplificeren, zien we een product, maar als de TDNA onderbreekt het, zoals in deze mutant, is er geen product daar. Omgekeerd, met behulp van primers die specifiek zijn voor de TDNA en gen, is een product alleen gezien in de mutant. We zoeken naar homozygoot mutant lijnen, waarbij zowel de moederlijke en vaderlijke kopieën van het gen worden verstoord. Als een kopie van het gen wordt verstoord door TDNA en het andere exemplaar is nog steeds wild-type, worden de PCR-resultaten gemengd.
II. Met behulp van gaschromatografie om de chemische samenstelling van Cutlicle Wax bepalen.
We analyseren de chemische samenstelling van de was met behulp van gaschromatografie. Eerst worden de oplosbare verbindingen wax verwijderd van de plant oppervlak door dompelen in chloroform.
Vervolgens worden monsters geïnjecteerd in het gas chromatografie kolom, waar ze zullen worden verwarmd en verzonden via een stroom van gas. Verschillende verbindingen stok meer of minder aan de wanden van de kolom, het scheiden van de verbindingen, en ze komen uit een na de ander aan de andere kant van de kolom. Dan, als de verbindingen passeren van de vlam ionisatie detector, zien we de toppen. De retentietijd van elke piek is kenmerkend voor de verschillende verbindingen en van massaspectrometrie, we hebben geïdentificeerd elk van de componenten van Arabidopsis was. De belangrijkste pieken aanwezig zijn die van de C29 alkaan, de C29 keton en de C29 secundaire alcohol. De kleine pieken zijn de secundaire alcoholen, vetzuren, aldehyden en esters. De oppervlakte onder de pieken, ten opzichte van de standaard, vertelt ons hoeveel van elke verbinding aanwezig is.
Wanneer we kijken naar gas chromatogrammen van deze cuticula mutanten, kan men zien hoe cer4 de primaire alcoholen en esters ontbreekt, terwijl mah1 mist secundaire alcoholen en ketonen. Deze fenotypes kunnen vertellen ons veel over de functie van het gen van belang in de plant. Bijvoorbeeld, voor we het wisten welk gen gemuteerd was in de cer4 lijn, het fenotype vertelde ons dat er een probleem was in de primaire alcohol tak van de biosynthese. Na de moleculaire identiteit van dat gen werd bestudeerd in de Kunst lab, werd ontdekt dat het deel uitmaakt van een gen familie van vette acyl reductases, die goed past bij deze chemische stof fenotype.
III. Met behulp van Cryo-SEM om de structuur van Cuticle kristallen te bepalen
Als we de Arabidopsis mutanten cuticula bestuderen, kunnen we zien of ze hebben de donkergroene, glanzende fenotype of het wild-type witte verschijning op de stam. We gebruiken de scanning electronen microscoop om op de cuticula kijken op het oppervlak van de plant en de basis van de visuele fenotype te identificeren. We maken gebruik van cryo-SEM, het bevriezen van de planten en ze te bekijken temperatuur van vloeibare stikstof in stand te houden van de cuticula intact, omdat de SEM vereist een vacuüm te bedienen en zonder te houden bevroren, de monsters zou uitdrogen en instorten.
Hier cer4 en mah1 monsters, samen met het wild-type controles, worden ontleed en bevroren op de SEM stub. Wanneer de monsters worden overgebracht naar de koude-fase van de microscoop, kun je zien dat het oppervlak van de wild-type Arabidopsis stam cuticula is bedekt met kristallen. Het is het licht dat verstrooiing uit de kristallen die geeft de stam zijn witachtig uiterlijk. Hier is de cer4 stam; herinneren glossy gekeken? Het ontbreekt de kristallen op het oppervlak.
Mensen hebben gedaan experimenten waar ze isoleren een pure wax verbinding uit de cuticula van een plant en wanneer ze het recrystallize in het lab, de kristallen vormen de dezelfde vormen als die gevonden worden op de planten. In Arabidopsis, geloven wij dat de kristallen zijn opgebouwd uit een mengsel van verbindingen en de situatie is ingewikkelder. Bijvoorbeeld, de chemische analyse laat zien dat in cer4, alleen de kleinere bestanddelen van primaire alcoholen en de daarvan afgeleide esters ontbreken, maar de kristallen op de cer4 stengel zijn verdwenen. In het geval van mah1, het effect van de mutatie in dat de cytochroom P450 enzym is dat de mutant planten twee belangrijke componenten van de was, secundaire alcoholen en ketonen ontbreekt, maar de kristallen op de mah1 planten vormen normaal.
Voor meer informatie over Arabidopsis mutanten cuticula ga naar Annual Review of Plant Biology .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
